CN109187157A - 一种检测大米中无机镉含量的待测液的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测大米中无机镉含量的待测液的制备方法，该制备方法包括：将大米粉碎后获得米粉，将米粉与三氟乙酸溶液混合提取无机镉，离心后得到上清液，即为待测液。本发明综合考虑提取液中镉含量和蛋白质得率，在保证有机镉结构不被破坏的同时，检测无机镉含量，为制定大米中镉限量国家标准及镉污染稻米合理利用提供技术支撑。

Description

一种检测大米中无机镉含量的待测液的制备方法
技术领域
本发明属于食品污染物监测领域，更具体地，涉及一种检测大米中无机镉含量的待测液的制备方法。
背景技术
镉(Cadmium,Cd)在食品中主要以游离(Free)和结合(Bonding)二种形态存在。游离态的镉可通过血液循环到达组织器官，易与超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)等抗氧化酶的巯基结合，产生氧化损伤作用导致肝、肾、肺等产生病理学损伤。
有机镉通过镉与蛋白质或多肽中的含硫氨基酸、极性氨基酸和芳香族氨基酸结合形成，主要有金属硫蛋白(Metallothionein,MT)、植物螯合肽(Phytochelatins,PC)等，其中镉金属硫蛋白(Cadmium-Metallothionein,Cd-MT)是有机镉的主要存在形态之一，毒性远小于无机镉。MT与Cd等重金属离子结合能减少其对组织的损害，具有解毒、调节机体抗氧化功能的作用，是影响Cd毒性作用的重要因素之一。因此检测食品中的无机镉具有重要意义。
稻米是我国人民主要的粮食品种之一，全国60％以上的人口以稻米为主食。依据现行的食品中污染物限量标准(GB2762-2012)，我国每年被判定为重金属(镉、砷、铅、铬)污染的粮食达1200万吨。由于有机镉与无机镉对人体毒性的差异，仅以总镉含量评价大米中的镉是否超过国家标准、能否食用显然不够准确。因此，迫切需要建立大米中无机镉含量的检测方法。申请人经长期研究发现，稻谷中有机镉主要是镉与稻米中的蛋白质结合，根据结合情况不同，可分为镉硫蛋白和非镉硫蛋白。非镉硫蛋白中镉与极性氨基酸、芳香族氨基酸或疏水性氨基酸结合，结构不稳定，在机体胃肠道中易被破坏，转化成无机镉从而危害人体健康。现有检测大米中镉的方法仅考虑总镉含量，没有区分有机镉和无机镉，因此建立一种检测大米中无机镉含量的待测液的制备方法非常迫切。
发明内容
本发明的目的在于解决上述问题，综合考虑待测液中镉含量和蛋白质得率，在保证有机镉结构不被破坏的同时，检测无机镉含量，为制定大米中镉限量国家标准及镉污染稻米合理利用提供技术支撑。
申请人采用多种方法分离纯化大米镉结合蛋白，探讨镉结合蛋白的形成机理。碱法提取、热变性和乙醇沉淀实现了镉结合蛋白的富集，可以作为提取、分离大米镉结合蛋白的一种方法。参考Osborne分级分离蛋白的方法对稻米中清蛋白(Albumin)、球蛋白(Globulin)、醇溶蛋白(Prolamin)和谷蛋白(Glutelin)进行了顺序提取。通过对镉含量的分析发现，这四种蛋白质结合镉的能力差异明显，清蛋白中镉含量最高，其次是醇溶蛋白和球蛋白，谷蛋白中镉含量最低。清蛋白(Albumin)、球蛋白(Globulin)、醇溶蛋白(Prolamin)和谷蛋白(Glutelin)在稻米籽粒中的分布是不均匀的。清蛋白和球蛋白主要集中于糊粉层和胚中，在稻米胚乳外层含量最高，越向中心含量越低；谷蛋白的分布规律是中心部分含量很高，越向外层含量越低。这四种蛋白质在稻米籽粒中的含量也不同，其中清蛋白含量为4.2-15.9％，平均为12％；球蛋白含量为9.4-17.8％，平均为13.2％；谷蛋白含量为64.7-84.7％，平均为71.7％；醇溶蛋白很少，小于5％。清蛋白结合镉的能力强，谷蛋白含量超过另外三种蛋白质(清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白)的总和，清蛋白和谷蛋白均可溶于酸性溶液。
基于上述发现，完成了本发明。
为了实现上述目的，本发明提供一种检测大米中无机镉含量的待测液的制备方法，该制备方法包括：
将大米粉碎后获得米粉，将米粉与三氟乙酸溶液混合提取无机镉，离心后得到上清液，即为待测液。
作为本发明优选的实施方式，所述米粉的粒径≤180μm，即≤80目，更优选为125-180μm，即80～120目，最优选为150-180μm，即100～120目。粒径过大时，提取溶液不能充分渗透米粉内部，降低了提取效率；粒径较小时，可能使淀粉粒破碎，超声条件下淀粉更易糊化。另外，过小的粒径使大米粉表面电性增大，颗粒间范德华引力等增加，大米粉易发生团聚，溶解度降低，降低提取效率。
作为本发明优选的实施方式，相对于1g米粉，三氟乙酸溶液的用量为15-25mL，更优选为20-25mL。
作为本发明优选的实施方式，三氟乙酸溶液的浓度为0.5～2.0％，更优选为1.5-2.0％。
作为本发明优选的实施方式，采用超声波辅助提取无机镉。
作为本发明优选的实施方式，超声波的频率为20KHz和/或45KHz。
作为本发明优选的实施方式，提取时间为30～120min，更优选为30～60min；提取的温度为25～35℃。
作为本发明优选的实施方式，提取时每10～20min混匀一次。
根据本发明，混匀可采用本领域技术人员常规采用的方式，作为本发明优选的实施方式，混匀的方式为涡旋混匀。涡旋混匀可使米粉与提取液充分混合，虽磁力搅拌也可达到充分混合的效果，但是磁力珠需要稀硝酸浸泡过夜，增加了工作量，涡旋混匀操作相对简单。
作为本发明优选的实施方式，离心的转速为6000～10000r/min，离心的时间为12～18min。
根据本发明，所述大米由稻谷去除砂砾等杂质，砻谷后剔除未脱壳粒、发霉米、异色米、粉质率高的大米后得到。稻谷的品种包括但不限于籼稻、粳稻和糯稻。
根据本发明，得到检测大米中无机镉含量的待测液后，镉含量的测定参照国标《食品中镉的测定》(GB 5009.15-2014)，也可采用ICP-MS等其他方法测定镉含量；采用考马斯亮蓝法测定待测液中的蛋白质得率。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1)本发明建立了一种无机镉含量检测的预处理方法。
2)采用三氟乙酸作为提取剂。三氟乙酸是一种强而非氧化性的酸，化学性质稳定，在水中几乎全部溶解并解离。三氟乙酸常作为保护剂来保护氨基和羟基，与蛋白质形成非常强的离子对(三氟乙酸-蛋白质)阻止蛋白质的电离，在无机镉的提取过程中，可以避免与蛋白质结合的镉转化为无机镉，影响试验结果。
3)采用超声波辅助提取。超声波促进了稻米淀粉粒溶胀、蛋白质解聚，使稻米中结构紧密的淀粉-蛋白质聚集体(Protein-Starch Aggregates)变得松散，加速稻米淀粉粒间的无机镉和蛋白质溶出，稻米中的无机镉更容易进入三氟乙酸溶液，缩短了体系达到平衡的时间，提高了无机镉的得率。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。
本发明实施例中，采用的碾米机为JNM-Ⅲ型碾米机(中储粮成都粮食储藏科学研究所，成都施特威科技发展公司)；采用的三氟乙酸为优级纯(GR)，购于西亚试剂有限公司；采用的超声波辅助提取设备为SB-3200DTS超声波双频清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；采用的镉含量测定设备为900T火焰/石墨炉原子吸收光谱仪(美国PerkinElmer)。
本发明实施例中，采用超声波辅助提取则离心管内的液面应该低于超声浴的液面，控制超声浴的温度在25-35℃
实施例1
(1)糙米制备：称取稻谷500-1000g，去除砂砾等杂质，砻谷后剔除未脱壳粒、发霉米、异色米、粉质率高的大米。
(2)米粉制备：称取16g糙米，用碾米机碾磨40s，然后用高速磨粉机粉碎，过筛，取粒径125-150μm(即100～120目)的米粉备用。
(3)提取液准备：称取1.00g米粉置于编号的离心管中，加入2.0％(v/v)三氟乙酸溶液20mL。
(4)无机镉提取：涡旋混匀，在20+45kHz超声波辅助条件下提取30min(每15min涡旋混匀一次)后，8000r/min离心15min，取上清液为待测液。
实施例2
与实施例1的不同之处在于，步骤(4)中，无机镉的提取时间为120min。
实施例3
与实施例1的不同之处在于，步骤(3)中，加入2.0％(v/v)三氟乙酸溶液15mL。
实施例4
与实施例1的不同之处在于，步骤(3)中，加入2.0％(v/v)三氟乙酸溶液25mL；步骤(4)未在超声波辅助条件下提取。
实施例5
与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中，过筛，取粒径150-180μm(即80～100目)的米粉备用；步骤(3)中，加入1.0％(v/v)三氟乙酸溶液25mL；步骤(4)未在超声波辅助条件下提取。
实施例6
与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中，过筛，取粒径150-180μm(即80～100目)的米粉备用；步骤(3)中，加入2.0％(v/v)三氟乙酸溶液25mL；步骤(4)未在超声波辅助条件下提取。
对比例1
与实施例1的不同之处在于，采用超纯水进行提取。
对比例2
与实施例2的不同之处在于，采用超纯水进行提取。
对比例3
与实施例3的不同之处在于，采用超纯水进行提取。
对比例4
与实施例4的不同之处在于，采用超纯水进行提取。
对比例5
与实施例5的不同之处在于，采用超纯水进行提取。
对比例6
与实施例6的不同之处在于，采用超纯水进行提取。
将实施例1-6及对比例1-6制得的待测液的镉含量和蛋白质的得率进行测定，镉含量的测定参照国标《食品中镉的测定》(GB 5009.15-2014)，采用考马斯亮蓝法测定待测液中的蛋白质得率。
经测试，实施例1-6及对比例1-6制得的待测液的无机镉和蛋白质的得率结果如表1所示：
表1大米中无机镉和蛋白质得率
无机镉得率/(μg/kg大米) 蛋白质得率/(mg/g大米)
实施例1 315.35 1.95
实施例2 305.00 2.48
实施例3 311.15 2.74
实施例4 312.49 3.17
实施例5 295.87 4.67
实施例6 302.54 2.20
对比例1 - 0.48
对比例2 - 0.48
对比例3 - 0.48
对比例4 - 0.48
对比例5 - 0.42
对比例6 - 0.48
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims (10)

1.一种检测大米中无机镉含量的待测液的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：
将大米粉碎后获得米粉，将米粉与三氟乙酸溶液混合提取无机镉，离心后得到上清液，即为待测液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述米粉的粒径≤180μm。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，相对于1g米粉，三氟乙酸溶液的用量为15-25mL。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，三氟乙酸溶液的浓度为0.5～2.0％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，采用超声波辅助提取无机镉。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，超声波的频率为20KHz和/或45KHz。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其中，提取时间为30～120min，提取的温度为25～35℃。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其中，提取时每10～20min混匀一次。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其中，混匀的方式为涡旋混匀。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其中，离心的转速为6000～10000r/min，离心的时间为12～18min。
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