CN109182279A - 一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法 - Google Patents

一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109182279A
CN109182279A CN201810903822.9A CN201810903822A CN109182279A CN 109182279 A CN109182279 A CN 109182279A CN 201810903822 A CN201810903822 A CN 201810903822A CN 109182279 A CN109182279 A CN 109182279A
Authority
CN
China
Prior art keywords
promoter
aldh1
plasmid
stem cell
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810903822.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109182279B (zh
Inventor
宁志丰
刘复兴
吴基良
武倩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hubei University of Science and Technology
Original Assignee
Hubei University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hubei University of Science and Technology filed Critical Hubei University of Science and Technology
Priority to CN201810903822.9A priority Critical patent/CN109182279B/zh
Publication of CN109182279A publication Critical patent/CN109182279A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109182279B publication Critical patent/CN109182279B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16621—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法，通过将I型单纯疱疹病毒17+株基因组上的ICP4基因启动子置换成肿瘤干细胞特异性启动子、再将I型单纯疱疹病毒17+株基因组上ICP34.5基因剔除并插入IL‑12表达序列，得到HSVALDH1+IL‑12。本发明提供了一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法，该新型溶瘤病毒HSVALDH1+IL‑12采用ALDH1启动子及剔除ICP34.5的构建法实现高选择性地在肿瘤干细胞内繁殖，确保该病毒不感染正常组织干细胞；同时，插入IL‑12表达序列增强该新型溶瘤病毒HSVALDH1+IL‑12的免疫调节作用，确保受损的肿瘤干细胞被机体自身的免疫细胞彻底清除干净。

Description

一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法
技术领域
本发明涉及生物技术和基因治疗领域，具体的说是涉及一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法。
背景技术
溶瘤病毒疗法是一种利用病毒特异性地在肿瘤细胞中复制继而杀伤肿瘤细胞，并刺激机体产生特异性抗肿瘤免疫反应的新型肿瘤治疗方法。相比其他肿瘤治疗方法，溶瘤病毒疗法具有复制高效、杀伤效果好和毒副作用小等特点，已经成为肿瘤治疗研究领域的新热点。
美国Amgen公司的Ⅰ型单纯疱疹重组病毒T-VEC(talimogenelaherparepvec)在治疗晚期黑色素瘤患者的Ⅲ期临床试验中显示出良好的肿瘤治疗效果，并成为首个获得美国FDA批准上市的溶瘤病毒类治疗药物。溶瘤病毒在黑色素瘤治疗上取得的成功引起了科学家对溶瘤病毒疗法更广泛的关注，溶瘤病毒的研究得到了进一步的推动。至今用于溶瘤治疗的病毒高达数十种，包括Ⅰ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1，HSV-1)、腺病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、麻疹病毒、人类免疫缺陷病毒、腮腺炎病毒、牛痘病毒、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)和流感病毒等。溶瘤病毒按发展历程大致可分为4种类型：(1)野生型病毒株或自然减毒株，如新城疫病毒、柯萨奇病毒和呼肠孤病毒等；(2)基因工程选择性减毒株，主要是删除病毒某些关键基因而实现病毒复制的肿瘤选择性，如ONYX-015、G207等；(3)基因加载型病毒株，主要是在前述两种溶瘤病毒基础上加载外源治疗基因，如加载粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)的JX-594和T-VEC等；(4)转录靶向型病毒株，即在病毒必需基因前插入组织或肿瘤特异性启动子来控制溶瘤病毒在肿瘤细胞内复制，如G92A等。
肿瘤干细胞是肿瘤发生发展、复发转移、放化疗抵抗的种子细胞，根除肿瘤干细胞有望治愈恶性肿瘤，包括已发生转移的恶性肿瘤病人。但是目前上市的溶瘤病毒中还没有能够选择性在肿瘤干细胞中繁殖的，实现只能选择性在肿瘤干细胞繁殖并杀灭肿瘤干细胞的目标，应用前景将非常广阔，由于转移性肿瘤中肿瘤干细胞占比高，因此该病毒对于转移性肿瘤尤为有效。
发明内容
为解决上述背景技术中提出的问题，本发明的目的在于提供一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
本发明公开了一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒构建方法，包括以下步骤：
步骤一、构建pdICP4-promoter质粒：PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株ICP4基因启动子上游和下游的侧翼序列后，用限制性内切酶EcoRI/SpeI分别消化后获得ICP4基因启动子的上游侧翼序列、下游侧翼序列及去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株，并用互补的连接酶Linker 1和Linker 2将所述ICP4基因启动子的上游侧翼序列和下游侧翼序列连接起来，并把连接后的产物克隆到pBluescript的EcoRI和SalI酶切位点创建质粒pdICP4-promoter；
步骤二、构建pdICP4-ALDH1-promoter质粒：用EcoRI/XhoI双酶切消化的方式把由CMV启动子控制的人ALDH1启动子序列从质粒pcDNA3.1-ALDH1-promoter中释放出来，用T4DNA多聚酶处理后克隆入步骤一所得质粒pdICP4-promoter的限制性内切酶EcoHV酶切位点处，从而构建质粒pdICP4-ALDH1-promoter；
步骤三、BHK细胞内同源重组I型单纯疱疹病毒17+株：将步骤一中去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株与步骤二中质粒pdICP4-ALDH1-promoter共同转染BHK细胞，使这两者在BHK细胞发生同源重组，获得表达ALDH1启动子的重组病毒载体17-d4-ALDH1-promoter；
步骤四、构建pdICP34.5质粒：PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株中ICP34.5基因的上游和下游侧翼序列，得到的ICP34.5上游和下游侧翼序列两个片段用重叠PCR进行连接，随后把连接后的产物插入预先用限制性内切酶BamHI/XhoI消化后的质粒pSP72中，用T4DNA多聚酶补平质粒的粘性末端，得到的质粒命名为pdICP34.5；
步骤五、构建质粒pdICP34.5-hIL-12：用hIL-12基因替代质粒pcDNA3.1-ALDH1-promoter中的ALDH1-promoter，产生质粒pcDNA3.1-hIL-12；把来自质粒pcDNA3.1-hIL-12中的hIL-12表达盒克隆入质粒pdICP34.5的Afel位点处，创建质粒pdICP34.5-hIL-12；
步骤六、步骤五中的质粒pdICP34.5-hIL-12用来删除步骤三中重组病毒载体17-d4-ALDH1-promoter中ICP34.5基因，从而构建出溶瘤病毒HSVALDH1+IL-12。
上述技术方案中，步骤一中的ICP4启动子中，
上游侧翼序列的引物对包括：上游序列ICP4-promoterUSf为AAAAGAATTCGATACACATCGTTCAGACGGAGC；
下游序列ICP4-promoterUSr为
AAAAACTAGTGATCGATCTCGCACATGGCCT；
下游侧翼序列的引物对包括：上游序列ICP4-promoterDSf为AAAAAAGCTTTCACGCGCATGCTCTTCTC；
下游序列ICP4-promoterDSr为
AAAACAGCTGCACCGTGCCCGTGATGAA。
上述技术方案中，步骤四中的ICP34.5基因中，
上游侧翼序列的引物对包括：上游序列ICP34.5USf为
CTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTG；
下游序列ICP34.5USr为
GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCGCGGGCGCGTCCTGACCGCGGG；
下游侧翼序列的引物对包括：上游序列ICP34.5DSf为
GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACCA；
下游序列ICP34.5DSr为
TTCTTCCCTCTTCTCCCGCCCTCCA。
上述技术方案中，步骤一中，Linker 1的引物序列为
CTAGTGAATTCTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCA；
Linker 2的引物序列为
AGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGAATTCA。
上述技术方案中，步骤三中重组病毒载体17-d4-ALDH1-promoter通过四轮挑取嗜毒斑的方法进行纯化。
本发明还公开了一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒，采用下述构建方法：将I型单纯疱疹病毒17+株基因组上的ICP4基因启动子置换成肿瘤干细胞特异性启动子，再将I型单纯疱疹病毒17+株基因组上ICP34.5基因剔除并插入IL-12表达序列构建得新型溶瘤病毒HSVALDH1+IL-12。
上述技术方案中，所述肿瘤干细胞特异性启动子为ALDH1启动子。
上述技术方案中，所述构建方法为一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒构建方法中所述的构建方法。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过将I型单纯疱疹病毒17+株(HSV母病毒)基因组上的ICP4基因启动子置换成肿瘤干细胞特异性启动子(乙醛脱氢酶1ALDH1启动子)、再将I型单纯疱疹病毒17+株基因组上的ICP34.5基因剔除并插入IL-12表达序列，得到HSVALDH1+IL-12。
几乎所有肿瘤干细胞能够表达ALDH1，故ALDH1启动子能保证HSVALDH1+IL-12选择性地在肿瘤干细胞内繁殖。ICP34.5可对抗正常细胞中干扰素抗病毒的作用，而大约90％以上肿瘤细胞的干扰素抗病毒作用均有不同程度的缺损，剔除ICP34.5基因使得病毒HSVALDH1+IL-12不能在正常细胞内而仅能在肿瘤细胞内生长繁殖，确保该病毒不感染正常组织干细胞。同时，插入IL-12表达序列可增强该病毒的免疫调节作用，确保受损的肿瘤干细胞被机体自身的免疫细胞彻底清除干净。
附图说明
图1为本发明中重组病毒HSVALDH-1+IL-12的示意图；
图2为HSVALDH-1+IL-12选择性抑制EC9706微球体的存活能力的条形图；
图3为HSVALDH-1+IL-12选择性抑制EC9706微球体的克隆形成能力的条形图；
图4为HSVALDH-1+IL-12选择性抑制EC9706微球体的迁移能力的条形图；
图5为HSVALDH-1+IL-12选择性抑制EC9706微球体的侵袭能力的条形图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合附图和具体实施方式，进一步阐述本发明是如何实施的。
本发明中，限制性内切酶EcoRI/SpeI：购于Thermo Scientific；pBluescript：购于Stratagene；pcDNA3.1-ALDH1-promoter：购于赢润生物YRGENE，中国；限制性内切酶BamHI/XhoI：购于Thermo Scientific；pSP72：购于Promega公司；hIL-12基因：购于Invitrogen公司。
本发明公开了一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒构建方法，包括以下步骤：
步骤一、构建pdICP4-promoter质粒：PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株ICP4基因启动子上游(up-stream，US)和下游(down-stream，DS)的侧翼序列(flanking regions，FLRs)后，用限制性内切酶EcoRI/SpeI分别消化后获得的ICP4基因启动子的上游侧翼序列US FLRs、下游侧翼序列DS FLRs及去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株，并用互补的连接酶Linker 1和Linker 2将ICP4基因启动子的上游侧翼序列US FLRs和下游侧翼序列DSFLRs连接起来，随后把连接后的产物克隆到pBluescript的EcoRI和SalI酶切位点创建质粒pdICP4-promoter；
步骤二、构建pdICP4-ALDH1-promoter质粒：用EcoRI/XhoI双酶切消化的方式把由CMV启动子控制的人ALDH1启动子序列从质粒pcDNA3.1-ALDH1-promoter中释放出来，用T4DNA多聚酶处理后克隆入步骤一所得质粒pdICP4-promoter的限制性内切酶EcoHV酶切位点处，从而构建质粒pdICP4-ALDH1-promoter；
步骤三、BHK细胞内同源重组I型单纯疱疹病毒17+株：将步骤一中去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株与步骤二中质粒pdICP4-ALDH1-promoter共同转染BHK细胞，使这两者在BHK细胞发生同源重组，获得表达ALDH1启动子的重组病毒载体17-d4-ALDH1-promoter；
步骤四、构建pdICP34.5质粒：PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株中ICP34.5基因的上游侧翼序列US FLRs和下游侧翼序列DS FLRs，得到的ICP34.5US FLRs和ICP34.5DSFLRs两个片段用重叠PCR进行连接，随后把连接后的产物插入预先用限制性内切酶BamHI/XhoI消化后的质粒pSP72中，用T4DNA多聚酶补平质粒的粘性末端，得到的质粒命名为pdICP34.5；
步骤五、构建质粒pdICP34.5-hIL-12：用hIL-12基因替代质粒pcDNA3.1-ALDH1-promoter中的ALDH1-promoter，产生质粒pcDNA3.1-hIL-12；把来自质粒pcDNA3.1-hIL-12中的hIL-12表达盒克隆入质粒pdICP34.5的Afel位点处，创建质粒pdICP34.5-hIL-12；步骤六、步骤五中的质粒pdICP34.5-hIL-12用来删除步骤三中重组病毒载体17-d4-ALDH1-promoter的ICP34.5基因，从而构建出溶瘤病毒HSVALDH1+IL-12。
如表1所示，步骤一中的ICP4启动子中，上游侧翼序列的引物对包括：上游序列ICP4-promoterUSf为
AAAAGAATTCGATACACATCGTTCAGACGGAGC(SEQ ID NO：1)；
下游序列ICP4-promoterUSr为
AAAAACTAGTGATCGATCTCGCACATGGCCT(SEQ ID NO：2)；
下游侧翼序列的引物对包括：上游序列ICP4-promoterDSf为AAAAAAGCTTTCACGCGCATGCTCTTCTC(SEQ ID NO：3)；
下游序列ICP4-promoterDSr为
AAAACAGCTGCACCGTGCCCGTGATGAA(SEQ ID NO：4)。
步骤四中的ICP34.5基因中，上游侧翼序列的引物对包括：上游序列ICP34.5USf为
CTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTG(SEQ ID NO：5)；
下游序列ICP34.5USr为
GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCGCGGGCGCGTCCTGACCGCGGG(SEQ ID NO：6)；
下游侧翼序列的引物对包括：
上游序列ICP34.5DSf为
GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACCA(SEQ ID NO：7)；
下游序列ICP34.5DSr为
TTCTTCCCTCTTCTCCCGCCCTCCA(SEQ ID NO：8)。
步骤一中，Linker 1的引物序列为
CTAGTGAATTCTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCA(SEQ ID NO：9)；
Linker 2的引物序列为
AGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGAATTCA(SEQ ID NO：10)。
表1.构建质粒pdICP34.5和pdICP4-promoter所用的引物
注：基因组序列用下划线标出,穿梭质粒构建时所用的限制性酶切位点用粗斜体表示。在ICP34.5USr和ICP34.5DSf中进行重复PCR连接ICP34.5US和DS FLRs的互补序列用粗体标出。
本发明中，步骤三中重组病毒载体17-d4-ALDH1-promoter通过四轮挑取嗜毒斑的方法进行纯化。
本发明还公开了一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒，采用下述构建方法：将I型单纯疱疹病毒17+株基因组上的ICP4基因启动子置换成肿瘤干细胞特异性启动子，再将I型单纯疱疹病毒17+株基因组上ICP34.5基因剔除并插入IL-12表达序列构建得新型溶瘤病毒HSVALDH1+IL-12；所述肿瘤干细胞特异性启动子为ALDH1启动子；如图1所示。
本发明中，所述构建方法为一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒构建方法中所述的构建方法。
HSVALDH1+IL-12溶瘤效果验证实验：
本发明无血清悬浮培养的方法从数个人恶性肿瘤肿瘤细胞系中分离出微球体(其中，微球体是肿瘤干细胞的一种)，本发明使用食管鳞癌EC9706的微球体开展下述实验。
1、MTT实验
MTT是反映细胞存活能力的良好方法。本发明使用MTT检测了不同病毒滴度下(0，0.001，0.01，0.1，1)HSVALDH1+IL-12对食管鳞癌EC9706微球体细胞、普通贴壁生长EC9706细胞、正常食管上皮HEEC细胞的存活能力的影响，在96孔板上，每孔5000个细胞，设置6个平行复孔，发现这种新型溶瘤病毒HSVALDH1+IL-12可以显著抑制EC9706微球体的存活能力，而对普通EC9706和正常食管上皮细胞没有抑制作用(见图2)。
2、平板克隆形成实验
克隆形成能力是恶性肿瘤细胞的一种独有特性。平板克隆形成实验能很好地反映肿瘤细胞的克隆形成能力。本发明使用平板克隆形成实验检测HSVALDH1+IL-12对EC9706微球体细胞、普通贴壁生长EC9706细胞、正常食管上皮HEEC细胞克隆形成能力的影响，发现这种新型溶瘤病毒HSVALDH1+IL-12可以显著抑制EC9706微球体的克隆形成能力，而对普通EC9706和正常食管上皮细胞没有抑制作用(见图3)。
3、Transwell小室迁移实验
迁移能力是恶性肿瘤的一种特性，反映了肿瘤转移的能力。Transwell小室迁移实验能够检测这种迁移能力。本发明使用Transwell小室迁移实验检测HSVALDH1+IL-12对EC9706微球体、普通贴壁生长EC9706细胞、正常食管上皮HEEC细胞迁移能力的影响，发现这种新型溶瘤病毒HSVALDH1+IL-12可以显著抑制EC9706微球体的迁移能力，而对普通EC9706和正常食管上皮细胞没有抑制作用(见图4)。
4、Transwell小室侵袭实验
侵袭是恶性肿瘤独有的特性，Transwell小室侵袭实验能够反映这种侵袭能力。本发明使用Transwell小室侵袭实验检测HSVALDH1+IL-12对EC9706微球体、普通贴壁生长EC9706细胞、正常食管上皮HEEC细胞侵袭能力的影响，发现这种新型溶瘤病毒HSVALDH1+IL-12可以显著抑制EC9706微球体的侵袭能力，而对普通EC9706和正常食管上皮细胞没有抑制作用(见图5)。
本发明通过MTT检测、平板克隆形成实验、Transwell小室迁移实验和Transwell小室侵袭实验，表明了本发明提供的新型病毒HSVALDH1+IL-12具有选择性地抑制EC9706微球体的存活、克隆形成、迁移和侵袭的能力，说明HSVALDH1+IL-12可以选择性杀灭EC9706微球体，即肿瘤干细胞。
本发明中，ALDH1启动子序列(SEQ ID NO：11)：
ICP4基因的启动子(SEQ ID NO：12)：
I型单纯疱疹病毒17+株基因组ICP34.5上游(up-stream，US)和下游(down-stream，DS)的侧翼序列：
ICP34.5上游侧翼序列(SEQ ID NO：13)：
ICP34.5下游侧翼序列(SEQ ID NO：14)：
I型单纯疱疹病毒17+株基因组ICP4promoter上游(up-stream,US)和下游(down-stream，DS)的侧翼序列：
ICP4promoter上游的侧翼序列(SEQ ID NO：15)：
ICP4promoter下游的侧翼序列(SEQ ID NO：16)：
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖北科技学院
<120> 一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法
<130> 2018
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> primer
<222> (1)..(33)
<400> 1
aaaagaattc gatacacatc gttcagacgg agc 33
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> primer
<222> (1)..(31)
<400> 2
aaaaactagt gatcgatctc gcacatggcc t 31
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> primer
<222> (1)..(29)
<400> 3
aaaaaagctt tcacgcgcat gctcttctc 29
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> primer
<222> (1)..(28)
<400> 4
aaaacagctg caccgtgccc gtgatgaa 28
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> primer
<222> (1)..(25)
<400> 5
ctctgacctg agattggcgg cactg 25
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> primer
<222> (1)..(45)
<400> 6
gcggccgcag cgctgcggcc gccgcgggcg cgtcctgacc gcggg 45
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> primer
<222> (1)..(47)
<400> 7
gcggccgcag cgctgcggcc gccagcgcgg cggggcccgg ccaacca 47
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> primer
<222> (1)..(25)
<400> 8
ttcttccctc ttctcccgcc ctcca 25
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> primer
<222> (1)..(46)
<400> 9
ctagtgaatt ctagtggatc ccccgggctg caggaattcg atatca 46
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> primer
<222> (1)..(46)
<400> 10
agcttgatat cgaattcctg cagcccgggg gatccactag aattca 46
<210> 11
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(723)
<400> 11
gaattcccta aaagtcctgc tggcttttct gttcacatat agaaaataaa gataatttgg 60
gcttctgaga tcacagtagg tctacttacc cagcactgaa aatacacaag actgatacga 120
tattttaaaa ctaacttagg gtagggtgta gataaaaggg cctttcttcc ccaaacagca 180
ccttgatttt ctgggagatg gactgatttc ctgaaagcct tgtcctgaag acacctggcc 240
agggttctct cctcaccagc ttctactgag aacaagtccc ttttagactc ttttcaatcc 300
tcaaattctc tgattccaag tctgtcagag aacagaaagt tacatagtag cattaaaagc 360
atgagaagtc aaaaaataat aactggcctt agtggcagaa gcagctgctg catacactta 420
tcacaggttt cggctttgta aattaattca tctgcaaata gtgcactgtc tccaggtaca 480
aattcgatgc tggagcactg gtttcttaag gatttaagtt taaagtcaaa ggcttcctgc 540
cctaggtgtt acaaataagt agtgtcgttt tctttttttg ctctgagttt gttcatccaa 600
tcgtatccga gtatgcaaat aaactttagc ccgtgcagat aaaaaaggaa caaataaagc 660
caagtgctct atcagaacca aattgctgag ccagtcacct gtgttccagg agccgaatca 720
gaa 723
<210> 12
<211> 515
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(515)
<400> 12
cccgggcccc gcccccggcc cgttcctcgt tagcatgcgg aacggaagcg gaaaccaccg 60
gatcgggcgg taatgagatg ccatgcgggg cggggcgcgg gcccacccgc cctcgcgccc 120
cgcccatggc agatggcgcg gatgggcggg gccgggggtt cgaccaacgg gccgcggcca 180
cgggcccccg gcgtgccggc gtcggggcgg ggtcgtgcat aatggaattc cgttcggggc 240
gggcccgcct ggggggcggg gggccggcgg cctccgctgc tcctccttcc cgccggcccc 300
tgggactata tgagcccgag gacgccccga tcgtccacac ggagcgcggc tgccgacacg 360
gatccacgac ccgacgcggg accgccagag acagaccgtc agacgctcgc cgcgccggga 420
cgccgatacg cggacgaagc gcgggagggg gatcggccgt ccctgtcctt tttcccaccc 480
aagcatcgac cggtccgcgc tagttccgcg tcgac 515
<210> 13
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(159)
<400> 13
ctgtatatat aaagtcaggg ggtcacatgg cgacccccaa cagggcgacc ccggtccctg 60
tatatatagg gtcagggggt tccgcacccc ctaacatggc gcccccggtc cctgtatata 120
tagtgtcacg gggttccacg ccccctaaca tggcgcccc 159
<210> 14
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(53)
<400> 14
cgcgggggtc gcgggggtcg cgggggtcgc gggggtcgcg ggggtcgcgg ggg 53
<210> 15
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
ccgcccctcg ccccctcccg cccctcgccc cctcccgccc ctcgccccct cccgcccctc 60
gccccctccc gcccctcgcc ccctcccgcc cctcgccccc tcccgcccct cgccccctcc 120
cgcccctcgc cccctcccgc ccctcgcccc ctcccgcccc tcgccccctc ccgcccctcg 180
ccccctcccg cccctcgccc cctcccgccc ctcgccccct cccgcccctc gccccctccc 240
gcccctcgcc ccctcccgcc cctcgccccc tcccgcccct cgccccctcc cgcccctcgc 300
cccctcccgc ccctcgcccc ctcccgcccc tcg 333
<210> 16
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(126)
<400> 16
gggcggagga gggggggacg cgggggcgga ggagggggga cgcgggggcg gaggaggggg 60
gacgcggggg cggaggaggg gggacgcggg ggcggaggag gggggacgcg ggggcggagg 120
aggggg 126

Claims (8)

1.一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、构建pdICP4-promoter质粒：PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株ICP4基因启动子上游和下游的侧翼序列后，用限制性内切酶EcoRI/SpeI分别消化后获得ICP4基因启动子的上游侧翼序列、下游侧翼序列及去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株，并用互补的连接酶Linker 1和Linker 2将所述ICP4基因启动子的上游侧翼序列和下游侧翼序列连接起来，并把连接后的产物克隆到pBluescript的EcoRI和SalI酶切位点创建质粒pdICP4-promoter；
步骤二、构建pdICP4-ALDH1-promoter质粒：用EcoRI/XhoI双酶切消化的方式把由CMV启动子控制的人ALDH1启动子序列从质粒pcDNA3.1-ALDH1-promoter中释放出来，用T4DNA多聚酶处理后克隆入步骤一所得质粒pdICP4-promoter的限制性内切酶EcoHV酶切位点处，从而构建质粒pdICP4-ALDH1-promoter；
步骤三、BHK细胞内同源重组I型单纯疱疹病毒17+株：将步骤一中去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株与步骤二中质粒pdICP4-ALDH1-promoter共同转染BHK细胞，使这两者在BHK细胞发生同源重组，获得表达ALDH1启动子的重组病毒载体17-d4-ALDH1-promoter；
步骤四、构建pdICP34.5质粒：PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株中ICP34.5基因的上游和下游侧翼序列，得到的ICP34.5上游和下游侧翼序列两个片段用重叠PCR进行连接，随后把连接后的产物插入预先用限制性内切酶BamHI/XhoI消化后的质粒pSP72中，用T4DNA多聚酶补平质粒的粘性末端，得到的质粒命名为pdICP34.5；
步骤五、构建质粒pdICP34.5-hIL-12：用hIL-12基因替代质粒pcDNA3.1-ALDH1-promoter中的ALDH1-promoter，产生质粒pcDNA3.1-hIL-12；把来自质粒pcDNA3.1-hIL-12中的hIL-12表达盒克隆入质粒pdICP34.5的Afel位点处，创建质粒pdICP34.5-hIL-12；
步骤六、步骤五中的质粒pdICP34.5-hIL-12用来删除步骤三中重组病毒载体17-d4-ALDH1-promoter中ICP34.5基因，从而构建出溶瘤病毒HSVALDH1+IL-12。
2.根据权利要求1所述的一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒构建方法，其特征在于，步骤一中的ICP4启动子中，
上游侧翼序列的引物对包括：上游序列ICP4-promoterUSf为AAAAGAATTCGATACACATCGTTCAGACGGAGC；
下游序列ICP4-promoterUSr为AAAAACTAGTGATCGATCTCGCACATGGCCT；
下游侧翼序列的引物对包括：上游序列ICP4-promoterDSf为AAAAAAGCTTTCACGCGCATGCTCTTCTC；
下游序列ICP4-promoterDSr为AAAACAGCTGCACCGTGCCCGTGATGAA。
3.根据权利要求1所述的一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒构建方法，其特征在于，步骤四中的ICP34.5基因中，
上游侧翼序列的引物对包括：上游序列ICP34.5USf为CTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTG；
下游序列ICP34.5USr为GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCGCGGGCGCGTCCTGACCGCGGG；
下游侧翼序列的引物对包括：上游序列ICP34.5DSf为GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACCA；
下游序列ICP34.5DSr为TTCTTCCCTCTTCTCCCGCCCTCCA。
4.根据权利要求1所述的一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒构建方法，其特征在于，步骤一中，Linker 1的引物序列为CTAGTGAATTCTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCA；
Linker 2的引物序列为AGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGAATTCA。
5.根据权利要求1所述的一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒构建方法，其特征在于，步骤三中重组病毒载体17-d4-ALDH1-promoter通过四轮挑取嗜毒斑的方法进行纯化。
6.一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒，其特征在于，采用下述构建方法：将I型单纯疱疹病毒17+株基因组上的ICP4基因启动子置换成肿瘤干细胞特异性启动子，再将I型单纯疱疹病毒17+株基因组上ICP34.5基因剔除并插入IL-12表达序列构建得新型溶瘤病毒HSVALDH1+IL-12。
7.根据权利要求6所述的一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒，其特征在于，所述肿瘤干细胞特异性启动子为ALDH1启动子。
8.根据权利要求6或7所述的一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒，其特征在于，所述构建方法为权利要求1-5中任一项所述的构建方法。
CN201810903822.9A 2018-08-09 2018-08-09 一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法 Active CN109182279B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810903822.9A CN109182279B (zh) 2018-08-09 2018-08-09 一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810903822.9A CN109182279B (zh) 2018-08-09 2018-08-09 一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109182279A true CN109182279A (zh) 2019-01-11
CN109182279B CN109182279B (zh) 2020-10-09

Family

ID=64921317

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810903822.9A Active CN109182279B (zh) 2018-08-09 2018-08-09 一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109182279B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1318836A2 (en) * 2000-08-17 2003-06-18 Molecular Skincare Limited Treatment of hyperproliferative diseases
CN101173299A (zh) * 2007-10-09 2008-05-07 浙江理工大学 肿瘤靶向性腺相关病毒载体的构建和应用
CN101338302A (zh) * 2008-05-04 2009-01-07 罗益（无锡）生物制药有限公司 一种用于肿瘤基因治疗的重组单纯疱疹病毒
CN102146418A (zh) * 2010-02-09 2011-08-10 武汉滨会生物科技有限公司 重组ⅱ型单纯疱疹病毒载体及其制备方法、重组病毒、药物组合物及应用
CN103205399A (zh) * 2012-09-06 2013-07-17 刘滨磊 重组单纯疱疹病毒、其制备方法及应用
CN104877969A (zh) * 2014-12-14 2015-09-02 刘滨磊 重组溶瘤性ii型单纯疱疹病毒及其药物组合物

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1318836A2 (en) * 2000-08-17 2003-06-18 Molecular Skincare Limited Treatment of hyperproliferative diseases
CN101173299A (zh) * 2007-10-09 2008-05-07 浙江理工大学 肿瘤靶向性腺相关病毒载体的构建和应用
CN101338302A (zh) * 2008-05-04 2009-01-07 罗益（无锡）生物制药有限公司 一种用于肿瘤基因治疗的重组单纯疱疹病毒
CN102146418A (zh) * 2010-02-09 2011-08-10 武汉滨会生物科技有限公司 重组ⅱ型单纯疱疹病毒载体及其制备方法、重组病毒、药物组合物及应用
CN103205399A (zh) * 2012-09-06 2013-07-17 刘滨磊 重组单纯疱疹病毒、其制备方法及应用
CN104877969A (zh) * 2014-12-14 2015-09-02 刘滨磊 重组溶瘤性ii型单纯疱疹病毒及其药物组合物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOHN F. CAREW ET AL: "A Novel Approach to Cancer Therapy Using an Oncolytic Herpes Virus to Package Amplicons Containing Cytokine Genes", 《MOLECULAR THERAPY》 *
JOHN T. MULLEN等: "Regulation of Herpes Simplex Virus 1 Replication Using Tumor-Associated Promoters", 《ANNALS OF SURGERY》 *
KENGO NAKAHATA ET AL: "Aldehyde Dehydrogenase 1 (ALDH1) Is a Potential Marker for Cancer Stem Cells in Embryonal Rhabdomyosarcoma", 《POLS ONE》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109182279B (zh) 2020-10-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109576231B (zh) 分离的重组溶瘤腺病毒、药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途
WO2020239040A1 (zh) 重组溶瘤病毒以及制备方法、应用和药物
US20090156796A1 (en) Metastatic colon cancer specific promoter and uses thereof
CN107586759B (zh) 一种重组新城疫病毒的构建方法及应用
CN104561085A (zh) OsAGO18基因在提高水稻对水稻条纹叶枯病抗性中的应用
CN102286433A (zh) 一种新型溶瘤腺病毒-胸苷激酶基因构建体的获得及用途
CN102206613A (zh) 肿瘤选择性复制型腺病毒-胸苷激酶基因构建体的获得及用途
WO2021008267A1 (zh) 特异性杀伤肿瘤细胞的病毒和肿瘤治疗药物
CN103484462B (zh) Survivin启动子调控CD基因的重组腺病毒载体构建及其应用
CN103451198B (zh) 溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性cDNA及其构建方法和应用
CN109554395A (zh) 一种选择性杀灭前列腺癌细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法
CN109517810A (zh) 一种选择性杀灭肝癌细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法
CN109182279A (zh) 一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法
US20060275262A1 (en) Conditionally replicating viruses and methods for cancer virotherapy
US20230272423A1 (en) Dna molecules producing custom designed replicating and non-replicating negative stranded rna viruses and uses there of
CN110055282A (zh) 一种选择性杀灭结肠癌细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法
WO2022012028A1 (zh) 构建体、溶瘤病毒及其应用
CN101638655B (zh) 癌胚抗原阳性细胞靶向性基因表达元件cpe及其应用
CN101671670B (zh) 一种肝癌靶向性基因表达元件ap及其应用
CN111925997B (zh) 表达白介素33的重组溶瘤腺病毒的构建及其应用方法
CN100420742C (zh) 一种肝癌靶向性溶瘤腺病毒，其制备方法及用途
CN102399777A (zh) 一种重组质粒及应用其制备的重组溶瘤腺病毒
WO2021197506A1 (zh) 重组新城疫病毒及制备方法、重组质粒、及其应用
WO2021197507A1 (zh) 重组新城疫病毒及制备方法、重组质粒、及其应用
WO2019061691A1 (zh) 一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系及其构建方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant