CN109182268A - 脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途 - Google Patents

脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN109182268A
CN109182268A CN201810892497.0A CN201810892497A CN109182268A CN 109182268 A CN109182268 A CN 109182268A CN 201810892497 A CN201810892497 A CN 201810892497A CN 109182268 A CN109182268 A CN 109182268A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
gene
umbilical artery
optionally
stem cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810892497.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109182268B (zh
Inventor
裴雪涛
裴海云
岳�文
李慧琳
王思涵
谢小燕
韩毅
白云
范增
张博文
南雪
何丽娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Original Assignee
Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS filed Critical Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority to CN201810892497.0A priority Critical patent/CN109182268B/zh
Publication of CN109182268A publication Critical patent/CN109182268A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109182268B publication Critical patent/CN109182268B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/28—Vascular endothelial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提出了脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途。脐动脉内皮细胞能够为造血干细胞构建微环境，支持造血干细胞的体外扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。

Description

脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途。更具体地，本发明涉及脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途、重组细胞及其制备方法、造血干细胞扩增的方法、培养基、饲养层细胞和试剂盒。
背景技术
造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)具有高度的自我更新能力以及多向分化潜能，可以产生所有类型的血液细胞，如红细胞、白细胞、血小板和淋巴细胞等。它在生命过程中不仅能够重建整个造血系统，还具备维持长期造血的功能。近年来，HSC移植越来越多地被应用于临床治疗血液或非血液系统的恶性肿瘤，显示出广阔的应用前景。其中，尤以脐带血移植(umbilical cord blood transplantation，UCBT)备受青睐，它具有来源广泛、易于采集、对供体无伤害、HLA配型要求低、移植后复发率及移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)的发病率较低等优点。然而，单份脐带血中HSC绝对数量较少，输注后容易导致中性粒细胞恢复延迟并增加细菌及病毒感染的风险，而双份脐带血移植则会带来移植物抗宿主病发病率增加、血小板恢复时间延长等一系列问题。综合来看，对HSCs进行体外扩增培养是最直接便捷的解决方法，但迄今为止构建适宜的HSC体外扩增微环境仍是亟待解决的瓶颈问题。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
1978年Schofield首次提出了干细胞龛(Niche)的概念，指出特异性的微环境(Microenvironment)会对干细胞功能产生作用，随后有大量文献证实了多种组织中干细胞龛的存在。人们曾尝试多种方式来模拟体内造血微环境，以期望构建维持造血干细胞(HSCs)自我更新与扩增的体外培养体系，如造血相关的细胞因子、小分子、基质细胞共培养、Notch配体等，但效果仍然差强人意。
HSCs最早出现的位点是几个主要的动脉，包括AGM区的主动脉弓、头部动脉、卵黄动脉以及脐动脉，这是孕育HSCs产生以及维持其自我更新的重要场所。引起发明人注意的是分娩后脐带中仍然有大量HSCs存在，这其中极有可能蕴涵着维持HSCs干性的重要因素。在AGM区、骨髓等位点均已证实内皮细胞(ECs)是造血微环境的重要核心组份，分泌多种造血相关因子。此外，HSCs起源于动脉内的生血内皮(HE)，且与ECs共表达许多表面标志和转录因子。因此，发明人推测，脐带中的动脉内皮细胞(HuAECs)有可能也是影响HSCs的重要微环境因素之一，利用这一微环境构建新的培养平台，可以支持HSCs的体外扩增，同时维持HSCs的自我更新。
有鉴于此，发明人采用脐动脉内皮细胞作为饲养层细胞，以构建造血干细胞微环境，维持造血干细胞扩增。进一步地，发明人发现，由于脐动脉内皮细胞的存活依赖于血清和血管内皮细胞生长因子，但在体外共培养环境中血清和血管内皮相关因子又会抑制脐动脉内皮细胞的分泌功能、成血管活性以及对造血稳态的支持作用，且会干扰HSCs的扩增。
E4orf1是腺病毒E4编码区的基因产物，能够调控细胞信号通路进而影响细胞周期和细胞凋亡。发明人发现，将E4orf1基因导入脐动脉内皮细胞，能够使得脐动脉内皮细胞在无血清和血管内皮细胞生长因子的条件下存活且维持自身特性，并且无需经过丝裂霉素C或者放射射线的预处理便可以维持不增殖的存活状态。从而，为造血干细胞构建微环境，利于造血干细胞的扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。
为此，在本发明的一个方面，本发明提出了脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途。发明人发现，脐动脉内皮细胞能够为造血干细胞构建微环境，支持造血干细胞的体外扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。
根据本发明的实施例，所述用途还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述脐动脉内皮细胞是以重组细胞的形式提供的，所述重组细胞携带有E4orf1基因以及任选的GFP基因。
根据本发明的实施例，所述脐动脉内皮细胞用作饲养层细胞。
根据本发明的实施例，所述脐动脉内皮细胞用于维持造血干细胞扩增。
根据本发明的实施例，所述脐动脉内皮细胞的血管内皮生长因子受体KDR的表达率为90～95％，内皮细胞标志CD144的表达率均大于99％，内皮细胞标志CD31的表达率为90～95％，干性标志CD117、内皮祖细胞标志CD133以及造血细胞CD45的表达率均低于0.4％。
根据本发明的实施例，所述脐动脉内皮细胞高表达Notch4基因、DLL4基因和Cxcr4基因。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞为携带有E4orf1基因的脐动脉内皮细胞。发明人发现，由于脐动脉内皮细胞的存活依赖于血清和血管内皮细胞生长因子，但在体外共培养环境中血清和血管内皮相关因子又会抑制脐动脉内皮细胞的分泌功能、成血管活性以及对造血稳态的支持作用，且会干扰HSCs的扩增。进一步地，发明人经深入研究发现，将E4orf1基因导入脐动脉内皮细胞，使得脐动脉内皮细胞可以在无血清和血管内皮细胞生长因子的条件下存活且维持自身特性，并且无需经过丝裂霉素C或者放射射线的预处理便可以维持不增殖的存活状态，从而构建促进造血干细胞体外扩增的微环境，利于造血干细胞的扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。
根据本发明的实施例，所述脐动脉内皮细胞携带有GFP基因。
根据本发明的实施例，所述重组细胞用于维持造血干细胞扩增。
根据本发明的实施例，所述重组细胞的血管内皮生长因子受体KDR的表达率为90～95％，内皮细胞标志CD144的表达率均大于99％，内皮细胞标志CD31的表达率为90～95％，干性标志CD117、内皮祖细胞标志CD133以及造血细胞CD45的表达率均低于0.4％。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为饲养层细胞。
根据本发明的实施例，所述重组细胞高表达Notch4基因、DLL4基因和Cxcr4基因。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备前面所述重组细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将携带有E4orf1基因的第一载体加入含有所述脐动脉内皮细胞的第一培养基中，进行培养，以便得到所述重组细胞。由此，根据本发明实施例的重组细胞能够为造血干细胞构建微环境，利于造血干细胞的扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：分别将所述第一载体和携带有GFP基因的第二载体共同加入所述脐动脉内皮细胞的培养基中。
根据本发明的实施例，所述第一载体为包装有质粒MSCV-N E4orf1的逆转录病毒，并且所述质粒上携带有抗嘌呤霉素基因。
根据本发明的实施例，所述第二载体为包装有质粒pMX-GFP的逆转录病毒，并且所述质粒上携带有抗嘌呤霉素基因。
根据本发明的实施例，所述第一载体和第二载体的体积比为1:1。
根据本发明的实施例，所述第一培养基包括EGM-2基础培养基和0.5μg/ml的嘌呤霉素，且不含有血清及血管内皮细胞生长因子。
根据本发明的实施例，所述第一培养基为EGM-2基础培养基。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种造血干细胞扩增的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：按照前面所述制备重组细胞的方法获得重组细胞；以及将造血干细胞接种于含有所述重组细胞的第二培养基中，进行培养，以便使所述造血干细胞扩增。
根据本发明的实施例，所述造血干细胞为CD34+细胞。
根据本发明的实施例，所述第二培养基选自StemSpan培养基，所述StemSpan培养基含有50ng/ml SCF、50ng/ml Flt-3L和50ng/ml TPO，不含有血清及血管内皮细胞生长因子。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种培养基。根据本发明的实施例，所述培养基中不含有血清及血管内皮细胞生长因子，适于前面所述重组细胞与造血干细胞共培养。携带有E4orf1基因的脐动脉内皮细胞能够在无血清、无血管内皮细胞生长因子的培养基中生长，具有分泌功能、呈血管活性以及对造血稳态的支持作用，在维持内皮自身特性的同时获得永生能力，维持造血干细胞扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种饲养层细胞。根据本发明的实施例，所述饲养层细胞包括前面所述的重组细胞。由此，利用根据本发明实施例的饲养层细胞能够构建造血干细胞微环境，利于造血干细胞的扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：脐动脉内皮细胞或者前面所述重组细胞或者前面所述饲养层细胞。由此，利用根据本发明实施例的试剂盒能够构建造血干细胞微环境，利于造血干细胞的扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。
根据本发明的实施例，所述试剂盒用于构建造血干细胞的微环境。
根据本发明的实施例，所述试剂盒用于维持造血干细胞扩增。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的免疫荧光鉴定vWF在HuAECs、HuVECs和HFLSECs中的表达示意图，其中A为HuVECs、B为HFLSECs、C为HuAECs；
图2显示了根据本发明一个实施例的HuAECs、HuVECs和HFLSECs形成的管腔结构示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的脐动脉内皮细胞(HuAECs)和脐静脉内皮细胞(HuVECs)基因表达分析示意图；
图4显示了根据本发明一个实施例的E4orf1/HuAECs、E4orf1/HuVECs和E4orf1/HFLSECs在无血清环境中的光镜图；
图5显示了根据本发明一个实施例的流式细胞分析示意图；
图6显示了根据本发明一个实施例的E4orf1/HuAECs、E4orf1/HuVECs和E4orf1/HFLSECs作为饲养层支持CD34+细胞体外扩增的分析示意图，其中A为细胞电镜图；B为培养不同时间的有核细胞总数示意图；C为培养14天的有核细胞总数示意图；
图7显示了根据本发明一个实施例的E4orf1/HuAECs、E4orf1/HuVECs和E4orf1/HFLSECs作为饲养层支持HSPC细胞体外扩增的分析示意图；
图8显示了根据本发明一个实施例的人脐带血来源的CD34+细胞经过体外扩增后造血集落形成能力示意图；以及
图9显示了根据本发明一个实施例的NSG小鼠中人CD45+细胞的嵌入率分析示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
本发明提出了脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途、重组细胞、制备重组细胞的方法、造血干细胞扩增的方法、培养基、饲养层细胞以及试剂盒。下面将分别对其进行详细描述。
脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途
在本发明的一个方面，本发明提出了脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途。发明人发现，脐动脉内皮细胞能够为造血干细胞构建微环境，支持造血干细胞的体外扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。
根据本发明的实施例，脐动脉内皮细胞是以重组细胞的形式提供的，重组细胞携带有E4orf1基因以及任选的GFP基因。根据本发明的具体实施例，重组细胞是通过将E4orf1基因以及任选的GFP基因导入脐动脉内皮细胞而获得的。
发明人发现，脐动脉内皮细胞在无血清、无血管内皮相关因子(如VEGF、FGF、IGF、EGF等)的条件下会丧失功能并迅速凋亡，但在体外共培养环境中血清和血管内皮相关因子又会抑制脐动脉内皮细胞的分泌功能、成血管活性以及对造血稳态的支持作用，且会干扰HSCs的扩增，因此在与HSCs共培养时实现脐动脉内皮细胞的无血清和血管内皮相关因子存活至关重要。
E4orf1是腺病毒E4编码区的基因产物，能够调控细胞信号通路进而影响细胞周期和细胞凋亡。发明人将E4orf1基因导入脐动脉内皮细胞，使得脐动脉内皮细胞可以在无血清和血管内皮细胞生长因子的条件下维持内皮自身特性的同时获得永生能力，不与共培养的细胞争夺营养，并且无需经过丝裂霉素C或者放射射线的预处理便可以维持不增殖的存活状态。从而，为构建造血干细胞微环境，支持造血干细胞的体外扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。
另外，为了观察转化后细胞，并将其与未导入目标基因的细胞区分，发明人尝试将示踪蛋白基因导入脐动脉内皮细胞。经过大量实验发现，以编码绿色荧光蛋白的GFP基因作为示踪基因导入脐动脉内皮细胞中，不仅能够起到示踪作用，也不影响E4orf1基因的表达。尤其适用于多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs时与起始细胞进行区分。
根据本发明的实施例，脐动脉内皮细胞的血管内皮生长因子受体KDR的表达率为90～95％，内皮细胞标志CD144的表达率均大于99％，内皮细胞标志CD31的表达率为90～95％，干性标志CD117、内皮祖细胞标志CD133以及造血细胞CD45的表达率均低于0.4％。脐动脉内皮细胞本身是原代分离，发明人对其做流式实验验证细胞的表面标志分析，证明其高表达成熟内皮细胞的标志，而几乎不表达内皮祖细胞及干性标志，也不表达造血细胞的标志。由此，以表明本发明的重组细胞纯度较高。
根据本发明的实施例，脐动脉内皮细胞用作饲养层细胞。发明人发现，将脐动脉内皮细胞作为饲养层细胞与造血干细胞共培养，能够构建造血干细胞微环境，利于促进其扩增及维持自我更新。
根据本发明的实施例，脐动脉内皮细胞用于维持造血干细胞扩增。发明人发现，脐动脉内皮细胞能够为造血干细胞构建微环境，利于促进其扩增及维持自我更新。
根据本发明的实施例，相比于脐静脉内皮细胞，脐动脉内皮细胞高表达Notch4基因、DLL4基因和Cxcr4基因。上述几种基因是造血相关的重要基因，发明人发现，其在脐动脉内皮细胞中显著高表达，且相对表达量明显高于脐静脉内皮细胞。
重组细胞
在本发明的另一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，重组细胞为携带有E4orf1基因的脐动脉内皮细胞。发明人发现，由于脐动脉内皮细胞的存活依赖于血清和血管内皮细胞生长因子，但在体外共培养环境中血清和血管内皮相关因子又会抑制脐动脉内皮细胞的分泌功能、成血管活性以及对造血稳态的支持作用，且会干扰HSCs的扩增，因此在与HSCs共培养时实现脐动脉内皮细胞的无血清和血管内皮相关因子存活至关重要。进一步地，发明人经深入研究发现，将E4orf1基因导入脐动脉内皮细胞，使得脐动脉内皮细胞可以在无血清和血管内皮细胞生长因子的条件下存活且维持自身特性，并且无需经过丝裂霉素C或者放射射线的预处理便可以维持不增殖的存活状态。从而，构建促进造血干细胞体外扩增的微环境，利于造血干细胞的扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。
根据本发明的实施例，脐动脉内皮细胞携带有GFP基因。为了观察转化后细胞，并将其与未导入目标基因的细胞区分，发明人尝试将示踪蛋白基因导入脐动脉内皮细胞。经过大量实验发现，以编码绿色荧光蛋白的GFP基因作为示踪基因导入脐动脉内皮细胞中，不仅能够起到示踪作用，也不影响E4orf1基因的表达。尤其适用于促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs时与起始细胞进行区分。
根据本发明的实施例，重组细胞为饲养层细胞。发明人发现，重组细胞能够在无血清和血管内皮细胞生长因子的条件下存活且维持自身特性，并且无需经过丝裂霉素C或者放射射线的预处理便可以维持不增殖的存活状态。从而，将重组细胞与造血干细胞共培养，为造血干细胞构建微环境，利于造血干细胞的扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。
根据本发明的实施例，重组细胞的血管内皮生长因子受体KDR的表达率为90～95％，内皮细胞标志CD144的表达率均大于99％，内皮细胞标志CD31的表达率为90～95％，干性标志CD117、内皮祖细胞标志CD133以及造血细胞CD45的表达率均低于0.4％。脐动脉内皮细胞本身是原代分离，发明人对其做流式实验验证细胞的表面标志分析，证明其高表达成熟内皮细胞的标志，而几乎不表达内皮祖细胞及干性标志，也不表达造血细胞的标志。由此，以表明本发明的重组细胞纯度较高。
根据本发明的实施例，重组细胞用于维持造血干细胞扩增。发明人发现，脐动脉内皮细胞能够为造血干细胞构建微环境，利于维持造血干细胞扩增。
根据本发明的实施例，重组细胞高表达Notch4基因、DLL4基因和Cxcr4基因。上述几种基因是造血相关的重要基因，发明人发现，其在重组细胞中显著高表达。
制备重组细胞的方法
在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备前面所述重组细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将携带有E4orf1基因的第一载体加入含有脐动脉内皮细胞的第一培养基中，进行培养，以便得到重组细胞。发明人发现，由于脐动脉内皮细胞的存活依赖于血清和血管内皮细胞生长因子，但在体外共培养环境中血清和血管内皮相关因子又会抑制脐动脉内皮细胞的分泌功能、成血管活性以及对造血稳态的支持作用，且会干扰HSCs的扩增，因此在与HSCs共培养时实现脐动脉内皮细胞的无血清和血管内皮相关因子存活至关重要。为此，发明人将E4orf1基因导入脐动脉内皮细胞，使得脐动脉内皮细胞可以在无血清和血管内皮细胞生长因子的条件下存活且维持自身特性，并且无需经过丝裂霉素C或者放射射线的预处理便可以维持不增殖的存活状态。从而，构建造血干细胞微环境，支持造血干细胞的扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。
根据本发明的实施例，该方法进一步包括：分别将第一载体和携带有GFP基因的第二载体共同加入脐动脉内皮细胞的培养基中。为了观察转化后细胞，并将其与未导入目标基因的细胞区分，发明人尝试将示踪蛋白基因导入脐动脉内皮细胞。经过大量实验发现，以编码绿色荧光蛋白的GFP基因作为示踪基因导入脐动脉内皮细胞中，不仅能够起到示踪作用，也不影响E4orf1基因的表达。尤其适用于促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs时与起始细胞进行区分。
根据本发明的实施例，第一载体为包装有质粒MSCV-N E4orf1的逆转录病毒，并且所述质粒上携带有抗嘌呤霉素基因。发明人采用逆转录病毒转染宿主细胞(脐动脉内皮细胞)，使得目的基因(E4orf1基因)进入宿主细胞并整合到细胞基因组中，目的基因在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。其中，由于宿主细胞不含有抗嘌呤霉素基因，无法耐受一定浓度的嘌呤霉素。进而，当携带有抗嘌呤霉素基因的第一载体导入宿主细胞后，能够使得宿主细胞产生抗性，能够在含有一定浓度嘌呤霉素的培养基中生长，从而判定出是否成功导入第一载体。由此，使得脐动脉内皮细胞可以在无血清和血管内皮细胞生长因子的条件下存活且维持自身特性，并且无需经过丝裂霉素C或者放射射线的预处理便可以维持不增殖的存活状态。从而，构建造血干细胞微环境，支持造血干细胞的扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。
根据本发明的实施例，第二载体为包装有质粒pMX-GFP的逆转录病毒，并且所述质粒上携带有抗嘌呤霉素基因。发明人采用逆转录病毒转染宿主细胞，使得目的基因(GFP基因)进入宿主细胞并整合到细胞基因组中，目的基因在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。由此，便于观察转化后细胞，并将其与未导入目的基因的细胞区分，且不影响E4orf1基因表达。
根据本发明的实施例，第一载体和第二载体的体积比为1:1。发明人经过大量实验得到上述较优配比，在此条件下共转染的效率最佳。
根据本发明的实施例，第一培养基包括EGM-2基础培养基和0.5μg/ml的嘌呤霉素，且不含有血清及血管内皮细胞生长因子。发明人发现，正常脐动脉内皮细胞不含抗嘌呤霉素基因，故在含有0.5μg/ml嘌呤霉素的培养基中无法生长，在培养第二天开始就逐渐凋亡。进而，将携带有抗嘌呤霉素基因的第一载体和第二载体导入脐动脉内皮细胞，能够使得脐动脉内皮细胞正常生长。因此，在第一培养基中添加0.5μg/ml的嘌呤霉素，以起到筛选转化细胞的作用。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对重组细胞所描述的特征和优点，同样适用于该制备重组细胞的方法，在此不再赘述。
造血干细胞扩增的方法
在本发明的又一方面，本发明提出了一种造血干细胞扩增的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：按照前面所述制备重组细胞的方法获得重组细胞；以及将造血干细胞接种于含有重组细胞的第二培养基中，进行培养，以便使造血干细胞扩增。本发明的重组细胞携带有E4orf1基因，使得脐动脉内皮细胞可以在无血清和血管内皮细胞生长因子的条件下存活且维持自身特性，并且无需经过丝裂霉素C或者放射射线的预处理便可以维持不增殖的存活状态。从而构建造血干细胞微环境，利于造血干细胞的扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。
根据本发明的实施例，造血干细胞为CD34+细胞。CD34是造血干细胞的重要标志，进而，发明人由从脐带血的单个核细胞中纯化分离出其中CD34+的造血干细胞。
根据本发明的实施例，第二培养基选自StemSpan培养基，StemSpan培养基含有50ng/ml SCF(Stem cell factor)、50ng/ml Flt-3L(Fms-like tyrosine kinase3ligand)及50ng/ml TPO(Thrombopoietin)，不含有血清及血管内皮细胞生长因子。由此，以实现造血干细胞的扩增及维持自我更新，同时，可以维持脐动脉内皮细胞不增殖的存活状态。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对制备重组细胞的方法所描述的特征和优点，同样适用于该造血干细胞扩增的方法，在此不再赘述。
培养基
在本发明的又一方面，本发明提出了一种培养基。根据本发明的实施例，该培养基中不含有血清及血管内皮细胞生长因子，适于前面所述重组细胞与造血干细胞共培养。携带有E4orf1基因的脐动脉内皮细胞能够在无血清、无血管内皮细胞生长因子的培养基中生长，具有分泌功能、呈血管活性以及对造血稳态的支持作用，在维持内皮自身特性的同时获得永生能力，维持造血干细胞扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。
根据本发明的实施例，该培养基选自StemSpan培养基，含有50ng/ml SCF、50ng/mlFlt-3L和50ng/ml TPO。由此，以便使得脐动脉内皮细胞具有分泌功能、成血管活性以及对造血稳态的支持作用，维持造血干细胞的扩增。
饲养层细胞
在本发明的又一方面，本发明提出了一种饲养层细胞。根据本发明的实施例，该饲养层细胞包括前面描述的重组细胞。发明人发现，重组细胞能够在无血清和血管内皮细胞生长因子的条件下存活且维持自身特性，并且无需经过丝裂霉素C或者放射射线的预处理便可以维持不增殖的存活状态。从而，将该重组细胞与造血干细胞共培养，为造血干细胞构建微环境，利于造血干细胞的扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对重组细胞所描述的特征和优点，同样适用于该饲养层细胞，在此不再赘述。
试剂盒
在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：脐动脉内皮细胞或者前面所述重组细胞或者饲养层细胞。由此，利用根据本发明实施例的试剂盒能够构建造血干细胞微环境，利于造血干细胞的扩增，以及促进多潜能干细胞向HSCs分化或直接重编程体细胞获得HSCs。
根据本发明的实施例，试剂盒用于构建造血干细胞微环境。
根据本发明的实施例，试剂盒用于维持造血干细胞扩增，维持其自我更新。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对造血干细胞扩增的方法所描述的特征和优点，同样适用于该试剂盒，在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
1、分离人脐带血(Umbilical cord blood，UCB)CD34+细胞
将脐带血转入无菌T75细胞培养瓶中，按总体积的三分之一加入红细胞沉降液，充分混匀，自然沉降20-40min，用滴管收集上层血浆层至50ml离心管中，室温2000rpm离心5min后，10ml PBS洗涤一次，用5ml PBS重悬细胞；用密度梯度离心法获得单个核细胞，在15ml离心管中加入5ml外周血淋巴细胞分离液，用滴管将5ml细胞悬液在分离液液面上方1cm处沿离心管壁缓慢加至分离液液面之上，将离心管置于水平离心机中，室温2000rpm离心20min，离心后管内细胞悬液分为四层，用滴管吸取灰白色云雾状细胞层置于50ml离心管，加入PBS洗涤1次后，重悬细胞至1.5ml EP管中，按照CD34Microbeads kit说明书加入CD34分选磁珠于4℃避光旋转孵育40min后，PBS洗涤1次，于磁场中进行CD34+细胞分选。
2、E4orf1-GFP/HuAECs饲养层的制备
(1)筛选稳定转染MSCV-N E4orf1的HuAECs的最佳药物浓度
vWF也称Ⅷ因子相关抗原，是一种由血管内皮细胞合成并分泌的大分子蛋白多聚体，在体内参与血液凝固和血栓的形成，因此常被作为特征因子来鉴定体外培养的内皮细胞。免疫荧光结果(图1)表明，原代培养的HuAECs、脐静脉内皮细胞(HuVECs)和脐肝窦内皮细胞(HFLSECs)的vWF表达阳性。
在体内，血管内皮细胞能够通过迁移和增殖从已存在的血管处以芽生或非芽生的形式进行血管生成，通过预铺matrigel的细胞培养板结合条件培养基，在体外模拟血管生成的管腔形成实验是检测内皮细胞体外生血管能力的一种快速的、可量化的实验方法。实验结果表明，发明人在实验中获得的原代培养的HuVECs、HuAECs和HFLSECs均能在体外培养环境中形成管腔结构(图2)。
与HuVECs相比，HuAECs高表达促进造血干细胞自我更新、维持造血干细胞扩增的关键Notch受体Notch 4基因和配体DLL4基因以及编码重要转录因子CXCR4基因(图3)。
用0.25％胰酶消化HuAECs(HuVECs和HFLSECs，作为对照)，以1×105/孔接种入24孔板中进行培养，16-24h后，替换为分别含有0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml Puromycin的EGM-2基础培养基，最后一孔HuAECs(HuVECs和HFLSECs，作为对照)仍然用不含Puromycin的EGM-2基础培养基培养，作为对照组，在显微镜下观察细胞存活情况。结果显示，在含有0.5μg/ml puromycin的培养条件下，原本贴壁生长的原代培养HuAECs从第2天起开始逐渐变圆，从第3天起逐渐漂浮到培养基中，5天内基本观察不到贴壁生长的细胞，而在1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml puromycin的培养条件下，原代培养的HuAECs从第2天便全部漂浮，药物作用过强，因此，选择0.5μg/ml puromycin为最适药筛浓度。
(2)逆转录病毒包装、细胞转染、药物筛选以及转染后HuAECs流式细胞分选
分别使逆转录病毒包装质粒MSCV-N E4orf1和pMX-GFP，并收集两种毒液，按照1:1的比例同时转染HuAECs，并采用0.5μg/ml Puromycin加压筛选一周。同时，分别以HuVECs和HFLSECs替换HuAECs进行上述操作，作为对照组。
E4orf1/HuAECs能在含有0.5μg/ml Puromycin的培养基中稳定扩增传代，将其转入无血清的EGM-2中进行培养，仍能维持存活且并不增殖(图4)。
分别对E4orf1/HuAECs、E4orf1/HuVECs和E4orf1/HFLSECs细胞进行流式细胞检测。结果如图5所示，E4orf1/HuAECs的内皮细胞表面标志CD144和CD31的阳性率分别为99.9％和93％，而干细胞表面标志CD117、内皮祖细胞表面标志CD133以及血细胞表面标志CD45均低于0.4％，几乎不表达，血管内皮生长因子受体KDR表达率为93.8％，与HuVECs、HFLSECs存在明显差别。
3、E4orf1/HuAECs作为饲养层培养人脐带血来源的CD34+细胞
从脐带血中分离获得CD34+细胞，以5×104/孔接种入E4orf1/HuAECs中，以无饲养层的悬浮培养、脐静脉内皮细胞(E4orf1/HuVECs)和脐肝窦内皮细胞(E4orf1/HFLSECs)作为对照组，以StemSpan培养基(含50ng/ml SCF，50ng/ml Flt-3L，50ng/ml TPO)连续培养14天，当细胞总数超过1×106时，需要将细胞传代至到新的饲养层上继续培养。每3天计数各组中悬浮的有核细胞总数(图6A和B)，分别在E4orf1/HuAECs、E4orf1/HuVECs和E4orf1/HFLSECs作为饲养层的体外扩增体系中，人脐带血来源的CD34+细胞14天内有核细胞总数分别扩增了560倍、336倍和331.5倍，E4orf1/HuAECs的扩增效率是单纯细胞因子悬浮培养组的5.3倍，是E4orf1/HFLSECs和E4orf1/HuVECs组的1.5-2倍(图6C)。
连续培养14天后，用流式细胞术分别检测E4orf1/HuAECs、E4orf1/HuVECs、E4orf1/HuAECs和单纯细胞因子悬浮培养组中CD34+CD90+HSPCs的比率，分别计数各组中CD34+CD90+HSPCs总数。结果表明，在14天内细胞因子单独作用仅促进HSPCs在体外扩增了37.14倍，E4orf1/HFLSECs促进HSPCs扩增了145.72倍，E4orf1/HuVECs促进HSPCs扩增了187.89倍，而E4orf1/HuAECs促进HSPCs体外扩增效率最高，为240.34倍(图7)。
人脐带血来源的CD34+细胞在经过14天的体外扩增后仍具有分化为红系爆式集落形成单位(Burst Forming Unit-Erythroid，BFU-E)、红系集落形成单位(Colony FormingUnit-Erythroid，CFU-E)、粒系集落形成单位(Colony Forming Unit-Granulocyte，CFU-G)、巨核系集落形成单位(Colony Forming Unit-Macrophage，CFU-M)、粒系和巨噬系集落形成单位(Colony Forming Unit-Granulocyte Macrophage，CFU-GM)及红系、粒系、巨核系、巨噬系混合集落形成单位(Colony Forming Unit-Erythroid GranulocyteMacrophage Megakaryocyte，CFU-EGMM)的能力(图8A)。集落形成实验的统计结果显示，E4orf1/HuAECs的效果最佳(图8B)。
为了评估扩增后的HSPCs是否仍具有移植后产生造血细胞的能力，发明人分别收集与E4orf1/HuAECs、E4orf1/HuVECs以及单纯细胞因子悬浮培养14天后的细胞移植入2.5Gy辐照后NSG小鼠体内，移植8周后检测小鼠外周血中人CD45+细胞的比率，结果表明，与E4orf1/HuAECs、E4orf1/HuVECs共培养的HSPCs比单纯细胞因子悬浮培养在小鼠体内能更有效地产生人的CD45+细胞，其中E4orf1/HuAECs组取得的嵌合率最高(图9)。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述脐动脉内皮细胞是以重组细胞的形式提供的，所述重组细胞携带有E4orf1基因以及任选的GFP基因；
任选地，所述脐动脉内皮细胞用作饲养层细胞；
任选地，所述脐动脉内皮细胞用于维持造血干细胞扩增；
任选地，所述脐动脉内皮细胞的血管内皮生长因子受体KDR的表达率为90～95％，内皮细胞标志CD144的表达率均大于99％，内皮细胞标志CD31的表达率为90～95％，干性标志CD117、内皮祖细胞标志CD133以及造血细胞CD45的表达率均低于0.4％；
任选地，所述脐动脉内皮细胞高表达Notch4基因、DLL4基因和Cxcr4基因。
3.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为携带有E4orf1基因的脐动脉内皮细胞。
4.根据权利要求3所述的重组细胞，其特征在于，所述脐动脉内皮细胞携带有GFP基因；
任选地，所述重组细胞用于维持造血干细胞扩增；
任选地，所述重组细胞的血管内皮生长因子受体KDR的表达率为90～95％，内皮细胞标志CD144的表达率均大于99％，内皮细胞标志CD31的表达率为90～95％，干性标志CD117、内皮祖细胞标志CD133以及造血细胞CD45的表达率均低于0.4％；
任选地，所述重组细胞为饲养层细胞；
任选地，所述重组细胞高表达Notch4基因、DLL4基因和Cxcr4基因。
5.一种制备权利要求3或4所述重组细胞的方法，其特征在于，包括：
将携带有E4orf1基因的第一载体加入含有所述脐动脉内皮细胞的第一培养基中，进行培养，以便得到所述重组细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，进一步包括：
分别将所述第一载体和携带有GFP基因的第二载体共同加入所述脐动脉内皮细胞的培养基中，
任选地，所述第一载体为包装有质粒MSCV-N E4orf1的逆转录病毒，并且所述质粒上携带有抗嘌呤霉素基因，
任选地，所述第二载体为包装有质粒pMX-GFP的逆转录病毒，并且所述质粒上携带有抗嘌呤霉素基因；
任选地，所述第一载体和第二载体的体积比为1:1；
任选地，所述第一培养基包括EGM-2基础培养基和0.5μg/ml的嘌呤霉素，且不含有血清及血管内皮细胞生长因子。
7.一种造血干细胞扩增的方法，其特征在于，包括：
按照权利要求5或6所述制备重组细胞的方法获得重组细胞；以及
将造血干细胞接种于含有所述重组细胞的第二培养基中，进行培养，以便使所述造血干细胞扩增；
任选地，所述造血干细胞为CD34+细胞；
任选地，所述第二培养基选自StemSpan培养基，所述StemSpan培养基含有50ng/mlSCF、50ng/ml Flt-3L和50ng/ml TPO，不含有血清及血管内皮细胞生长因子。
8.一种培养基，其特征在于，所述培养基中不含有血清及血管内皮细胞生长因子，适于权利要求3或4所述重组细胞与造血干细胞共培养。
9.一种饲养层细胞，其特征在于，包括权利要求3或4所述的重组细胞。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括：脐动脉内皮细胞或者权利要求3或4所述重组细胞或者权利要求9所述饲养层细胞。
任选地，所述试剂盒用于构建造血干细胞的微环境；
任选地，所述试剂盒用于维持造血干细胞扩增。
CN201810892497.0A 2018-08-07 2018-08-07 脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途 Active CN109182268B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810892497.0A CN109182268B (zh) 2018-08-07 2018-08-07 脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810892497.0A CN109182268B (zh) 2018-08-07 2018-08-07 脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109182268A true CN109182268A (zh) 2019-01-11
CN109182268B CN109182268B (zh) 2022-06-21

Family

ID=64921024

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810892497.0A Active CN109182268B (zh) 2018-08-07 2018-08-07 脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109182268B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113265377A (zh) * 2021-06-11 2021-08-17 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) 一种动脉内皮促进功能性t细胞再生的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102676452A (zh) * 2012-04-26 2012-09-19 天津美德太平洋科技有限公司 一种含人脐带间充质干细胞分泌液的培养基及其制备方法和应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102676452A (zh) * 2012-04-26 2012-09-19 天津美德太平洋科技有限公司 一种含人脐带间充质干细胞分泌液的培养基及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BUTLER等: "Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells", 《CELL STEM CELL》 *
JENNIFER L. GORI ET AL.: "Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells", 《THE JOURNAL FO CLINICAL INVESTIGATION》 *
李慧琳等: "逆转录病毒介导的稳定表达E4orf1和绿色荧光蛋白的胎肝窦内皮细胞株的建立", 《生物技术通讯》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113265377A (zh) * 2021-06-11 2021-08-17 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) 一种动脉内皮促进功能性t细胞再生的方法
CN113265377B (zh) * 2021-06-11 2023-01-24 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) 一种动脉内皮促进功能性t细胞再生的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN109182268B (zh) 2022-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10767161B2 (en) Isolation, expansion and use of clonogenic endothelial progenitor cells
Trkov et al. Micropatterned three‐dimensional hydrogel system to study human endothelial–mesenchymal stem cell interactions
Raic et al. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells
Bagley et al. Extended culture of multipotent hematopoietic progenitors without cytokine augmentation in a novel three-dimensional device
JP2019165732A5 (zh)
CN103937743A (zh) 一种利用三维诱导系统获得造血干细胞的方法
US7833697B2 (en) Endothelial stem cells, populations, methods of isolation and use thereof
CN109689858A (zh) 用于产生具有体内血管形成能力的中胚层和/或内皮集落形成细胞样细胞的方法
WO2009089035A1 (en) Methods and systems for expanding ac133+ cells and directing differentiation
Chitteti et al. Modulation of hematopoietic progenitor cell fate in vitro by varying collagen oligomer matrix stiffness in the presence or absence of osteoblasts
Di Buduo et al. Latest culture techniques: cracking the secrets of bone marrow to mass-produce erythrocytes and platelets ex vivo
US8669106B2 (en) Erythrocytes differentiated in vitro from nanofiber expanded CD133+ cells
Melero‐Martin et al. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis
WO2005123904A1 (ja) 霊長類動物胚性幹細胞からの血管内皮細胞の製造方法
Maslova et al. Enrichment of umbilical cord blood mononuclears with hemopoietic precursors in co-culture with mesenchymal stromal cells from human adipose tissue
Butler et al. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis
CN109182268A (zh) 脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途
CN107922924A (zh) Cd34+cd41暗巨核细胞祖细胞及其用于产生带有前血小板的mk和/或血小板的应用
CN107574143A (zh) 一种从冻存脐血中分离内皮祖细胞的方法
CN108676777A (zh) 胎肝窦内皮细胞株在造血干细胞扩增和分化中的应用
JP4809940B2 (ja) 血液から分離した単核細胞を試験管内で増幅させる方法
WO2011048253A1 (es) Células multipotenciales nestina positivas
Gautrot et al. Biomimetic Artificial Bone Marrow Niches for the Scale Up of Hematopoietic Stem Cells
WO2023286834A1 (ja) 血管内皮増殖因子（ｖｅｇｆ）高発現ペリサイト様細胞
WO2023286832A1 (ja) 血管内皮増殖因子（ｖｅｇｆ）高発現ペリサイト様細胞の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant