CN109164254A - 用于真菌毒素检测的水凝胶微粒的平台搭建及颗粒制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于真菌毒素检测的水凝胶微粒的平台搭建及颗粒制备方法。包括：1)一种用于真菌毒素检测的水凝胶微粒的平台搭建方法；2)利用本发明的平台进行真菌毒素检测的水凝胶微粒制备的方法；3)利用本发明的水凝胶微粒进行真菌毒素检测的方法。利用微流控平台与停止流动光刻技术制备出的连接有真菌毒素适配体的水凝胶微粒颗粒透明，边缘清晰，根据不同掩模板呈现矩形、三角形、圆形等不同形状。可以通过改变透光掩模版的刻蚀形状，精准合成微粒的形状与上面的图案，以实现多种毒素混检时的图形编码功能。水凝胶微粒制备过程简易，缩短了检测所需的准备时间。可以精准控制合成微粒的形状与图案，以实现多种毒素混检时的图形编码功能。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于真菌毒素检测的水凝胶微粒的平台搭建及颗粒制备方法。
背景技术
真菌毒素引起的食品安全问题，一直危害着人民的健康，并且造成了极大的经济损失。真菌毒素是真菌在食品或饲料中生长所产生的次级代谢产物，有极强的生物毒性，具有痕量、毒性强、种类繁多以及多种毒素共存于同一食品等特点，为实际检测带来了前所未有的困难与挑战。目前，国家标准规定食品中真菌毒素的检测方法有气相色谱质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱质谱联用法(HPLC-MS)以及酶联免疫吸附法(ELISA)等。这些方法虽然满足了对检测物的定性定量分析，但无法满足对多种待检物进行编码的需求；而且检测所需仪器庞大、昂贵，不利于向便携式方向发展。
用停止流动光刻技术制备水凝胶微米颗粒，并将其用于真菌毒素的检测。传统的微粒制备技术很难精准的控制合成微粒的形状，在停止流动光刻技术中，只要改变透光掩模版的刻蚀形状，便可以精准的变换微粒的形状与上面的图案。基于此项技术，我们可以以简易的条件开展多种毒素的混检。用图形编码的信息对应待检毒素的信息，编码容量即高，同时图形编码的识别只需要简单的放大与拍照装置便可实施，这会使得真菌毒素检测设备向着更加便携化的方向发展，在食品安全领域具有重大意义。
发明内容
本发明涉及一种用于真菌毒素检测的水凝胶微粒的平台搭建及颗粒制备方法。
利用微流控平台与停止流动光刻技术制备出的连接有真菌毒素完全抗原的水凝胶微粒的特征：矩形，圆形，三角形等。此外，本颗粒制备可以通过改变透光掩模版的刻蚀形状，精准合成微粒的形状与上面的图案，以实现多种毒素混检时的图形编码功能。
本发明的技术方案如下：
一种用于真菌毒素检测的水凝胶微粒的平台搭建方法；制作聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片；利用打孔器打出进样孔与出样孔；另取固化剂与PDMS混合，把处理过的PDMS薄薄一层涂于干净的玻璃载玻片上；将涂有PDMS的载玻片置于烘箱中加热，再将清洗过的带有通道的PDMS芯片置于其上，通道面朝向载玻片一侧压合，过夜烘干黏合；在芯片的进样口及出样口分别插入两个不锈钢接头，接头另一侧与聚乙烯导管相连，其中进样口连接到装有预聚物的注射器，出样口连接到空的离心管；将连有LED驱动器的紫外光源装入荧光倒置显微镜外接光源接口。
利用本发明的平台进行真菌毒素检测的水凝胶微粒制备的方法；步骤如下：
1)将设计好各种形状的图案的透光掩模版安装到荧光倒置显微镜的视场光阑中；
2)准备预聚物溶液：将丙烯酰胺-聚乙二醇700(PEG-DA 700)液体，聚乙二醇200(PEG 200)液体，光引发剂1173，3×TE缓冲液以体积比7：4：1：8的比例混匀，做为预聚物溶液；
3)每100ul预聚物溶液中加入10-30ul的PEG连接链(ACRL-PEG-SCM-2000,60μg/μl)，混匀，2000g离心5-15min；
4)将预聚物注入进样口处的注射器中，将注射器装入注射泵，设定注射速度为500-1000μm/min；
5)开启注射泵，使预聚物充满通道，停止注射泵工作，打开紫外光源曝光50-100ms，形成颗粒后重新开启注射泵将颗粒冲出，重复以上步骤直至获得足够数量的水凝胶颗粒；
6)将收集到的颗粒用1×PBST缓冲液清洗数次，最后重悬于300-1000μl的1×TET缓冲液中，4℃保存待用。
本发明所述的各种形状的图案包括矩形、圆形、三角形或梯形等各种形状。
利用本发明的水凝胶微粒进行真菌毒素检测的方法，其步骤如下：
1)连接完全抗原：取50μl含有水凝胶的缓冲液，加入50-70μl的完全抗原溶液，不同形状的水凝胶连接不同毒素的完全抗原以进行形状编码，室温下混匀，用PBST溶液清洗；
2)封闭：将连接好完全抗原的颗粒离心取沉淀，加入至100μl含有3％-6％BSA的PBST溶液中，过夜封闭；
3)竞争反应：颗粒离心取沉淀，实验组加入一定浓度的真菌毒素(ZEN)，对照组加入等量的PBS溶液，两组均加入1-2.5μl的真菌毒素单抗溶液(40μg/ml)，反应45min-60min，用PBST溶液清洗；
4)连接带有荧光的二抗：将实验组与对照组颗粒离心取沉淀，加入50-100μl连有藻红蛋白的二抗溶液，反应30min，用PBST溶液清洗三次；
5)显微镜下观察颗粒上荧光；反应体系中只有1种形状的颗粒时即为毒素的单检，拥有2种及以上不同形状的颗粒即为毒素的混检；其中不同形状的颗粒代表不同毒素，颗粒上荧光强度与毒素浓度成反比。
具体说明如下：
1)水凝胶微粒的平台搭建及颗粒制备；
2)真菌毒素的高通量混检。
所述的水凝胶微粒的平台搭建及颗粒制备步骤如下：
制作聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片，保存待用；利用打孔器打出进样孔与出样孔；另取固化剂与PDMS混合，把处理过的PDMS薄薄一层涂于干净的玻璃载玻片上；将涂有PDMS的载玻片置于烘箱中加热，再将清洗过的带有通道的PDMS芯片置于其上(通道面朝向载玻片一侧)，轻轻压合，过夜烘干黏合；在芯片的进样口及出样口分别插入两个不锈钢接头，接头另一侧与聚乙烯导管相连，其中进样口连接到装有预聚物的注射器，出样口连接到空的离心管；将连有LED驱动器的紫外光源装入荧光倒置显微镜外接光源接口，调整目镜放大倍数为10×，物镜放大倍数为40×。
水凝胶微粒的制备。
具体应用方法是：
1)将设计好图案的透光掩模版(矩形、圆形、三角形等)安装到荧光倒置显微镜的视场光阑中，调整好位置与角度；
2)准备预聚物溶液：将丙烯酰胺-聚乙二醇700(PEG-DA 700)液体，聚乙二醇200(PEG 200)液体，光引发剂1173，3×TE缓冲液以7：4：1：8的比例混匀，做为预聚物溶液待用；
3)每100ul预聚物溶液中加入10-30ul的PEG连接链(ACRL-PEG-SCM-2000,60μg/μl)，混匀，2000g离心5-15min；
4)将预聚物注入进样口处的注射器中，将注射器装入注射泵，设定注射速度为500-1000μm/min；
5)开启注射泵，使预聚物充满通道，停止注射泵工作，打开紫外光源曝光50-100ms，形成颗粒后重新开启注射泵将颗粒冲出，重复以上步骤直至获得足够数量的水凝胶颗粒；
6)将收集到的颗粒用1×PBST缓冲液清洗数次，最后重悬于300-1000μl的1×TET缓冲液中，4℃保存待用。
真菌毒素的单检与混检：
1)连接完全抗原：取50μl含有水凝胶的缓冲液，加入50-70μl的完全抗原溶液，不同形状的水凝胶(矩形、圆形、三角形)连接不同毒素的完全抗原(BSA-ZEN、BSA-OTA、BSA-AFB1,2mg/ml)以进行形状编码，室温下摇晃3h，用PBST溶液清洗三次；
2)封闭：将连接好完全抗原的颗粒离心取沉淀，加入至100μl含有3％-6％BSA的PBST溶液中，过夜封闭；
3)竞争反应：颗粒离心取沉淀，实验组加入一定浓度的真菌毒素(ZEN)，对照组加入等量的PBS溶液，两组均加入1-2.5μl的真菌毒素单抗溶液(40μg/ml)，反应45min-60min，用PBST溶液清洗三次；
4)连接带有荧光的二抗：将实验组与对照组颗粒离心取沉淀，加入50-100μl连有藻红蛋白的二抗溶液，反应30min，用PBST溶液清洗三次；
5)显微镜下观察颗粒上荧光。反应体系中只有1种形状的颗粒时即为毒素的单检，拥有2种及以上不同形状的颗粒即为毒素的混检。其中不同形状的颗粒代表不同毒素，颗粒上荧光强度与毒素浓度成反比。
本发明涉及一种用于真菌毒素检测的水凝胶微粒的平台搭建及颗粒制备方法。包括：1)一种用于真菌毒素检测的水凝胶微粒的平台搭建方法；2)利用本发明的平台进行真菌毒素检测的水凝胶微粒制备的方法；3)利用本发明的水凝胶微粒进行真菌毒素检测的方法。利用微流控平台与停止流动光刻技术制备出的连接有真菌毒素适配体的水凝胶微粒颗粒透明，边缘清晰，根据不同掩模板呈现矩形、三角形、圆形等不同形状。可以通过改变透光掩模版的刻蚀形状，精准合成微粒的形状与上面的图案，以实现多种毒素混检时的图形编码功能。水凝胶微粒制备过程简易，缩短了检测所需的准备时间。可以精准控制合成微粒的形状与图案，以实现多种毒素混检时的图形编码功能。
附图说明
图1：利用停止流动光刻方法制备的不同形状的水凝胶微粒显微镜明场照片。
图2：利用停止流动光刻方法制备的不同荧光的水凝胶微粒荧光倒置显微镜照片。
图3：利用水凝胶微粒进行真菌毒素检测的荧光倒置显微镜照片(竞争前、竞争后)。
具体实施方式
下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
实施例1：
用于食品毒素检测的水凝胶微粒的制备，具体步骤如下：
1)将设计好图案的透光掩模版(矩形)安装到荧光倒置显微镜的视场光阑中，调整好位置与角度；
2)准备预聚物溶液：将3.5ml PEG-DA 700液体，2ml PEG 200液体，0.5ml光引发剂Darocur 1173液体与4ml的3×TE缓冲液混匀，做为预聚物溶液待用；在预聚物溶液中加入一滴经过过滤的食用色素，混匀，2000g离心5min，待用；
3)水凝胶微粒制备：将预聚物注入进样口处的注射器中，将注射器装入注射泵，设定注射速度为500μm/min；开启注射泵，使预聚物充满通道，停止注射泵工作，打开紫外光源曝光50ms，形成颗粒后重新开启注射泵将颗粒冲出，重复以上步骤直至获得足够数量的水凝胶颗粒；将收集到的颗粒用1×TET缓冲液清洗数次，最后重悬于300μl的1×TET缓冲液中，4℃保存。
实施例2：
用于食品毒素检测的水凝胶微粒的制备，具体步骤如下：
1)将设计好图案的透光掩模版(圆形)安装到荧光倒置显微镜的视场光阑中，调整好位置与角度；
2)准备预聚物溶液：将3.5ml PEG-DA 700液体，2ml PEG 200液体，0.5ml光引发剂Darocur 1173液体与4ml的3×TE缓冲液混匀，做为预聚物溶液待用；在预聚物溶液中加入一滴经过过滤的食用色素，混匀，2000g离心10min，待用；
3)水凝胶微粒制备：将预聚物注入进样口处的注射器中，将注射器装入注射泵，设定注射速度为750μm/min；开启注射泵，使预聚物充满通道，停止注射泵工作，打开紫外光源曝光70ms，形成颗粒后重新开启注射泵将颗粒冲出，重复以上步骤直至获得足够数量的水凝胶颗粒；将收集到的颗粒用1×TET缓冲液清洗数次，最后重悬于500μl的1×TET缓冲液中，4℃保存。
实施例3：
用于食品毒素检测的水凝胶微粒的制备，具体步骤如下：
1)将设计好图案的透光掩模版(三角形)安装到荧光倒置显微镜的视场光阑中，调整好位置与角度；
2)准备预聚物溶液：将3.5ml PEG-DA 700液体，2ml PEG 200液体，0.5ml光引发剂Darocur 1173液体与4ml的3×TE缓冲液混匀，做为预聚物溶液待用；在预聚物溶液中加入一滴经过过滤的食用色素，混匀，2000g离心15min，待用；
3)水凝胶微粒制备：将预聚物注入进样口处的注射器中，将注射器装入注射泵，设定注射速度为1000μm/min；开启注射泵，使预聚物充满通道，停止注射泵工作，打开紫外光源曝光100ms，形成颗粒后重新开启注射泵将颗粒冲出，重复以上步骤直至获得足够数量的水凝胶颗粒；将收集到的颗粒用1×TET缓冲液清洗数次，最后重悬于1000μl的1×TET缓冲液中，4℃保存。
实施例4：
利用水凝胶颗粒进行真菌毒素的检测，具体步骤如下：
1)连接完全抗原：取50μl含有矩形水凝胶的缓冲液，加入50μl的完全抗原溶液(BSA-ZEN,2mg/ml)，室温下摇晃3h，用PBST溶液清洗三次；
2)封闭：将连接好完全抗原的颗粒离心取沉淀，加入至100μl含有3％BSA的PBST溶液中，过夜封闭；
3)竞争反应：颗粒离心取沉淀，实验组加入一定浓度的真菌毒素(ZEN)，对照组加入等量的PBS溶液，两组均加入1μl的真菌毒素单抗溶液(40μg/ml)，反应45min，用PBST溶液清洗三次；
4)连接带有荧光的二抗：将实验组与对照组颗粒离心取沉淀，加入50μl连有藻红蛋白的二抗溶液，反应30min，用PBST溶液清洗三次；
5)显微镜下观察颗粒上荧光。
实施例5：
利用水凝胶颗粒进行真菌毒素的检测，具体步骤如下：
1)连接完全抗原：取50μl含有圆形水凝胶的缓冲液，加入60μl的完全抗原溶液(OTA-ZEN,2mg/ml)，室温下摇晃3h，用PBST溶液清洗三次；
2)封闭：将连接好完全抗原的颗粒离心取沉淀，加入至100μl含有5％BSA的PBST溶液中，过夜封闭；
3)竞争反应：颗粒离心取沉淀，实验组加入一定浓度的真菌毒素(OTA)，对照组加入等量的PBS溶液，两组均加入1.5μl的真菌毒素单抗溶液(40μg/ml)，反应50min，用PBST溶液清洗三次；
4)连接带有荧光的二抗：将实验组与对照组颗粒离心取沉淀，加入75μl连有藻红蛋白的二抗溶液，反应30min，用PBST溶液清洗三次；
5)显微镜下观察颗粒上荧光。
实施例6：
利用水凝胶颗粒进行真菌毒素的检测，具体步骤如下：
1)连接完全抗原：取50μl含有三角形水凝胶的缓冲液，加入70μl的完全抗原溶液(AFB1-ZEN,2mg/ml)，室温下摇晃3h，用PBST溶液清洗三次；
2)封闭：将连接好完全抗原的颗粒离心取沉淀，加入至100μl含有6％BSA的PBST溶液中，过夜封闭；
3)竞争反应：颗粒离心取沉淀，实验组加入一定浓度的真菌毒素(ABF1)，对照组加入等量的PBS溶液，两组均加入2.5μl的真菌毒素单抗溶液(40μg/ml)，反应60min，用PBST溶液清洗三次；
4)连接带有荧光的二抗：将实验组与对照组颗粒离心取沉淀，加入100μl连有藻红蛋白的二抗溶液，反应30min，用PBST溶液清洗三次；
5)显微镜下观察颗粒上荧光。
Claims (4)
1.一种用于真菌毒素检测的水凝胶微粒的平台搭建方法；制作聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片；利用打孔器打出进样孔与出样孔；另取固化剂与PDMS混合，把处理过的PDMS薄薄一层涂于干净的玻璃载玻片上；将涂有PDMS的载玻片置于烘箱中加热，再将清洗过的带有通道的PDMS芯片置于其上，通道面朝向载玻片一侧压合，过夜烘干黏合；在芯片的进样口及出样口分别插入两个不锈钢接头，接头另一侧与聚乙烯导管相连，其中进样口连接到装有预聚物的注射器，出样口连接到空的离心管；将连有LED驱动器的紫外光源装入荧光倒置显微镜外接光源接口。
2.利用权利要求1的平台进行真菌毒素检测的水凝胶微粒的方法；其特征是步骤如下：
1)将设计好各种形状的图案的透光掩模版安装到荧光倒置显微镜的视场光阑中；
2)准备预聚物溶液：将丙烯酰胺-聚乙二醇700(PEG-DA 700)液体，聚乙二醇200(PEG200)液体，光引发剂1173，3×TE缓冲液以体积比7：4：1：8的比例混匀，做为预聚物溶液；
3)每100ul预聚物溶液中加入10-30ul的PEG连接链(ACRL-PEG-SCM-2000,60μg/μl)，混匀，2000g离心5-15min；
4)将预聚物注入进样口处的注射器中，将注射器装入注射泵，设定注射速度为500-1000μm/min；
5)开启注射泵，使预聚物充满通道，停止注射泵工作，打开紫外光源曝光50-100ms，形成颗粒后重新开启注射泵将颗粒冲出，重复以上步骤直至获得足够数量的水凝胶颗粒；
6)将收集到的颗粒用1×PBST缓冲液清洗数次，最后重悬于300-1000μl的1×TET缓冲液中，4℃保存待用。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是各种形状的图案包括矩形、圆形、三角形或梯形。
4.利用权利要求3的水凝胶微粒进行真菌毒素检测的方法，其特征是步骤如下：
1)连接完全抗原：取50μl含有水凝胶的缓冲液，加入50-70μl的完全抗原溶液，不同形状的水凝胶连接不同毒素的完全抗原以进行形状编码，室温下混匀，用PBST溶液清洗；
2)封闭：将连接好完全抗原的颗粒离心取沉淀，加入至100μl含有3％-6％BSA的PBST溶液中，过夜封闭；
3)竞争反应：颗粒离心取沉淀，实验组加入一定浓度的真菌毒素(ZEN)，对照组加入等量的PBS溶液，两组均加入1-2.5μl的真菌毒素单抗溶液(40μg/ml)，反应45min-60min，用PBST溶液清洗；
4)连接带有荧光的二抗：将实验组与对照组颗粒离心取沉淀，加入50-100μl连有藻红蛋白的二抗溶液，反应30min，用PBST溶液清洗三次；
5)显微镜下观察颗粒上荧光；反应体系中只有1种形状的颗粒时即为毒素的单检，拥有2种及以上不同形状的颗粒即为毒素的混检；其中不同形状的颗粒代表不同毒素，颗粒上荧光强度与毒素浓度成反比。
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