CN109161558A - 一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法,包括以下步骤：S1,针对目标miRNA,制备与之对应的连接序列；S2,将S1所述连接序列克隆至克隆载体，以获得启动子‑连接序列‑终止子结构；S3，将用于过表达目标miRNA的茎环结构,导入到S2所述启动子‑连接序列‑终止子结构，以使其具有至少两所述茎环结构；S4，通过双酶切的方式将S3所得的启动子‑连接序列‑终止子结构克隆至双元载体。本发明连接效率高，操作简便易行，并可避免引入不必要的转基因成分，利于单子叶植物miRNA的功能研究，更有利于后续转基因植株的表型观察和结果解释。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法，可用于单子叶植物miRNA功能的研究。
背景技术
植物microRNA(miRNA)是一类长度约为20～24nt的內源性非编码小RNA(smallnon-coding RNA)，可与Argonaute(AGO)蛋白等结合形成RISC复合体(RNA-inducedsilencing complex)，通过直接切割靶基因的mRNA或抑制靶基因的翻译，以及通过切割来源于PHAS位点的转录本产生的大量phasiRNA间接作用于靶基因mRNA，实现对靶基因表达的抑制，进而影响植物生长发育过程，主要包括根的形成、茎和叶的发育、花器官的形成、果实的发育等以及生物和非生物胁迫的响应。
植物miRNA基因的过表达是研究其功能的重要策略之一。目前常用的miRNA过表达方法是将目的miRNA的前体序列克隆到特定启动子驱动的双元载体后再转化目的植物，进而研究miRNA的功能，该方法常用的35S启动子在单子叶植物中表达较弱，对单子叶植物限制较大，部分环节操作难度较大。上述方法还常因目的miRNA表达量的不足而出现过表达植株表型不明显、单酶切连接效率低、容易引入不必要的转基因成分等不足。因此有必要对以上不足加以改进。
发明内容
为克服传统植物miRNA过表达方法存在的目的miRNA表达量的不足而出现过表达植株表型不明显的问题，发明人发现玉米Ubi启动子在单子叶植物组织中高效表达，在双子叶植物中则较弱，基于此提出了一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法，其包括以下步骤：S1,针对目标miRNA,制备与之对应的连接序列；
S2,将S1所述连接序列克隆至克隆载体，以获得启动子-连接序列-终止子结构；
S3，将用于过表达目标miRNA的茎环结构,导入到S2所述启动子-连接序列-终止子结构，以使其具有至少两所述茎环结构；
S4，通过双酶切的方式将S3所得的启动子-连接序列-终止子结构克隆至双元载体。
优选的,在所述启动子-连接序列-终止子结构中，启动子包括Ubi启动子，终止子包括Nos终止子。
优选的,在S2中，所述启动子-连接序列-终止子结构的两端均连接有酶切位点。
优选的,在S2中，所述启动子-连接序列-终止子结构的两端分别连接有PacI酶切位点和MluI酶切位点。
优选的,在S4中，所述启动子-连接序列-终止子结构克隆至双元载体后，其两端分别连接有PacI酶切位点和MluI酶切位点。
优选的,在S3中，通过酶切和连接的方式将所述茎环结构到导入到所述启动子-连接序列-终止子结构中。
优选的，在S2中，所述克隆载体包括pOT2-polycis-UN；在S4中，所述双元载体包括pCAMBIA1390-PM或pFGC5941-PM。
优选的，双酶切所用内切酶为限制性内切酶，并包括PacI内切酶或MluI内切酶。
本发明通过双酶切的方式将启动子-two hit miRNA-终止子这一结构由中间载体克隆到双元载体以用于植物的转化，其中two hit miRNA是指一段可同时表达两个包含目标miRNA茎环结构的序列，连接效率高，操作简便易行，并可避免引入不必要的转基因成分，利于单子叶植物miRNA的功能研究，更有利于后续转基因植株的表型观察和结果解释。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1.克隆载体pOT2-polycis-UN的构建流程图。
图2克隆载体pOT2-polycis-UN图谱。
图3双元载体pCAMBIA1390-PM的构建流程图。
图4双元载体pFGC5941-PM的构建流程图。
图5植物转化用双元载体pCAMBIA1390-PM图谱。
图6植物转化用双元载体pFGC5941-PM图谱。
图7单子叶植物miRNA过表达载体的构建流程。
图8双元载体pCAMBIA1390-two-hit OsamiR444.1、pCAMBIA1390-two-hitOsamiR444.3和pCAMBIA1390-two-hit OsamiR529a的酶切鉴定结果。
图9pCAMBIA1390-two-hit OsamiR444.1的two-hit miRNA过表达结构测序比对结果。
图10pCAMBIA1390-two-hit OsamiR444.3的two-hit miRNA过表达结构测序比对结果。
图11pCAMBIA1390-two-hit OsamiR529a的two-hit miRNA过表达结构测序比对结果。
图12水稻miR444.1、miR444.3和miR529a在野生型植株(WT)以及T0代转基因单株中的表达量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的描述：
作为一种示例，本示例用于单子叶植物的miRNA高效过表达载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)载体的准备
1.1、克隆载体pOT2-polycis-UN：参照图1所示流程，构建单子叶植物高效过表达所需中间载体pOT2-polycis-UN，导入PacI-Ubi启动子以及Nos终止子-MluI这一结构，构建成功的pOT2-polycis-UN的图谱如图2所示。
构建所需引物的序列为：
SmaI-PacI-Ubi-F(TCCCCCGGGTTAATTAAGCATGCCTGCAGTGCAGTGCAGC)(SEQIDNo.2)/HindIII-Ubi-R(CCCAAGCTTGAACTACCGGGCCCTAACCATGG)(SEQ ID N0.3)；
EcoRI-NOS-F(TCGGATCCCTGCTAGAATTCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAG)(Seq IDNo.4)/SpeI-MluI-Nos-R(GGACTAGTCGACGCGTGATCTAGTAACATAGATGACACCG)(SEQ ID No.5)。
上述引物由Invitrogen公司合成，PCR采用Thermo PHUSION高保真酶及其推荐的反应体系和程序；内切酶和连接酶购自NEB公司，采用其推荐的酶切和连接体系进行相关反应。
改造后的克隆载体pOT2-polycis-UN两酶切位点PacI/MluI间的序列信息(包括酶切位点)如SEQ ID No.1所示。
1.2、植物转化用双元载体pCAMBIA1390-PM和pFGC5941-PM：参照图3的流程，通过酶切连接的方法替换pCAMBIA1390-OsNLSCas9载体中的Ubi-OsNLSCas9结构，保留PacI和MluI酶切位点及两酶切位点间的序列SEQ ID No.6以构建pCAMBIA1390-PM双元载体。
参照图4所示的流程，删除多余元件并将包含PacI和MluI酶切位点的序列SEQ IDNo.6导入pFGC5941以构建pFGC5941-PM。
改造后的pCAMBIA1390-PM以及pFGC5941-PM载体图谱如图5和图6所示，两个载体分别含有潮霉素和除草剂Basta抗性基因，可分别用于相关作物的转化。构建所需内切酶和连接酶购自NEB公司，采用其推荐的酶切和连接体系进行相关反应。
(2)基于Ubi启动子的单子叶植物miRNA过表达载体的构建(图7)
2.1、确定目标miRNA并列出其成熟序列以及互补链序列。
如：成熟miRNA1为nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn(SEQ ID No.7)，
其反向互补序列p-miRNA1为NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(SEQ ID No.8)。
2.2、查找表1，用错配率最高的的核苷酸替换p-miRNA1(NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN)(SEQ ID No.8)自3'端起第1和12位(下划线标记处)的核苷酸。
表1.拟南芥中成熟miRNA不同位置碱基与其互补链对应碱基匹配、错配以及形成凸起的概率(％)
| P1 | A | U | G | C |
| U7 a3 c1 g0 _0 | A60 u8 g4 c3 _1 | C3 a1 u1 g0 _0 | G0 u6 a4 _1 c0 | |
| P2 | A | U | G | C |
| U13 a1 c1 g0 _0 | A27 u4 g2 c1 _1 | C35 g0 a0 u0 _0 | G13 u2 a0 c0 _0 | |
| P3 | A | U | G | C |
| U25 a1 c0 g0 _0 | A9 u1 g0 c0 _0 | C43 u4 a0 g0 _0 | G15 u1 a0 c0 _0 | |
| P4 | A | U | G | C |
| U26 c3 a2 _1 g0 | A4 c2 g1 u0 _0 | C22 u5 a1 g1 _0 | G26 u2 a2 c2 _0 | |
| P5 | A | U | G | C |
| U30 c9 a1 _1 g0 | A18 u0 g0 c0 _0 | C13 u5 a0 g0 _0 | G20 u0 a0 c0 _0 | |
| P6 | A | U | G | C |
| U32 a2 c2 g1 _0 | A11 u0 g0 c0 _0 | C21 u2 g1 a0 _0 | G25 u1 a1 c0 _0 | |
| P7 | A | U | G | C |
| U35 a5 _1 c0 g0 | A21 g7 c4 u0 _0 | C11 u3 g1 a0 _0 | G11 u0 a0 c0 _0 | |
| P8 | A | U | G | C |
| U21 a1 g0 c0 _0 | A11 u1 g0 c0 _0 | C33 u14 a1 g1 _0 | G11 a1 u0 c0 _0 | |
| P9 | A | U | G | C |
| U12 a2 g1 c0 _0 | A12 g6 u2 _1 c0 | C35 u3 _3 a2 g0 | G14 u3 a2 c0 _0 | |
| P10 | A | U | G | C |
| U33 a4 g1 c0 _0 | A12 u2 g1 c0 _0 | C22 u9 a2 g0 _0 | G8 u2 _2 a1 c1 | |
| P11 | A | U | G | C |
| U17 a4 g0 c0 _0 | A16 _6 u4 g4 c2 | C16 u5 a4 g1 _0 | G17 c0 u0 a0 _0 | |
| P12 | A | U | G | C |
| U15 g2 _1 c0 a0 | A8 g9 u7 c2 _1 | C25 u14 a0 g0 _0 | G8 c3 a3 u2 _0 | |
| P13 | A | U | G | C |
| U28 c1 g0 a0 _0 | A16 u6 g3 _3 c0 | C18 u13 a1 g0 _0 | G8 c1 u1 a0 _0 | |
| P14 | A | U | G | C |
| U25 g0 c0 a0 _0 | A12 g3 c1 u1 _0 | C23 u3 a0 g0 _0 | G27 a3 c1 u1 _0 | |
| P15 | A | U | G | C |
| U25 g1 c0 a0 _0 | A28 g4 c1u1 _0 | C21 u1 a1 _1 g0 | G11 c0 a0 u0 _0 | |
| P16 | A | U | G | C |
| U18 g2 c1 a0 _0 | A21 _6 g4 c3 u1 | C19 u2 a1 g0 _0 | G18 u2 c1 a1 _0 | |
| P17 | A | U | G | C |
| U19 a2 _1 g0 c0 | A28 g3 _3 c0 u0 | C24 u4 a0 g0 _0 | G16 a1 c0 u0 _0 | |
| P18 | A | U | G | C |
| U16 _2 c1 g0 a0 | A15 g7 c0 u0 _0 | C22 u2 g1 a0 _0 | G35 c0 a0 u0 _0 | |
| P19 | A | U | G | C |
| U11 a3 c1 g0 _0 | A3 g1 c0 u0 _0 | C21 g0 a0 u0 _0 | G57 a2 u1 c0 _0 |
注：①“P(x)”列所示内容为自成熟miRNA5'端起第x(x＝1-19)个位点四种可能的核苷酸，每个“P(x)”的随后一列则显示了互补链对应位置碱基为匹配(大写字母)、错配(小写字母)以及形成凸起(_)的概率；②每个核苷酸后面的数字表示匹配(大写字母)、错配(小写字母)以及形成凸起(_)发生的概率(％)，值越高表明该事件发生的可能性越高。
2.3、设计将用于过表达目标miRNA的茎环结构1(Modu0)通过PCR克隆到pOT2-polycis-UN的Modu0位点的引物：
Modu0-PF-1(GCCATTTAAATGCAGGGATTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNATCGGATCCTCGAGGTGTAAAAAAACTCG)(SEQ ID No.9)/Modu0-PR-1(GCCA TTTAAATAGCCGAATTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNATCCGAGCCCGATGGTGAGACTTTT)(SEQ ID No.10)；
PCR反应体系如下：
PCR反应程序：
2.4、QIAGEN凝胶提取试剂盒纯化回收第2.3步的PCR产物。
2.5、将纯化的PCR产物用SwaI(NEB)酶切，酶切体系如下：
2.6、QIAGEN凝胶提取试剂盒纯化SwaI酶切产物，电泳检测产物质量并估算浓度。
2.7、用T4连接酶(NEB)连接第(2)-6步的产物，连接体系如下：
2.8、将第2.7步的连接产物转化E coli Trans1-T1。
2.9、选择2-3个单克隆测序验证，测序引物如下：PF-2(CGACTCTAGAGGATCCAAGCTT)(SEQ ID No.11)/PR-2(GCCAAATGTTTGAACGATCGAATTC)(SEQ ID No.12)。
2.10、设计并合成用于过表达目标miRNA的第二个茎环结构(Modu4)序列：
CCTAGGAGCTCCACATTTTCATATGACTGTGAGCTGGTGCCACGGATnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnGCTAATGGGGTGTTTAAACCCAGCGTTAGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNATCGGTTGCCCAAGCTGAATAAAAAAAATGACACTCCTACGGGCACGGATCGGTACC(SEQ ID No.13)。
2.11、以AvrII(NEB)和Kpn I(NEB)分别酶切第2.9步所得质粒pOT2-Modu0-miRNA和第2.10步序列，酶切体系如下：
2.12、QIAGEN凝胶提取试剂盒纯化第2.11步的酶切产物，以T4连接酶参照如下体系进行连接反应：
2.13、将第2.12步得到的连接产物转化E coli Trans1-T1。
2.14、选取2-3个单克隆测序检测，测序所用引物为第2.9步中的引物PF-2/PR-2。
2.15、将第2.14步所得质粒pOT2-two-hit-miRNA和双元载体pCAMBIA1390-PM/pFGC5941-PM以PacI(NEB)和MluI-HF(NEB)分别酶切，其中two hit miRNA是指一段可同时表达两个包含目标miRNA茎环结构的序列。酶切体系如下：
2.16、用QIAGEN凝胶提取试剂盒纯化第2.15步所得酶切产物，电泳检测纯化产物的质量并估算浓度。
2.17、用T4连接酶(NEB)连接第2.16步的产物，连接体系如下：
2.18、将第2.17步的连接产物转化E coli Trans1-T1。
2.19、对第2.18步的菌中质粒进行酶切检测，选取阳性克隆测序验证，测序引物为PF-3(GGCATATGCAGCAGCTATATGTGG)(SEQ ID No.14)和PF-4(ATTTAAATGCAGGGATTGG)(SEQID No.15)。
注意事项
1)、PCR的条件和体系因所用高保真酶、个人的操作习惯以及其他实验条件的差异，可能会略有差异，因此有必要先通过预实验进行初步的摸索和熟悉。
2)、整个构建过程中的酶切步骤中，内切酶用量及酶切时间要充足。
3)、PCR及酶切产物要纯化。
4)、连接反应中载体和片段的摩尔比要适宜。
下面应用上述方法结合具体实施例对本发明进行进一步的描述。
设计用于过表达水稻miR444.1、miR444.3和miR529a的Modu0引物：
Modu0OsmiR444.1-PF(GCCATTTAAATGCAGGGATTGGTATGCAGTTCCCACCTCTAGAATCGGATCCTCGAGGTGTAAAAAAACTCG)(SEQ ID No.16)/PR(GCCATTTAAATAGCCAAATTGGTATGCAGTTGCCACCTCTAGCATCCGAGCCCGATGGTGAGACTTTT)(SEQ ID No.17)；
Modu0OsmiR444.3-PF(GCCATTTAAATGCAGGGATTGGGCAGCAAGCGTGAGGCAGCATATCGGATCCTCGAGGTGTAAAAAAACTCG)(SEQ ID No.18)/PR(GCCATTTAAATAGCCAAATTGGGCAGCAAGCTTGAGGCAGCAAATCCGAGCCCGATGGTGAGACTTTT)(SEQ ID No.19)；
Modu0OsmiR529a-PF(GCCATTTAAATGCAGGGATTGGGAAGAAGACAGAGGGTACATATCGGATCCTCGAGGTGTAAAAAAACTCG)(SEQ ID No.20)/PR(GCCATTTAAATAGCCAAATTGGGAAGAAGAGAGAGGGTACAGATCCGAGCCCGATGGTGAGACTTTT)(SEQ ID No.21)。
以上述流程构建pOT2-polycis-UN质粒为模板、采用高保真酶进行PCR扩增，PCR产物经纯化、SwaI酶切、纯化和T4连接，转入大肠杆菌扩繁，筛选阳性克隆测序。选择测序正确的克隆扩繁并提取质粒pOT2-UN-Modu0OsmiR444.1、pOT2-UN-Modu0OsmiR444.3和pOT2-UN-Modu0OsmiR529a，AvrII/KpnI双酶切，纯化备用；设计并合成可过表达水稻miR444.1、miR444.3和miR529a的第二个茎环结构序列Modu4：
Modu4-OsmiR444.1(CCTAGGAGCTCCACATTTTCATATGACTGTGAGCTGGTGCCACGGATGCTAGAGGTGGCAACTGCATAGCTAATGGGGTGTTTAAACCCAGCGTTAGCTATGCAGTTCCCACCTCTAGAATCGGTTGCCCAAGCTGAATAAAAAAAATGACACTCCTACGGGCACGGATCGGTACC)(SEQ ID No.22)；
Modu4-OsmiR444.3(CCTAGGAGCTCCACATTTTCATATGACTGTGAGCTGGTGCCACGGATTTGCTGCCTCAAGCTTGCTGCGCTAATGGGGTGTTTAAACCCAGCGTTAGCGCAGCAAGCGTGAGGCAGCATATCGGTTGCCCAAGCTGAATAAAAAAAATGACACTCCTACGGGCACGGATCGGTACC)(SEQ ID No.23)；
Modu4-OsmiR529a(CCTAGGAGCTCCACATTTTCATATGACTGTGAGCTGGTGCCACGGATCTGTACCCTCTCTCTTCTTCGCTAATGGGGTGTTTAAACCCAGCGTTAGCGAAGAAGACAGAGGGTACATATCGGTTGCCCAAGCTGAATAAAAAAAATGACACTCCTACGGGCACGGATCGGTACC)(SEQ ID No.24)。
AvrII/KpnI双酶切、纯化，以T4连接酶连接纯化后的质粒和片段pOT2-UN-Modu0OsmiR444.1/Modu4-OsmiR444.1、pOT2-UN-Modu0OsmiR444.3/Modu4-OsmiR444.3和pOT2-UN-Modu0OsmiR529a/Modu4-OsmiR529a，转入大肠杆菌扩繁，筛选阳性克隆测序，选择测序正确的克隆扩繁并提取质粒pOT2-two-hit-OsmiR444.1、pOT2-two-hit-OsmiR444.3和pOT2-two-hit-OsmiR529a，和预先准备好的双元载体pFGC5941-PM，以PacI/MluI分别进行双酶切，酶切产物经纯化后，以T4连接酶连接、转入大肠杆菌，挑选阳性克隆2-3个提取质粒，然后以PacI和MluI酶切，酶切产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，均有一条约2.7kb条带，与目的条带的大小基本一致(如图8)，测序验证，结果如图9至图11，正确的克隆pCAMBIA1390-two-hit-OsmiR444.1、pCAMBIA1390-two-hit-OsmiR444.3和pCAMBIA1390-two-hit-OsmiR529a保留用于随后的农杆菌转化以及水稻的侵染。以pCAMBIA1390-two-hitOsamiR444.1、pCAMBIA1390-two-hit OsamiR444.3和pCAMBIA1390-two-hit OsamiR529a分别转化日本晴水稻，选取T0代阳性单株，通过Northern blot检测miRNA444.1、miR444.3和miR529a的表达量，与野生型相比，显著增加(图12)，表明通过本发明所构建的单子叶植株two-hit amiRNA过表达载体可高效地过表达目的miRNA。
需要说明的是，上述的pCAMBIA1390是一个常用的商业化植物双元表达载体；本发明采用双酶切方式与常见的单酶切方式相比连接效率高，自连概率小，改变了单酶切大片段不易连和去磷酸化实验，简化操作。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
上面对本发明专利进行了示例性的描述，显然本发明专利的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明专利的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明专利的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法
<130> WK18-LQF-CN1-1512
<141> 2018-09-19
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2868
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> PacI酶切位点
<220>
<221> misc_feature
<222> (2220)..(2221)
<223> Modu0克隆位置
<220>
<221> misc_feature
<222> (2266)..(2271)
<223> Modu4克隆位置
<220>
<221> misc_feature
<222> (2861)..(2868)
<223> MluI酶切位点
<400> 1
ttaattaagc atgcctgcag tgcagtgcag cgtgacccgg tcgtgcccct ctctagagat 60
aatgagcatt gcatgtctaa gttataaaaa attaccacat attttttttg tcacacttgt 120
ttgaagtgca gtttatctat ctttatacat atatttaaac tttactctac gaataatata 180
atctatagta ctacaataat atcagtgttt tagagaatca tataaatgaa cagttagaca 240
tggtctaaag gacaattgag tattttgaca acaggactct acagttttat ctttttagtg 300
tgcatgtgtt ctcctttttt tttgcaaata gcttcaccta tataatactt catccatttt 360
attagtacat ccatttaggg tttagggtta atggttttta tagactaatt tttttagtac 420
atctatttta ttctatttta gcctctaaat taagaaaact aaaactctat tttagttttt 480
ttatttaata atttagatat aaaatagaat aaaataaagt gactaaaaat taaacaaata 540
ccctttaaga aattaaaaaa actaaggaaa catttttctt gtttcgagta gataatgcca 600
gcctgttaaa cgccgtcgac gagtctaacg gacaccaacc agcgaaccag cagcgtcgcg 660
tcgggccaag cgaagcagac ggcacggcat ctctgtcgct gcctctggac ccctctcgag 720
agttccgctc caccgttgga cttgctccgc tgtcggcatc cagaaattgc gtggcggagc 780
ggcagacgtg agccggcacg gcaggcggcc tcctcctcct ctcacggcac cggcagctac 840
gggggattcc tttcccaccg ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga 900
caccccctcc acaccctctt tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcaca cacacacaac 960
cagatctccc ccaaatccac ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc 1020
cccccccccc ctctctacct tctctagatc ggcgttccgg tccatggtta gggcccggta 1080
gttctacttc tgttcatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc 1140
gttcgtacac ggatgcgacc tgtacgtcag acacgttctg attgctaact tgccagtgtt 1200
tctctttggg gaatcctggg atggctctag ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat 1260
tttttttgtt tcgttgcata gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca atatatgccg 1320
tgcacttgtt tgtcgggtca tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg 1380
tctggttggg cggtcgttct agatcggagt agaattaatt ctgtttcaaa ctacctggtg 1440
gatttattaa ttttggatct gtatgtgtgt gccatacata ttcatagtta cgaattgaag 1500
atgatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt tttactgatg 1560
catatacaga gatgcttttt gttcgcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt tgggcggtcg 1620
ttcattcgtt ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact acctggtgta tttattaatt 1680
ttggaactgt atgtgtgtgt catacatctt catagttacg agtttaagat ggatggaaat 1740
atcgatctag gataggtata catgttgatg tgggttttac tgatgcatat acatgatggc 1800
atatgcagca tctattcata tgctctaacc ttgagtacct atctattata ataaacaagt 1860
atgttttata attattttga tcttgatata cttggatgat ggcatatgca gcagctatat 1920
gtggattttt ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg cttggtactg tttcttttgt 1980
cgatgctcac cctgttgttt ggtgttactt ctgcaggtcg actctagagg atccaagctt 2040
ctctcttctc tttctccata accctgtcta aagggattat tatgatagta gaaaaaatga 2100
ctctcgaacc cgttggcatg ggcccggcac cgtggtcgag aaataaaaaa atcagagtgg 2160
tagcccgagc catgcctagg agctccacat tttcatatga ctgtgagctg gtgccacgga 2220
tcggttgccc aagctgaata aaaaaaatga cactcctacg ggcacggatc ggtaccacgt 2280
ggagattttg atatcactgt gaggatgccc gtgccatgcc atggtgcacc cctaaaaaaa 2340
aaaagtctca ccatcgggct cggatgttta aatcggatcc tcgaggtgta aaaaaactcg 2400
taaatcctat cagatctgga agatttctac gcttctcctt ctttatattc gttttcttat 2460
gctttttatt tttgatataa cctagaaaaa ggttttttat atctttgaat ctgaaattgt 2520
ttgttttaga gtattgtata tctgattttt atcccttttt atatttgaac gttctttagt 2580
ctccttttgt ttgcccaaat gttgaattcg atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct 2640
taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg 2700
ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga 2760
ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact 2820
aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tcacgcgt 2868
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 2
tcccccgggt taattaagca tgcctgcagt gcagtgcagc 40
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 3
cccaagcttg aactaccggg ccctaaccat gg 32
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 4
tcggatccct gctagaattc gatcgttcaa acatttggca ataaag 46
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 5
ggactagtcg acgcgtgatc tagtaacata gatgacaccg 40
<210> 6
<211> 1912
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> PacI酶切位点
<220>
<221> misc_feature
<222> (1905)..(1912)
<223> MluI酶切位点
<400> 6
ttaattaagg gatccaagga atctttaaac atacgaacag atcacttaaa gttcttctga 60
agcaacttaa agttatcagg catgcatgga tcttggagga atcagatgtg cagtcaggga 120
ccatagcaca agacaggcgt cttctactgg tgctaccagc aaatgctgga agccgggaac 180
actgggtacg ttggaaacca cgtgatgtga agaagtaaga taaactgtag gagaaaagca 240
tttcgtagtg ggccatgaag cctttcagga catgtattgc agtatgggcc ggcccattac 300
gcaattggac gacaacaaag actagtatta gtaccacctc ggctatccac atagatcaaa 360
gctgatttaa aagagttgtg cagatgatcc gtggcagttt tagagctaga aatagcaagt 420
taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttg 480
aagatccaag gaatctttaa acatacgaac agatcactta aagttcttct gaagcaactt 540
aaagttatca ggcatgcatg gatcttggag gaatcagatg tgcagtcagg gaccatagca 600
caagacaggc gtcttctact ggtgctacca gcaaatgctg gaagccggga acactgggta 660
cgttggaaac cacgtgatgt gaagaagtaa gataaactgt aggagaaaag catttcgtag 720
tgggccatga agcctttcag gacatgtatt gcagtatggg ccggcccatt acgcaattgg 780
acgacaacaa agactagtat tagtaccacc tcggctatcc acatagatca aagctgattt 840
aaaagagttg tgcagatgat ccgtggcagt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa 900
ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt tgaagatcca 960
aggaatcttt aaacatacga acagatcact taaagttctt ctgaagcaac ttaaagttat 1020
caggcatgca tggatcttgg aggaatcaga tgtgcagtca gggaccatag cacaagacag 1080
gcgtcttcta ctggtgctac cagcaaatgc tggaagccgg gaacactggg tacgttggaa 1140
accacgtgat gtgaagaagt aagataaact gtaggagaaa agcatttcgt agtgggccat 1200
gaagcctttc aggacatgta ttgcagtatg ggccggccca ttacgcaatt ggacgacaac 1260
aaagactagt attagtacca cctcggctat ccacatagat caaagctgat ttaaaagagt 1320
tgtgcagatg atccgtggca gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 1380
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tttgaagatc caaggaatct 1440
ttaaacatac gaacagatca cttaaagttc ttctgaagca acttaaagtt atcaggcatg 1500
catggatctt ggaggaatca gatgtgcagt cagggaccat agcacaagac aggcgtcttc 1560
tactggtgct accagcaaat gctggaagcc gggaacactg ggtacgttgg aaaccacgtg 1620
atgtgaagaa gtaagataaa ctgtaggaga aaagcatttc gtagtgggcc atgaagcctt 1680
tcaggacatg tattgcagta tgggccggcc cattacgcaa ttggacgaca acaaagacta 1740
gtattagtac cacctcggct atccacatag atcaaagctg atttaaaaga gttgtgcaga 1800
tgatccgtgg cagttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca 1860
acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt tttttgaaga tcttcgacgc gt 1912
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> Monocotyledons
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 7
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn n 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> Monocotyledons
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 8
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn n 21
<210> 9
<211> 71
<212> DNA
<213> Monocotyledons
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(42)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 9
gccatttaaa tgcagggatt ggnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnatcggatc ctcgaggtgt 60
aaaaaaactc g 71
<210> 10
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(42)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 10
gccatttaaa tagccgaatt ggnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnatccgagc ccgatggtga 60
gactttt 67
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 11
cgactctaga ggatccaagc tt 22
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 12
gccaaatgtt tgaacgatcg aattc 25
<210> 13
<211> 176
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (99)..(119)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 13
cctaggagct ccacattttc atatgactgt gagctggtgc cacggatnnn nnnnnnnnnn 60
nnnnnnnngc taatggggtg tttaaaccca gcgttagcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnna 120
tcggttgccc aagctgaata aaaaaaatga cactcctacg ggcacggatc ggtacc 176
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 14
ggcatatgca gcagctatat gtgg 24
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 15
atttaaatgc agggattgg 19
<210> 16
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 16
gccatttaaa tgcagggatt ggtatgcagt tcccacctct agaatcggat cctcgaggtg 60
taaaaaaact cg 72
<210> 17
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 17
gccatttaaa tagccaaatt ggtatgcagt tgccacctct agcatccgag cccgatggtg 60
agactttt 68
<210> 18
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 18
gccatttaaa tgcagggatt gggcagcaag cgtgaggcag catatcggat cctcgaggtg 60
taaaaaaact cg 72
<210> 19
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 19
gccatttaaa tagccaaatt gggcagcaag cttgaggcag caaatccgag cccgatggtg 60
agactttt 68
<210> 20
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 20
gccatttaaa tgcagggatt gggaagaaga cagagggtac atatcggatc ctcgaggtgt 60
aaaaaaactc g 71
<210> 21
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 21
gccatttaaa tagccaaatt gggaagaaga gagagggtac agatccgagc ccgatggtga 60
gactttt 67
<210> 22
<211> 176
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 22
cctaggagct ccacattttc atatgactgt gagctggtgc cacggatgct agaggtggca 60
actgcatagc taatggggtg tttaaaccca gcgttagcta tgcagttccc acctctagaa 120
tcggttgccc aagctgaata aaaaaaatga cactcctacg ggcacggatc ggtacc 176
<210> 23
<211> 176
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 23
cctaggagct ccacattttc atatgactgt gagctggtgc cacggatttg ctgcctcaag 60
cttgctgcgc taatggggtg tttaaaccca gcgttagcgc agcaagcgtg aggcagcata 120
tcggttgccc aagctgaata aaaaaaatga cactcctacg ggcacggatc ggtacc 176
<210> 24
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 24
cctaggagct ccacattttc atatgactgt gagctggtgc cacggatctg taccctctct 60
cttcttcgct aatggggtgt ttaaacccag cgttagcgaa gaagacagag ggtacatatc 120
ggttgcccaa gctgaataaa aaaaatgaca ctcctacggg cacggatcgg tacc 174
Claims (8)
1.一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法,其特征在于,包括以下步骤：
S1,针对目标miRNA,制备与之对应的连接序列；
S2,将S1所述连接序列克隆至克隆载体，以获得启动子-连接序列-终止子结构；
S3，将用于过表达目标miRNA的茎环结构,导入到S2所述启动子-连接序列-终止子结构，以使其具有至少两所述茎环结构；
S4，通过双酶切的方式将S3所得的启动子-连接序列-终止子结构克隆至双元载体。
2.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在所述启动子-连接序列-终止子结构中，启动子包括Ubi启动子，终止子包括Nos终止子。
3.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在S2中，所述启动子-连接序列-终止子结构的两端均连接有酶切位点。
4.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在S2中，所述启动子-连接序列-终止子结构的两端分别连接有PacI酶切位点和MluI酶切位点。
5.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在S4中，所述启动子-连接序列-终止子结构克隆至双元载体后，其两端分别连接有PacI酶切位点和MluI酶切位点。
6.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在S3中，通过酶切和连接的方式将所述茎环结构到导入到所述启动子-连接序列-终止子结构中。
7.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在S2中，所述克隆载体包括pOT2-polycis-UN；在S4中，所述双元载体包括pCAMBIA1390-PM或pFGC5941-PM。
8.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在S4中，双酶切所用内切酶为限制性内切酶，并包括PacI内切酶或MluI内切酶。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811093478.8A CN109161558B (zh) | 2018-09-19 | 2018-09-19 | 一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811093478.8A CN109161558B (zh) | 2018-09-19 | 2018-09-19 | 一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法 |
Publications (2)
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| 夏广清: "《RNA干扰与植物生长发育》", 31 October 2013, 吉林大学出版社 * |
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