CN109161535A - 一种提高白腐真菌产木质素降解酶酶活的发酵培养基及其应用 - Google Patents

一种提高白腐真菌产木质素降解酶酶活的发酵培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一种提高白腐真菌产木质素降解酶酶活的发酵培养基。本发明所述发酵培养基在初始发酵培养基中添加锰离子和/或铜离子。本发明通过在常规发酵培养基中添加铜离子和/或锰离子的改进方法，使得白腐真菌发酵所产的木质素降解酶酶活得到明显提高，促进了木质纤维素原料酶降解法的商业化和工业化应用。

Description

一种提高白腐真菌产木质素降解酶酶活的发酵培养基及其 应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种提高白腐真菌产木质素降解酶酶活的发酵培养基及其应用。
背景技术
2017年，我国农业生产中各类秸秆年产量约为10亿吨，这些农业废弃物中蕴含着丰富的可再生资源。充分利用这些秸秆生产饲料、肥料以及生物能源(乙醇、沼气等)是目前秸秆木质纤维素定向生物转化利用的研究热点。
木质纤维素主要成分为纤维素、半纤维素和木质素。制约秸秆高值化综合利用的主要瓶颈是木质纤维素的有效降解。到目前为止，木质素降解方法主要包括物理法、化学法、物理化学法以及生物降解法。其中，生物降解作为绿色环保的木质素处理方法而成为研究热点。生物降解主要有微生物降解法和酶降解法。但是微生物降解方法存在时间长(一般需要21-60天)以及生长条件要求苛刻(无菌，排除外界杂菌的干扰)的问题，因此限制了其在实际生产中的商业化应用。因此，研究人员将重点转移到酶降解上。因此，提高微生物纤维素、半纤维素和木质素降解酶活性成为研究重点。
白腐真菌在微生物中常被用来发酵生产纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶，但是目前的发酵方法所生产的的木质素降解酶酶活较低，这一现象限制了木质纤维素原料酶降解法的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高白腐真菌产木质素降解酶酶活的发酵培养基，使得所述发酵培养基能够明显提高白腐真菌生产的木质素降解酶的酶活；
本发明的另外一个目的在于提供上述发酵培养基在白腐真菌发酵产酶中的相关应用以及利用上述发酵培养基进行白腐真菌产酶的发酵方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种提高白腐真菌产木质素降解酶酶活的发酵培养基，在初始发酵培养基中添加锰离子和/或铜离子。
针对现有白腐真菌发酵培养基所产木质素降解酶酶活较低的问题，本发明在初始发酵培养基基础上添加铜离子和/或锰离子，通过发酵后能够明显提高木质素降解酶酶活，解决了现有技术问题。
作为优选，所述发酵培养基中铜离子的终浓度为0.1mM-0.5mM，所述锰离子的终浓度为0.1mM-0.5mM。在本发明具体实施方式中，所述发酵培养基中铜离子的终浓度为0.2mM，所述锰离子的终浓度为0.2mM；所述铜离子由硫酸铜提供；所述铜离子由硫酸锰提供。
作为优选，本发明还提供了一种初始发酵培养基，包括葡萄糖、苎麻秸秆、(NH4)2SO4、尿素、蛋白胨、KH2PO4、CaCl2、MgSO4、FeSO4、MnSO4、ZnSO4、CoCl2、Tween和水。
进一步优选地，所述发酵培养基为：
葡萄糖0.5-2g/L、苎麻秸秆15-60g/L、(NH4)2SO4 1.1-4.4g/L、尿素0.25-1g/L、蛋白胨0.5-2g/L、KH2PO4 1-4g/L、CaCl2 0.15-0.6g/L、MgSO4 0.04-0.16g/L、FeSO4 0.0025-0.01g/L、MnSO4 0.0008-0.0032g/L、ZnSO4 0.0007-0.0028g/L、CoCl2 0.00185-0.0074g/L、Tween 1-4滴/L，余量水。
在本发明具体实施方式中，所述初始发酵培养基可选择如下之一：
(1)葡萄糖0.5g/L、苎麻秸秆60g/L、(NH4)2SO4 1.1g/L、尿素1g/L、蛋白胨0.5g/L、KH2PO4 4g/L、CaCl2 0.15g/L、MgSO4 0.16g/L、FeSO4 0.0025g/L、MnSO4 0.0032g/L、ZnSO40.0007g/L、CoCl2 0.0074g/L、Tween 1滴/L，余量水；
(2)葡萄糖1g/L、苎麻秸秆30g/L、(NH4)2SO4 2.2g/L、尿素0.5g/L、蛋白胨1g/L、KH2PO42g/L、CaCl2 0.3g/L、MgSO4 0.08g/L、FeSO4 0.005g/L、MnSO4 0.0016g/L、ZnSO40.0014g/L、CoCl2 0.0037g/L、Tween 2滴/L，余量水；
(3)葡萄糖2g/L、苎麻秸秆15g/L、(NH4)2SO4 4.4g/L、尿素0.25g/L、蛋白胨2g/L、KH2PO4 1g/L、CaCl2 0.6g/L、MgSO4 0.04g/L、FeSO4 0.01g/L、MnSO4 0.0008g/L、ZnSO40.0028g/L、CoCl2 0.00185g/L、Tween 4滴/L，余量水；
(4)葡萄糖1.5g/L、苎麻秸秆45g/L、(NH4)2SO4 3g/L、尿素0.5g/L、蛋白胨1.5g/L、KH2PO4 3g/L、CaCl2 0.2g/L、MgSO4 0.1g/L、FeSO4 0.006g/L、MnSO4 0.0025g/L、ZnSO40.001g/L、CoCl2 0.0025g/L、Tween 3滴/L，余量水。
本发明以黑暗或蓝光照射为发酵环境，对比添加铜离子或锰离子对木质素降解酶酶活的影响，结果显示，无论在黑暗还是蓝光照射下，添加了铜离子或锰离子的处理组，能够明显提高木质素降解酶的酶活。
基于上述技术效果，本发明提出了所述发酵培养基在白腐真菌产木质素降解酶中或在制备白腐真菌产木质素降解酶的培养基中的应用。其中，所述白腐真菌为杏鲍菇、平菇、黄孢原毛平革菌以及白囊耙齿菌中的一种或两种以上。其中，杏鲍菇、平菇、黄孢原毛平革菌、白囊耙齿菌均可通过CICC或中国普通微生物菌种保藏管理中心处获得。
根据上述应用，本发明还提供了一种白腐真菌发酵产木质素降解酶的方法，将白腐真菌接种到所述发酵培养基中进行发酵。其中，发酵处于黑暗环境中或蓝光照射环境中，所述发酵的温度为25-30℃。在具体实施过程中温度可以选择为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃，也可在25-30℃范围内波动。
作为优选，所述蓝光为440-470nm蓝光，强度为50-100μmolm-2s-1，在本发明具体实施方式中选择455nm蓝光，强度为80μmolm-2s-1。
由以上技术方案可知，本发明通过在常规发酵培养基中添加铜离子和/或锰离子的改进方法，使得白腐真菌发酵所产的木质素降解酶酶活得到明显提高，促进了木质纤维素原料酶降解法的商业化和工业化应用。
具体实施方式
本发明公开了一种提高白腐真菌产木质素降解酶酶活的发酵培养基及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述发酵培养基及其应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的发酵培养基及其应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在白腐真菌接种发酵培养基之前，一般会先接种至种子培养基活化，制成种子液接种，例如可以采用PDA培养基加葡萄糖作为种子培养基，如下：
配置PDA培养基(取去皮马铃薯200g，切成小块，加1000mL水煮沸20min。滤去马铃薯块，并将滤液补足至1000mL。添加葡萄糖20g，溶化后分装，115℃，灭菌30min)，接种白腐真菌斜面菌种(20-30mm2每块，接种2-3块，150-170r/min，25-30℃摇床上培养1-2天。
本发明还提供了一种种子培养基，即葡萄糖0.5-2g/L、玉米粉15-60g/L、(NH4)2SO41.1-4.4g/L、尿素0.25-1g/L、蛋白胨0.5-2g/L、KH2PO4 1-4g/L、CaCl20.15-0.6g/L、MgSO40.04-0.16g/L、FeSO4 0.0025-0.01g/L、MnSO4 0.0008-0.0032g/L、ZnSO4 0.0007-0.0028g/L、CoCl2 0.00185-0.0074g/L、Tween1-4滴/L，余量水；然后接种白腐真菌斜面菌种(20-30mm2每块，接种2-3块，150-170r/min，25-30℃摇床上培养1-2天。
将所制备的种子液以10-20％的接种量接种至发酵培养基发酵产酶。
在本发明各项对比试验中，各组除去应有的差别外，其余试验环境和材料保持一致。
本发明酶活测定方法采用如下方法检测木质素降解酶(漆酶活性测定法)的酶活：
利用Lac氧化ABTS，用可见-紫外分光光度计测定420nm处0-3min内吸光度值，随时间的变化，从而得知酶反应速率，进而推算酶活。用等体积0.5mmol/L2,2-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTs)溶液和酶液反应，测定反应前3min内420nm处吸光值的增加，每分钟使1umolABTS转化所需的酶量为1个活力单位(U)。
酶活测定所需试剂：0.5mmol/LABTS；0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH＝5.0)以及一定量的粗酶液；
酶活测定步骤：
空白样(4mL):2mL0.2mol/L缓冲液-0.4mLABTS-1.6mL去离子水；
样品(4mL):2mL0.2mol/L缓冲液-0.4mLABTS-1.2mL去离子水-0.4mL酶液用紫外分光光度计检测420nm处吸收值变化，30秒间隔读数，记录210秒内吸收值变化。
酶活计算公式为：
以下就本发明所提供的一种提高白腐真菌产木质素降解酶酶活的发酵培养基及其应用做进一步说明。
实施例1：本发明所述发酵培养基
初始培养基：
(1)葡萄糖0.5g/L、苎麻秸秆60g/L、(NH4)2SO4 1.1g/L、尿素1g/L、蛋白胨0.5g/L、KH2PO4 4g/L、CaCl2 0.15g/L、MgSO4 0.16g/L、FeSO4 0.0025g/L、MnSO4 0.0032g/L、ZnSO40.0007g/L、CoCl2 0.0074g/L、Tween 1滴/L，余量水；
(2)葡萄糖1g/L、苎麻秸秆30g/L、(NH4)2SO4 2.2g/L、尿素0.5g/L、蛋白胨1g/L、KH2PO42g/L、CaCl2 0.3g/L、MgSO4 0.08g/L、FeSO4 0.005g/L、MnSO4 0.0016g/L、ZnSO40.0014g/L、CoCl2 0.0037g/L、Tween 2滴/L，余量水；
(3)葡萄糖2g/L、苎麻秸秆15g/L、(NH4)2SO4 4.4g/L、尿素0.25g/L、蛋白胨2g/L、KH2PO4 1g/L、CaCl2 0.6g/L、MgSO4 0.04g/L、FeSO4 0.01g/L、MnSO4 0.0008g/L、ZnSO40.0028g/L、CoCl2 0.00185g/L、Tween 4滴/L，余量水；
(4)葡萄糖1.5g/L、苎麻秸秆45g/L、(NH4)2SO4 3g/L、尿素0.5g/L、蛋白胨1.5g/L、KH2PO4 3g/L、CaCl2 0.2g/L、MgSO4 0.1g/L、FeSO4 0.006g/L、MnSO4 0.0025g/L、ZnSO40.001g/L、CoCl2 0.0025g/L、Tween 3滴/L，余量水。
在上述初始培养基基础上添加CuSO4至铜离子终浓度为0.1mM-0.5mM或添加MnSO4至锰离子终浓度为0.1mM-0.5mM来实现添加铜离子或锰离子的目的，两者优选为0.2mM。
实施例2：发酵产木质素降解酶酶活对比
采用实施例1初始发酵培养基(2)以及在其基础上添加硫酸铜或硫酸镁进行黑暗或蓝光的发酵产酶试验，其中蓝光为455nm蓝光，强度为80μmol m-2s-1。
分组为黑暗、蓝光、黑暗+锰离子(终浓度0.2mM)、蓝光+锰离子(终浓度0.2mM)、黑暗+铜离子(终浓度0.2mM)以及蓝光+锰离子(终浓度0.2mM)，结果见表1。
表1
由表1可以看出，无论在黑暗环境下还是蓝光环境下，在发酵培养基中增加锰离子或铜离子均可以明显提高木质素降解酶的酶活，其中以在蓝光环境下的酶活最优。此外，本发明更换氯化铜和氯化锰并分别调整终浓度为0.1mM和0.5mM重复上述实验，结果以上述表1结果相一致。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种提高白腐真菌产木质素降解酶酶活的发酵培养基，其特征在于，在初始发酵培养基中添加锰离子和/或铜离子。
2.根据权利要求1所述发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基中铜离子的终浓度为0.1mM-0.5mM，所述锰离子的终浓度为0.1mM-0.5mM。
3.根据权利要求1或2所述发酵培养基，其特征在于，所述铜离子由硫酸铜提供。
4.根据权利要求1或2所述发酵培养基，其特征在于，所述铜离子由硫酸锰提供。
5.根据权利要求1所述发酵培养基，其特征在于，所述初始发酵培养基包括葡萄糖、苎麻秸秆、(NH4)2SO4、尿素、蛋白胨、KH2PO4、CaCl2、MgSO4、FeSO4、MnSO4、ZnSO4、CoCl2、Tween和水。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述发酵培养基为：
葡萄糖0.5-2g/L、苎麻秸秆15-60g/L、(NH4)2SO4 1.1-4.4g/L、尿素0.25-1g/L、蛋白胨0.5-2g/L、KH2PO4 1-4g/L、CaCl2 0.15-0.6g/L、MgSO4 0.04-0.16g/L、FeSO4 0.0025-0.01g/L、MnSO4 0.0008-0.0032g/L、ZnSO4 0.0007-0.0028g/L、CoCl2 0.00185-0.0074g/L、Tween1-4滴/L，余量水。
7.权利要求1-6任意一项所述发酵培养基在白腐真菌产木质素降解酶中或在制备白腐真菌产木质素降解酶的培养基中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述白腐真菌为杏鲍菇、平菇、黄孢原毛平革菌以及白囊耙齿菌中的一种或两种以上。
9.一种白腐真菌发酵产木质素降解酶的方法，其特征在于，将白腐真菌接种到权利要求1-6任意一项所述发酵培养基中进行发酵。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述发酵的温度为25-30℃。
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