CN109154612A

CN109154612A - 生物样品中磷酸化和非磷化形式的rkip的定量评估方法

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Publication number: CN109154612A
Application number: CN201780028383.5A
Authority: CN
Inventors: M·帕帕莱
Original assignee: Freudia Co Ltd
Current assignee: Freudia Co Ltd
Priority date: 2016-03-21
Filing date: 2017-03-21
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2037-03-21
Also published as: US20190154691A1; RU2018136934A; EP3433617A1; AU2017238743A1; EP3433617B1; BR112018069363A2; WO2017163179A1; JP2019511731A; ITUA20161850A1; CA3018653A1; ES2774107T3; CN109154612B; RU2018136934A3

Abstract

用于生物样品中RKIP蛋白和p‑RKIP蛋白的定量测量的方法，其包括以下步骤：a)将下述a1)和a2)共同作用于两种不同的支持物：a1)识别存在于p‑RKIP蛋白中的第一氨基酸序列的抗体，和a2)识别存在于RKIP蛋白中的第一氨基酸序列的抗体；b)向所述两种支持物添加封闭溶液，c)添加所述生物样品；d)在各个支持物中添加：d1)识别存在于p‑RKIP蛋白中的第二氨基酸序列的抗体，和d2)识别存在于RKIP蛋白中的第二氨基酸序列的抗体；所述第一和第二氨基酸序列之一在RKIP和p‑RKIP之间是共同的，而另一个是含有磷酸化的丝氨酸153的序列，因此对于p‑RKIP和RKIP是不同的；e)添加当与识别所述第二氨基酸序列的所述抗体接触时，能够确定与结合所述第二氨基酸序列的所述抗体的量成比例的光学性质变化的标记物；f)测量两种样品的光学性质，并将其与通过测量两个系列的支持物的相同光学性质获得的校准曲线进行比较，在所述两个系列的支持物中已经顺序添加了：i)识别所述系列中第一个的存在于p‑RKIP蛋白中的所述第一氨基酸序列和所述系列中第二个的存在于RKIP蛋白中的所述第一氨基酸序列的抗体；ii)封闭溶液；iii)已知和增加量的重组杂合标准品，其包含所述系列中第一个的存在于p‑RKIP蛋白中的所述第一和第二氨基酸序列和所述系列中第二个的存在于RKIP蛋白中的所述第一和第二氨基酸序列；iv)分别特异性识别存在于p‑RKIP中的所述第二氨基酸序列或存在于RKIP中的所述第二序列的抗体；v)当与识别所述第二氨基酸序列的所述抗体接触时，能够确定与结合所述第二氨基酸序列的所述抗体的量成比例的光学性质变化的标记物。

Description

生物样品中磷酸化和非磷化形式的RKIP的定量评估方法

本发明涉及在尿液或其他生物样品中对磷酸化和非磷酸化形式的被称为RAF激酶抑制剂(RKIP)的蛋白进行单一或组合定量评估的方法。

发明领域

基因组学、蛋白质组学和分子病理学的进步已经产生了许多具有潜在临床价值的生物标记候选物，然而这些没有被更多地常规使用，主要是因为学术研究和生物技术产业研究之间的方法和观点的强烈分离，这限制了它们的协作。

通过pubmed搜索引擎对主要生物体液中描述的生物标记物与市场上现有的测试进行比较分析，可以了解潜在生物标记物的数量与其已开发的投入市场的测试之间存在巨大的差异。通过输入关键词，如生物标记物和血清，有超过一百篇出版物出现在pubmed中，其中超过7000篇是综述。对于尿液也是如此，其在超过21000篇出版物中被描述为用于研究泌尿生殖系统病理生物标记物的理想生物流体，其中约有2800篇是综述。文献中描述的大部分血清和尿液生物标记物具有蛋白质性质(其中关于血清的有超过75000篇原始工作和5000篇综述和关于尿液的有约10000篇原始工作和1400篇综述)。如果仅考虑与癌症相关的血清和尿液生物标记物，则原始科学工作的数量减少至关于血清生物标记物的有约30000篇和关于尿液的有约4500篇。即使这些数字必须被粗略地考虑，因为很明显，对于一些研究较多的生物标记物，有数百篇出版物描述了它们在各个领域中的应用和不同的目的，但令人惊讶的是目前市场上只有100种涉及同样多的肿瘤生物标记物的ELISA测试被批准用于各种肿瘤的诊断、预后和/或预测用途。

最近Powers等人已经强调，与DNA和转录物相比，蛋白质现在仍然代表能够更准确地描述个体的健康和/或病理表型的分子，因为它们是调节细胞过程的最终效应物。

特别地，最近的文献报告了在肿瘤标记物中Raf激酶抑制蛋白(RKIP)的更重要的作用。RKIP在发育年龄期间在许多组织(尤其是睾丸、脑、附睾、肝和肾)中广泛表达。RKIP已被描述为与许多肿瘤相关并且已经被介绍为新一类蛋白质，即转移抑制子，因为其下调通常与转移的主要风险相关。

RKIP减少已在几乎所有肿瘤中被描述，特别是它在前列腺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、黑素瘤、胰岛素瘤、肝细胞癌、间变性甲状腺癌和肾细胞癌中与中长期存活相关并且与复发相关。因此，RKIP被认为是这样的预后生物标记物，其表达水平越低，肿瘤越具攻击性和侵袭性。RKIP能够以非磷酸化的、游离形式或磷酸化形式(其介导其二聚化并还改变其细胞内分子靶标)存在。最近，许多研究人员的注意力转移到RKIP磷酸化形式(p-RKIP)，在某些情况下，其显示出比RKIP非磷酸化形式更高的预后能力。已经对于肺癌、乳腺癌、黑素瘤以及最近对于鼻咽癌描述了这种作用。

到目前为止，产生的研究主要集中在通过主要使用免疫组织化学技术对RKIP和p-RKIP表达水平进行组织评估。即使该技术代表分子诊断中最普及的分析之一，但它也具有一些重要的限制，例如需要通过侵入性分析(例如活组织检查)获得组织，并且通常由于结果的主观解释而具有半定量值，其确定中心之间的变异性。由于对于这项技术而言，即使在全世界的临床中心被广泛接受，仍然需要标准化用于样品制备、分析执行和结果解释的程序，因此显然RKIP和p-RKIP定量配量需要到目前为止尚未提供的不同方法。

ELISA技术(酶联免疫测定)是一种免疫学分析方法，在生物化学中广泛用于通过使用一种或多种抗体检测底物的存在，所述一种或多种抗体中的一种上结合了酶：这种分析方法属于免疫酶学测试并且主要用于免疫学以检测和/或定量样品中蛋白质、抗体或抗原的存在。

与免疫组织化学和细胞荧光测定一样，ELISA能够以高灵敏度和特异性同时分析更多的标记物。存在能够同时测量各种标记物的多蛋白质ELISA测试，其实例是ELISA测试，通过其测量6种标记物的血清水平能够以分别95.3％和99.4％的灵敏度和特异性鉴定卵巢癌。该技术的优点包括其定量性质、执行的快速性和对生物流体的优选应用，这与采样的侵入性较小相关，并且因此患者有更大的接受度。

即使在市场上存在测量RKIP水平的ELISA测试，但它们将细胞蛋白质提取物中的RKIP评估作为主要的使用指征。此外，迄今为止市场上还没有特异于p-RKIP定量配量的ELISA测试。最后，即使许多公司提供可用于磷酸化和非磷酸化形式的特定蛋白质的组合配量的ELISA测试，但市场上没有能够通过该方法同时测量RKIP/p-RKIP的测试。

在现有技术中，存在借助于RKIP和p-RKIP表达蛋白质印迹分析的已知评估实例，然而其具有使其不可重复和/或非定量的限制。

VENERA CARDILE等人“Raf kinase inhibitor protein(RKIP)and phospho-RKIPexpression in melanomas”(ACTA HISTOCHEMICA,vol.115,no 8–2013–p.795-802)描述了第一个实例。在“蛋白质印迹”部分中，其记载了已通过WM35黑素细胞的蛋白质印迹分析、通过使用由兔获得的多克隆抗体并且导致表示为任意光密度单位的非定量值的方法评估RKIP和pRKIP表达。

在WO2011/058136中，描述了一种用于测量生物样品中的蛋白质的方法，其使用能够识别目标表位的校准试剂。在所述方法中，校准试剂包括：含有长度为12至25个氨基酸的目标磷酸化表位的肽；接头(2至10个氨基酸之间的肽)；与阵列结合的载体蛋白。在WO2011/058136中描述的方法中，为了检测标准校准曲线，首先以多种已知浓度将校准试剂与各种阵列孔结合，然后添加与校准试剂相关的第二可检测试剂。然后测量每种浓度的校准试剂的光密度信号。

此时，为了测量生物样品中蛋白质的存在，将一个或多个生物样品与阵列孔结合，并添加抗体，该抗体与待检测的蛋白质相关。然后测量光密度信号并与针对标准曲线测量的光密度进行比较。

刚才描述的方法具有一些技术缺点：事实上，当生物样品直接添加到ELISA微量滴定板中(如所建议的)时，样品中多种蛋白质(其类型和数量未知)的存在决定了在它们之间存在结合到孔表面的竞争。因此，假设将该方法应用于RKIP和p-RKIP配量，每当这些蛋白质相对于其他更多呈现的蛋白质以微量存在于生物样品中时，它们甚至不能与孔结合。无论如何，特别是对于RKIP磷酸化量(p-RKIP)，其通常占RKIP量的少于1％，结合孔的量是如此低以至于该方法不可再现。而且，现有技术中已知的方法具有与交叉反应可能性相关的限制。事实上，在样品中除RKIP和pRKIP之外的蛋白质以及含有与RKIP和p-RKIP中存在的序列非常相似并且被添加到生物样品中用于检测的抗体识别的序列(表位)的蛋白质的假定存在可以产生不能与RKIP和p-RKIP产生的信号区分的一个特定信号。因此，仅一个氨基酸序列的同一性足以产生假阳性。

因此，本发明的目的是提供一种测量生物样品中RKIP蛋白磷酸化形式(p-RKIP)的定量方法。

根据另一个目的，本发明提供了一种用于测量生物样品中磷酸化和非磷酸化形式的RKIP蛋白的定量方法。

根据另一个目的，本发明提供了一种新的ELISA测试，其特异于生物样品中非磷酸化(RKIP)和磷酸化形式(p-RKIP)的RKIP定量配量，以获得每种形式的定量测量和它们之间的比例。

此外，本发明的另一个目的是提供一组标准重组肽，其可用于检测RKIP和p-RKIP的校准曲线，借助于与相同捕获抗体和分别用于待测生物样品中RKIP和p-RKIP检测的相同示踪抗体的结合，从而使方法灵敏度和特异性增加。

此外，本发明提供了一种用于生物样品中RKIP和p-RKIP定量配量的方法，其中实际上没有获得由除RKIP和p-RKIP之外的蛋白质产生的特异性信号的可能性。所提出的方法还允许在添加捕获抗体后选择性地将目标蛋白质结合到ELISA微量滴定板孔中，从而富集样品并且可以再现测量。

此外，根据另一个目的，本发明提供了ELISA测试，其通过单独和/或组合测量RKIP和p-RKIP尿液水平而允许获得肾细胞癌的诊断和/或预后。

本发明实现了预定的目的，因为它是用于生物样品中RKIP蛋白和p-RKIP蛋白的定量测量的方法，其包括以下步骤：

a)将下述a1)和a2)共同作用于两种不同的支持物：a1)识别存在于p-RKIP蛋白中的第一氨基酸序列的抗体，和a2)识别存在于RKIP蛋白中的第一氨基酸序列的抗体；

b)向所述两种支持物添加封闭溶液，

c)添加所述生物样品；

d)在各个支持物中添加：

d1)识别存在于p-RKIP蛋白中的第二氨基酸序列的抗体，和d2)识别存在于RKIP蛋白中的第二氨基酸序列的抗体；所述第一和第二氨基酸序列之一在RKIP和p-RKIP之间是共同的，而另一个是含有磷酸化的丝氨酸153的序列，因此对于p-RKIP和RKIP是不同的；

e)添加当与识别所述第二氨基酸序列的所述抗体接触时，能够确定与结合所述第二氨基酸序列的所述抗体的量成比例的光学性质变化的标记物；

f)测量两种样品的光学性质，并将其与通过测量两个系列的支持物的相同光学性质获得的校准曲线进行比较，在所述两个系列的支持物中已经顺序添加了：

i)识别所述系列中第一个的存在于p-RKIP蛋白中的所述第一氨基酸序列和所述系列中第二个的存在于RKIP蛋白中的所述第一氨基酸序列的抗体；

ii)封闭溶液；

iii)已知和增加量的重组杂合标准品，其包含所述系列中第一个的存在于p-RKIP蛋白中的所述第一和第二氨基酸序列和所述系列中第二个的存在于RKIP蛋白中的所述第一和第二氨基酸序列；

iv)分别特异性识别存在于p-RKIP中的所述第二氨基酸序列或存在于RKIP中的所述第二序列的抗体；

v)当与识别所述第二氨基酸序列的所述抗体接触时，能够确定与结合所述第二氨基酸序列的所述抗体的量成比例的光学性质变化的标记物。

根据第一个优选的实施方案，该方法可以通过使用ELISA微量滴定板实现。

在第二个优选的实施方案中，该方法可以通过侧向流动免疫色谱测定实现。在这种情况下，支持物是色谱盒，将样品添加到盒的一端的吸收纸上，识别所述氨基酸序列中的第一个的抗体共同作用于色谱盒的远离吸收纸的区域中，并且识别所述第二氨基酸序列的抗体位于靠近吸收纸的区域中的色谱表面的部分中。

此外，优选但非限制性地，在使用ELISA微量滴定板的情况下，向识别所述第二氨基酸序列的所述抗体(用于测量生物样品和用于测定校准曲线)可以与结合识别所述第二氨基酸序列的所述抗体的HRP抗体的量成比例地加入特异于所述抗体的HRP缀合抗体和作为当与所述HRP抗体接触时能够确定光学性质变化的标记物的色原体(TMB)。在这种情况下，测量的光学性质是450nm的光密度。

根据另一个实施方案，代替使用HRP缀合的抗体，市场上可获得的具有各种波长的荧光探针，例如Alexa Fluor家族的荧光探针，可以用作识别第二氨基酸序列的抗体的标记物。在这种情况下，通过荧光读数器获得信号检测，并且改变的光学性质是确定波长的荧光。

从本发明的详细描述并参考图1至3，将清楚这些和其他优点。

现在将参考使用ELISA微量滴定板实现的测试来描述第一实施方案。需要重申的是，在不脱离本发明范围的情况下，可以使用不同的支持物进行测试，例如横向流动免疫色谱法(Sajida M等，Journal of Saudi Chemical Society 2015；19(6)689-705)或微流体装置(Sardesai NP，等人，Anal Bioanal Chem.013April；405(11)：3831-3838)。

首先，还要说明下面提到的生物样品优选是尿液，但它可以是其中含有目标分析物的任何其他生物流体(例如血清、血浆、唾液、支气管肺泡液、脑脊液、粪便、精液)或其他生物样品(例如细胞或组织蛋白质提取物或细胞培养基)。

对于以下各种实施方案有效的另一前序部分与用于信号检测的方法相关。在优选的实施方案中，它被认为是与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体和基于添加用于检测的3,3'-5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物的显色方法。预期的是，检测还可以通过化学发光(通过使用例如鲁米诺/H2O2/增强剂系统)或通过化学荧光(通过将抗体与底物例如荧光素、罗丹明、德克萨斯红缀合)进行，或者还可以基于干涉测量传感器的使用，例如Duval等人(Silicon Photonic Based Biosensors:The Future of Lab-on-a-Chip Diagnosticdevices；IEEE PHOTONICS SOCIETY NEWLETTER,August 2012)所描述的那些，而不脱离本发明的范围。

类似地，在不脱离本发明的目的的情况下，可以根据良好技术的标准来定义用于实际实现所描述的实施方案的详细实验过程。仅作为示例的方式，可以使用ELISA微量滴定板与蛋白A或G预共同作用来更稳定地结合捕获抗体。

测量生物样品中的RKIP和p-RKIP量

根据优选的实施方案，待测试的生物样品中的RKIP和p-RKIP定量配量使用在下面定义的捕获抗体(9)中的抗体，所述捕获抗体识别存在于RKIP/p-RKIP共有区域中的表位，优选但非限制性地具有以下报告的氨基酸序列(所附序列表中的Id1)：

DPDAPSRKDPKYRE

将捕获抗体(9)共同作用于ELISA微量滴定板的孔(1)，其中然后加入封闭溶液，其由最佳浓度为1％至5％的BSA、牛奶或胎牛血清组成，其用于饱和结合位点并不允许除捕获抗体识别的分析物之外的分析物的粘附。

随后，引入生物样品以在配量之前获得分析物捕获。事实上要指出的是，先前已将捕获抗体共同作用于ELISA微量滴定板的孔，只有存在于生物样品中并被捕获抗体识别的蛋白质可以被结合。那么它们仅是RKIP和p-RKIP，或含有与RKIP和p-RKIP共有的相同氨基酸序列的蛋白质。类似地，当在生物样品之后添加对RKIP和p-RKIP特异的示踪抗体时(参见以下部分)，它们与RKIP或p-RKIP特异性区域结合。因此，除了目标蛋白质之外的蛋白质绝对不可能产生信号，因为它应该包含捕获抗体识别的确切序列和示踪抗体识别的确切序列，而这对于除了RKIP和p-RKIP之外的蛋白质发生的可能性几乎为零。

然后首先向生物样品中加入分别对RKIP(3)和p-RKIP(6)特异的示踪抗体，并随后加入对RKIP(4)和p-RKIP(7)特异的HRP缀合的抗体。

示踪抗体是特异性识别以蛋白质的非磷酸化形式(对RKIP特异的示踪抗体)或磷酸化形式(对p-RKIP特异的示踪抗体)中存在的序列的抗体。

HRP缀合的抗体与示踪抗体特异性结合，并且与结合的示踪抗体的量成比例，它们通过比色反应改变在孔内测得的吸光度(光密度)。

添加HRP缀合的抗体后，添加色原体(3,3',5,5'-四甲基联苯胺-TMB)，它用作借助于具有如辣根过氧化物酶(HRP)的过氧化物酶作用的酶将过氧化氢还原成水的电子供体。因此，色原体呈蓝色，其密度与每个孔中存在的HRP抗体的量成比例，在通过添加酸(硫酸或盐酸)获得的反应停止后，其变为黄色并且可以在450nm读取吸光度。

将样品的光密度与用于确定校准曲线(参见专门的部分)的孔之一进行比较，可以确定样品中存在的RKIP和p-RKIP蛋白的量。

校准曲线的检测

在下文中，描述了用于检测用于确定RKIP和p-RKIP定量存在的校准曲线的待遵循的程序。

在描述之前，需要给出的是重组杂合肽(或标准品)的定义：用于目标蛋白质的重组杂合肽是这样的肽，其具有：

i)目标蛋白质的保留序列，其能够与对该序列特异的捕获抗体结合；

ii)目标蛋白质的第二序列，其能够含有特定的翻译后修饰，例如磷酸化、乙酰化、糖基化，并且其能够与能够选择性识别是否存在修饰的第二抗体(示踪抗体)结合。

在根据本发明的方法的情况下，示踪抗体将对在RKIP肽链的丝氨酸153上具有或不具有磷酸化的RKIP序列具有特异性。

通过使用两种重组杂合标准品获得校准曲线，其序列报告如下：

RKIP(2)重组杂合标准品：

DPDAPSRKDPKYRE-(接头)-GDHRGKFKVASFRKKYELRA

p-RKIP(5)重组杂合标准品：

DPDAPSRKDPKYRE-(接头)-GDHRGKFKVApSFRKKYELRA

参考所附序列表，RKIP杂合重组标准品具有序列：Id2-接头-Id3，而p-RKIP杂合重组标准品具有序列：Id4-接头-Id5。

因此，两种杂合肽中的每一种都具有：

-共同区域(Id2＝Id4)，其能够与捕获抗体(9)结合；

-接头

-特异区域(Id3和Id5)，其能够在一种情况下与RKIP特异性示踪抗体结合，在另一种情况下与p-RKIP特异性示踪抗体结合。

为了检测校准曲线，将捕获抗体(9)共同作用于ELISA微量滴定板的两个系列的孔(1)中，并且随后用BSA、牛奶或胎牛血清进行孔表面结合位点的封闭。然后加入递增量的RKIP重组杂合标准品(在两个系列孔的一个系列孔中)或p-RKIP重组杂合标准品(在另一个系列孔中)。

捕获抗体(9)将通过共同区域(DPDAPSRKDPKYRE)结合两种重组标准品。

随后两种示踪抗体(一种特异于RKIP，另一种特异于p-RKIP)的添加将允许结合RKIP重组杂合标准品(GDHRGKFKVASFRKKYELRA-序列表中的Id3)和p-RKIP重组杂合标准品(GDHRGKFKVApSFRKKYELRA-序列表中的Id5)的特异区域。

最后，HRP-缀合的抗体和色原体的添加将允许测量对应于每个孔中添加的重组标准品的量的光密度，从而定义标准校准曲线，其中特定光密度与重组标准品的各已知浓度相关。

在结合位点封闭后，将待测试的生物样品(8)加入与抗体(9)共同作用的不同的孔中。在这些孔中，在分别加入RKIP(3)和p-RKIP(6)的示踪抗体、识别RKIP示踪剂(4)和p-RKIP示踪剂(7)的HRP-缀合的抗体和色原体后，将测量光密度，并将通过比较用标准曲线测量的光密度来定义RKIP和p-RKIP浓度。

应注意，在不脱离本发明的领域的情况下，所述方法能够提供所用抗体的倒置，使得两种示踪抗体可以共同作用于孔，从而成为捕获抗体，并且捕获抗体可以用于检测，从而成为示踪抗体。

显然，需要使用合适的HRP缀合抗体。

独立于实现的类型，测试达到提供RKIP和p-RKIP定量测定的目的。据本发明人目前所知，迄今为止，既没有定量测量p-RKIP的免疫酶法测试，也没有同时测量RKIP/p-RKIP水平的测试。

在优选的实施方案中，将该测试应用于尿液样品能够允许肾细胞癌(RCC)的早期诊断和预后，从而基于生物样品内的p-RKIP浓度定义诊断参数和基于RKIP水平定义预后参数。

如果认为RCC诊断通常是偶然事件并且迄今为止仅能够通过进行肾活检进行确定，则该方面非常重要。所提出的发明能够允许简单、快速和微创地进行RCC筛选，从而允许显著拓宽在第一疾病发展阶段中的RCC诊断，从而改善预后和患者预期寿命。更重要的是，在经济学和预防方面，其是针对特定高风险患者类别的测试应用，例如肥胖人群、患有高血压的人和患有晚期肾病的患者，他们仅偶尔进行肾脏超声检查以及早期个体化疾病，而借助于RKIP/p-RKIp测试，他们可以快速获得关于肾细胞癌发生风险和在阳性的情况下关于预后(其诊断越早越有利)的非侵入性指征。只考虑肥胖人群和高血压患者，可能适合筛查的人群将在全世界超过10亿人。此外，最近的文献显示了本发明可能对癌症诊断产生的影响，该文献强调了RKIP和p-RKIP在各种癌症的发生和发展中的更重要的作用，其中包括肺癌(全世界每年超过180万例)、乳腺癌(超过160万例)和结直肠癌(近140万例)。

本发明的目的可用于确定任何类型的细胞和组织中的RKIP和p-RKIP细胞内表达。在这种情况下，唯一的变化是在ELISA微量滴定板的孔(1)中加入其中待测定RKIP和p-RKIP蛋白质的细胞蛋白质提取物作为生物样品。因此，该测试可以被研究人员团队广泛使用，用于表征RKIP和p-RKIP在各种病理学中的功能作用，因为它是一种简单、快速和定量的方法。

特别地，本发明提供了基于尿液样品中p-RKIP蛋白的定量测量诊断透明细胞性肾细胞癌的诊断方法和基于尿液样品中RKIP蛋白的定量测量的透明细胞性肾细胞癌的预后的方法。这两种测量都能够根据上文描述的方法中的任何一种来方便地进行。

透明细胞性肾细胞癌的诊断方法包括以下步骤：

-测量尿液样品中的p-RKIP量；

-如果尿液样品中缺乏p-RKIP，则诊断出透明细胞性肾细胞癌细胞。

如果尿液样品中存在p-RKIP，则诊断为阴性(没有肾癌)。

要明确的是，对于p-RKIP，其在样品中的不存在是指通过使用捕获抗体+示踪抗体+HRP缀合的抗体+TMB根据本发明的方法在测试工作条件下没有可测量的信号(在样品中测量的光密度与在没有生物样品的情况下获得的光密度相当)。

这并不排除通过使用能够放大信号的检测系统(例如链霉抗生物素蛋白-生物素；荧光等)，也可以检测患有透明细胞性肾细胞癌的患者的尿液样品中的p-RKIP的存在。不放大信号下可检测的最小浓度与根据本发明的方法可检测的最小浓度之间的差异总是这样高以使得如果根据本发明的方法没有检测到信号，则患者尿液中的p-RKIP浓度可以被认为等于零。

预测透明细胞性肾细胞癌的发展的预后方法包括以下步骤：

-测量尿液样品中的RKIP量；

-如果RKIP量高于阈值，则推断出有利的预后；

-如果测量的RKIP量低于阈值，则推断出不利的预后。

关于要用作截断值的阈值的确切定义，要明确的是迄今为止不可能为尿液样品中的RKIP含量定义阈值，因为需要进行数千次测量才能确切定义。无论如何，可以确定的是该阈值是能够被定义的，因为尿液样品通常反映肾组织中发生的情况。这在一项工作中被证实，其刚刚被接受在Oncotarget期刊上发表(Urinary RKIP/p-RKIP is a potentialdiagnostic and prognostic marker of clear cell Renal Cell Carcinoma”Papale等人,Oncotarget 2017)，其已显示出透明细胞性肾细胞癌患者中组织表达水平与RKIP和pRKIP尿排泄之间的直接相关性。

Hill B等人(Oncotarget.2014Sep 15；5(17):7406-19,“Common reduction ofthe Raf kinase inhibitory protein in clear cell renal cell carcinoma”)已显示RKIP水平与肾癌进展之间存在线性相关性。通过组织微阵列分析(TMA)，对600多患有透明细胞性肾细胞癌的患者组织进行了分析，它们已经显示出高于260的H评分(通常用于分析TMA实验产生的数据的参数)鉴定正常组织，高于220的评分鉴定RCC的存在，204的评分鉴定原发性转移性RCC的存在和181的评分鉴定长期转移的出现。此外，H评分>204的患者具有通常有利的预后，而H评分<204的患者具有不利的预后(50％的患者死亡)。Papale等人始终使用TMA分析评估了40例透明细胞性肾细胞癌(ccRCC)患者、19例慢性肾病(CKD)患者和5例明显健康组织的肾组织中的RKIP和p-RKIP水平，给出缺失信号的评分＝0，1表示低信号，2表示中等信号，3表示高信号。采用这种方法，所有正常组织的RKIP评分为3，CKD组织的评分为2至3，而只有8/40例ccRCCC的评分为1-2(中-低)，而在其他组织中，检测不到蛋白质。对于p-RKIP也是如此，其在正常组织中非常表达，在CKD中降低并且在所有ccRCC组织中完全不存在，而不依赖于等级、内脏转移的存在、肿瘤的大小和淋巴结受累。

到目前为止，尿液样品通常反映了在肾组织中也能够发现的物质，然而目前的测量技术还不允许普及尿液样品中的RKIP和p-RKIP定量测量。这可以通过根据本发明的方法替代而实现。相反，在现有技术中，仅能够通过免疫印迹获得定量数据，免疫印迹是一种半定量技术，其难度和再现性的限制是众所周知的。

本发明的目的相对于目前市场上可获得的用于pRKIP之外的磷蛋白分析的ELISA测定引入了一些技术创新。事实上，即使主要的生物技术公司(Thermofisher、SigmaAldrich、R&D systems、Raybiotech)最近在市场上推出了特异于于磷蛋白配量的ELISA测试，但在大多数情况下它没有提供参考标准品的使用，因此限制了同一蛋白质的总量和磷酸化形式的同时配量的分析，其通过对于各种待测试的条件用相同体积的细胞提取物装入孔来进行。即使该方法对于在确定的背景下理解磷酸化的靶蛋白量也能够是有用的，但无论如何它不适合于进行生物标记物定量配量。

然而，有公司使用参考标准品：在大多数情况下，标准品由用特定生长因子刺激以获得靶蛋白的磷酸化的细胞提取物组成。经刺激的细胞提取物的系列稀释物用于产生标准参考曲线，然而其不允许蛋白质及其磷酸化形式的绝对定量。

值得强调的是，上文刚刚描述的解决方案的另一个优点在于，现在只有少数公司(其中有NOVEX)已经开发了ELISA测试，其使用相对重组蛋白作为标准品，但是针对有限数量的磷蛋白(约32种)。一个实例是Phospho-ELISA试剂盒TAU[pS199]测试(Novex-Thermofisher，目录号KHB7041)。

这个方面非常重要，因为它突出了并非所有蛋白质存在适合使测试定量的标准品。事实上，并非所有生产重组体的设施都能够提供天然和磷酸化形式两者。

此外，重要的是强调所提出的解决方案的经济优势：重组蛋白的合成比本发明提出的杂合肽的合成更非常耗时且更昂贵(在大肠杆菌中合成任何可能的目标蛋白质的天然蛋白质和磷酸化形式为约7000欧元，相比之下获得约5mg杂合肽和约5mg p-RKIP杂合肽的合成为约1500欧元)。因此，在具有相同的性能下，所提出的方法似乎比现有的解决方案更方便和更有效。

序列表

<110> 弗露迪亚有限责任公司

<120> 生物样品中磷酸化和非磷化形式的RKIP的定量评估方法

<130> I306

<160> 5

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Regione comune RKIP - pRKIP

<400> 1

Asp Pro Asp Ala Pro Ser Arg Lys Asp Pro Lys Tyr Arg Glu

1 5 10

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Standard Ricombinante ibrido RKIP - parte 1

<400> 2

Asp Pro Asp Ala Pro Ser Arg Lys Asp Pro Lys Tyr Arg Glu

1 5 10

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Standard ricombinante ibrido RKIP - parte 2

<400> 3

Gly Asp His Arg Gly Lys Phe Lys Val Ala Ser Phe Arg Lys Lys Tyr

1 5 10 15

Glu Leu Arg Ala

20

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Standard ricombinante ibrido p-RKIP - parte 1

<400> 4

Asp Pro Asp Ala Pro Ser Arg Lys Asp Pro Lys Tyr Arg Glu

1 5 10

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Standard ricombinante ibrido p-RKIP - parte 2

<220>

<221> MOD_RES

<222> 11

<223> PHOSPHORYLATION

<400> 5

Gly Asp His Arg Gly Lys Phe Lys Val Ala Ser Phe Arg Lys Lys Tyr

1 5 10 15

Glu Leu Arg Ala

20

Claims

1.用于生物样品中RKIP蛋白和p-RKIP蛋白的定量测量的方法，其包括以下步骤：

a)将下述a1)和a2)共同作用于两种不同的支持物：

a1)识别存在于p-RKIP蛋白中的第一氨基酸序列的抗体，和

a2)识别存在于RKIP蛋白中的第一氨基酸序列的抗体；

b)向所述两种支持物添加封闭溶液，

c)添加所述生物样品；

d)在各个支持物中添加：

d1)识别存在于p-RKIP蛋白中的第二氨基酸序列的抗体，和

d2)识别存在于RKIP蛋白中的第二氨基酸序列的抗体；

所述第一和第二氨基酸序列之一在RKIP和p-RKIP之间是共同的，而另一个是含有磷酸化的丝氨酸153的序列，因此对于p-RKIP和RKIP是不同的；

ii)封闭溶液；

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述包含存在于p-RKIP蛋白中的所述第一和第二氨基酸序列的重组杂合标准品具有以下报告的氨基酸序列：

DPDAPSRKDPKYRE-(接头)-GDHRGKFKVApSFRKKYELRA。

3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述包含存在于RKIP蛋白中的所述第一和第二氨基酸序列的重组杂合标准品具有以下报告的氨基酸序列：

DPDAPSRKDPKYRE-(接头)-GDHRGKFKVASFRKKYELRA。

4.根据权利要求3的方法，其特征在于，存在于RKIP中的所述第一序列和存在于p-RKIP中的所述第一序列均等同于以下报告的序列：DPDAPSRKDPKYRE。

5.根据权利要求4的方法，其特征在于，存在于RKIP中的所述第二序列为如下：

GDHRGKFKVASFRKKYELRA

而存在于p-RKIP中的所述第二序列为如下：

GDHRGKFKVApSFRKKYELRA。

6.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述支持物是ELISA微量滴定板的孔，在步骤d)之后引入以下步骤：

d3)在各个支持物中添加对识别所述第二氨基酸序列的所述抗体特异的HRP缀合的抗体，

并且在步骤iv)之后，向所述系列的孔添加对识别所述第二氨基酸序列的抗体特异的HRP缀合的抗体，

并且当与识别所述第二氨基酸序列的所述抗体接触时能够确定光学性质变化的所述标记物是TMB，并且所述光学性质是光密度。

7.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述支持物是色谱盒，

所述生物样品被添加到盒的一端，

识别所述第一氨基酸序列的所述抗体共同作用于所述盒的远离吸收纸的区域中，

并且识别所述第二氨基酸序列的所述抗体粘附到靠近吸收纸的区域中的所述盒的色谱表面，

并且当与识别所述第二氨基酸序列的所述抗体接触时能够确定光学性质变化的所述标记物是荧光探针，并且所述光学性质是特定波长的荧光。

8.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述生物样品是尿液、血清、血浆、唾液、支气管肺泡液、脑脊液、粪便、精液、细胞或组织蛋白提取物或细胞培养基中的一种。

9.用于诊断透明细胞性肾细胞癌的诊断方法，其包括以下步骤：

-用根据前述权利要求中任一项的方法测量尿液样品中的p-RKIP的量；

-在尿液样品中缺乏p-RKIP的情况下，诊断出透明细胞性肾细胞癌。

10.预测透明细胞性肾细胞癌的发展的预后方法，其包括以下步骤：

-用根据权利要求1至6中任一项的方法测量尿液样品中的RKIP的量；

-如果RKIP的量高于阈值，则推断出有利的预后；

-如果测量的RKIP的量低于阈值，则推断出不利的预后。