CN109153718A

CN109153718A - 抗TNFα抗体及其功能片段

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Publication number: CN109153718A
Application number: CN201780030453.0A
Authority: CN
Inventors: 迪·贡德; 塞巴斯蒂安·迈耶
Original assignee: Numa Innovation Co Ltd
Current assignee: Numa Innovation Co Ltd; Numab Innovation AG
Priority date: 2016-03-17
Filing date: 2017-03-16
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2037-03-16
Also published as: JP6978427B2; KR102571700B1; KR20180120763A; AU2017235465A1; CA3016870A1; AU2017235465B2; EP3430044A1; CN109153718B; SG11201808041UA; JP2019511223A; US10774140B2; US20190092850A1; WO2017158101A1; IL261793A

Abstract

本发明涉及能够与肿瘤坏死因子α(TNFα)结合的抗体分子及其功能片段，其制备方法及其治疗用途。

Description

抗TNFα抗体及其功能片段

技术领域

发明背景

TNFα是一种同源三聚体促炎细胞因子，由免疫系统细胞释放并与之相互作用。TNFα还被证明在许多人类疾病中上调，包括慢性疾病，例如类风湿性关节炎、克罗恩病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎和多发性硬化症。

已提出了针对TNFα的抗体用于预防和治疗内毒素性休克(Beutler等人，Science,234,470-474,1985)。Bodmer等人(Critical Care Medicine,21,S441-S446,1993)和Wherry等人(Critical Care Medicine,21,S436-S440,1993)讨论了抗TNFα抗体在治疗感染性休克中的治疗潜力。Kirschenbaum等人(Critical Care Medicine,26,1625-1626,1998)也讨论了抗TNFα抗体在治疗感染性休克中的用途。可以使用抗TNFα单克隆抗体有效地治疗胶原蛋白诱导的关节炎(Williams等人(PNAS-USA,89,9784-9788,1992))。

Feldman等人(Transplantation Proceedings,30,4126-4127,1998)、Adorini等人(Trends in Immunology Today,18,209-211,1997)和Feldman等人(Advances inImmunology,64,283-350,1997)讨论了抗TNFα抗体在治疗类风湿性关节炎和克罗恩病中的用途。先前在这种治疗中使用的TNFα抗体通常是嵌合抗体，例如美国专利号5,919,452中所描述的那些。

在现有技术中已经描述了针对TNFα的单克隆抗体。Meager等人(Hybridoma,6,305-311,1987)描述了针对重组TNFα的鼠单克隆抗体。Fendly等人(Hybridoma,6,359-370,1987)描述了使用针对重组TNFα的鼠单克隆抗体来定义TNFα上的中和表位。此外，在国际专利申请WO 92/11383中，公开了TNFα特异性重组抗体，包括CDR移植抗体。Rankin等人(British J.Rheumatology,34,334-342,1995)描述了这种CDR移植抗体在治疗类风湿性关节炎中的用途。美国专利号5,919,452公开了抗TNFα嵌合抗体及其在治疗与TNFα存在相关的病理中的用途。Stephens等人(Immunology,85,668-674,1995)、GB-A-2 246 570、GB-A-2297 145、US 8,673,310、US 2014/0193400、EP 2 390 267 B1、US 8,293,235、US 8,697,074、WO 2009/155723 A2和WO 2006/131013 A2公开了其他的抗TNFα抗体。

与高变区或CDR从中衍生的抗体相比，现有技术的重组抗TNFα抗体分子通常对TNFα的亲和力降低。所有目前市售的TNFα抑制剂均作为推注注射以每周或更长间隔静脉内或皮下施用，导致高起始浓度，所述浓度稳定下降直至下一次注射。

目前批准的抗TNFα生物治疗剂包括(i)英夫利昔单抗(infliximab)，它是一种嵌合IgG抗人单克隆抗体(Wiekowski M等人："Infliximab(Remicade)",Handbook of Therapeutic Antibodies,WILEY-VCH；Weinheim,2007-01-01,p.885-904)；(ii)依那西普(etanercept)，它是一种TNFR2二聚体融合蛋白，具有IgG1Fc(iii)阿达木单抗(adalimumab)，它是一种完整的人单克隆抗体(mAb)(KupperH等人："Adalimumab(Humira)",Handbook of Therapeutic Antibodies,WILEY-VCH；Weinheim,2007-01-01,p.697-732)；(iv)赛妥珠单抗(certolizumab)，它是一种聚乙二醇化Fab片段(Melmed G Y等人："Certolizumab pegol",Nature Reviews.DrugDiscovery,Nature Publishing Group,GB,Vol.7,No.8,2008-08-01,p.641-642)；(v)戈利木单抗(Golimumab)，它是一种人IgG1K单克隆抗体(Mazumdar S等人："Golimumab",mAbs,Landes Bioscience,US,Vol.1,No.5,2009-09-01,p.422-431)。然而，多种生物仿制药正在开发中，并且欧洲已经批准了称为Remsima的英夫利昔单抗的模拟物。

英夫利昔单抗对TNFα的亲和力相对较低(K_D>0.2nM；Weir等人，2006,Therapy 3:535)，并且在L929测定中具有有限的中和效力。此外，英夫利昔单抗与来自食蟹猴(Cynomolgus)或恒河猴(Rhesus)的TNFα基本上没有交叉反应性。然而，对于抗TNFα抗体，非常需要与来自猴子的TNFα有交叉反应性，因为这将允许用灵长类动物进行动物试验，在许多方面反映人类的情况。

依那西普虽然是二价分子，但是它以每个依那西普分子一个三聚体的比例结合TNFα，排除了大抗原-生物治疗复合物的形成(Wallis,2008,Lancet Infect Dis,8:601)。它不抑制单核细胞中LPS诱导的细胞因子分泌(Kirchner等人，2004,Cytokine,28:67)。

赛妥珠单抗的效力略高于英夫利昔单抗的效力，但仍然不令人满意。赛妥珠单抗不抑制MLR中的T细胞增殖(Vos等人，2011,Gastroenterology,140:221)。

EP2623515 A1公开了人源化抗TNFα抗体及其抗原结合片段(Fab)。从所公开的实施例中可以清楚地看出，在L929中和测定中，所得人源化Fab片段的效力与英夫利昔单抗的效力相当(参见表2和5)。测试了交叉反应性的唯一抗TNFα IgG抗体仅与恒河猴TNF-α弱结合(参见[0069]；图3)。未测试与食蟹猴TNFα的交叉反应性。此外，与人TNFβ存在弱结合(见图3)。因此，EP2623515 A1没有公开抑制TNFα诱导的L929细胞凋亡的效力高于英夫利昔单抗并且与恒河猴TNFα和食蟹猴TNFα有交叉反应性的抗TNFα抗体或其功能片段。

WO 2012/007880 A2公开了一种融合蛋白形式的修饰型单结构域抗原结合分子(SDAB)，其包含结合一个或多个靶标的一个或多个单抗原结合结构域(例如TNFα)、接头以及一个或多个聚合物分子。给出的唯一具体实例称为SDAB-01，包括用柔性接头连接的与TNFα结合的两个抗原结合结构域，以及一个支持位点特异性PEG化的C-末端半胱氨酸(见图3)。WO 2012/007880 A2未能比较SDAB-01与已知TNFα抗体如英夫利昔单抗在基于L929细胞的中和测定中的效力，也未能评估其他SDAB-01特异性参数，如阻断TNFα-TNFRI/II相互作用的效力和结合TNFα相对于结合TNFβ的选择性。在一项测定中，在过表达人TNFα的多关节炎转基因小鼠模型中对用SDAB-01和英夫利昔单治疗进行了比较(见第54页，实施例8)，两者似乎在预防关节炎的进一步发展方面同样有效(例如图17和18)。然而，该实施例中给出的剂量是误导性的，因为SDAB-01的分子量小于英夫利昔单抗的分子量的一半。因此，WO2012/007880 A2没有公开具有高于英夫利昔单抗的抑制TNFα诱导的L929细胞凋亡的效力的抗TNFα抗体。

WO 2015/144852 A1研究了抗TNF-α scFv(称为“scFv1”)的性质。该scFv在PK-15细胞测定中显示出了与英夫利昔单抗相当的TNFα中和能力(参见[0236])。此外，scFv似乎与来自恒河猴和食蟹猴的TNF-α有一些交叉反应性(参见实施例8)。在WO 2015/144852 A1中没有报道亲和力数据。然而，已知仅具有中等亲和力(K_D＝157pM；参见Urech等人2010AnnRheum Dis 69:443)的单链抗体片段DLX105(也称为ESBA 105)显示出了比scFv1更好的TNF-α结合(参见WO 2015/144852 A1的图1)。因此，WO 2015/144852 A1未公开对人TNFα具有高亲和力(K_D<125pM)的抗TNF-α抗体。

WO 2015/065987 A1描述了抗TNF-α抗体、抗IL-6抗体和结合两种抗原的双特异性抗体。某些抗TNFα抗体显示出与来自食蟹猴的TNFα的一些交叉反应性(图17)。然而，抗TNFα抗体在L929中和测定中显示出比英夫利昔单抗显著更低的效力(图5)。因此，WO 2015/065987 A1没有公开具有高于英夫利昔单抗的抑制TNFα诱导的L929细胞凋亡的效力的抗TNFα抗体。

Drugs in R&D，第4卷第3号，2003，第174-178页描述了人源化抗体“Humicade”(CDP 571；BAY 103356)，它是一种具有高亲和力的单克隆抗TNFα抗体。然而，Humicade抑制TNFα诱导的L929细胞凋亡的效力似乎是有限的(参见，例如，US 2003/0199679 A1第[0189]段)。因此，该参考文献没有公开具有高于英夫利昔单抗的抑制TNFα诱导的L929细胞凋亡的效力的抗TNFα抗体。

Saldanha J W等人："Molecular Engineering I:Humanization"，Handbook ofTherapeutic Antibodies，第6章，2007-01-01，WILEY-VCH，Weinheim，第119-144页公开了人源化单克隆抗体的不同策略，包括CDR移植、表面重修/贴面、SDR转移和去免疫技术。

需要改进的抗体分子来治疗慢性炎性疾病，例如炎性肠病。抗体分子应该至少具有(i)对人TNFα的高亲和力(即K_D<1nM，特别是<100pM)，(ii)抑制TNFα诱导的L929细胞凋亡的高效力，(iii)抑制LPS诱导的细胞因子分泌的高效力，(iv)对来自食蟹猴和恒河猴的TNFα的显著亲和力(例如K_D<1nM)，和(v)在热解折叠实验中测定的可变结构域的高融解温度(例如，T_m至少为60℃，特别是至少63℃，更特别是至少66℃)。

发明内容

本申请的发明人发现某些抗TNFα抗体及其功能片段表现出两种或更多种有利特性的组合，包括对人TNFα的高亲和力(K_D<1nM，特别是<100pM)、类似于特别是高于英夫利昔单抗的抑制TNFα诱导的L929细胞凋亡的效力、高于阿达木单抗的抑制LPS诱导的细胞因子分泌的效力和/或对来自动物如食蟹猴(Macaca fascicularis)和/或恒河猴(Macacamulatta)的TNFα的基本亲和力(K_D<1nM)。另外，抗体及其功能片段对TNFα具有特异性，因为它们不显著结合TNFβ，并且表现出显著的稳定性，如在可变结构域的热解折叠测定中所测定的。

本发明提供了抗体分子及其功能片段。

因此，本发明涉及以下项目(1)至(47)中定义的主题：

(1)能够与人肿瘤坏死因子α(TNFα)结合的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段包含(i)V_L结构域，其包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述CDR1区具有与SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，所述CDR2区具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，所述CDR3区具有与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，以及(ii)V_H结构域，其包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述CDR1区具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，所述CDR2区具有与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，所述CDR3区具有与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列。

(2)根据项目(1)所述的抗体或功能片段，其中所述抗体或功能片段包含(i)V_L结构域，其包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述CDR1区具有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，所述CDR2区具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，所述CDR3区具有如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，以及(ii)V_H结构域，其包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述CDR1区具有如SEQID NO：9所示的氨基酸序列，所述CDR2区具有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，所述CDR3区具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。

(3)根据前述项目中任一项所述的抗体或功能片段，其中所述抗体或功能片段包含V_H结构域，所述V_H结构域具有选自如SEQ ID NO：12至14所示的氨基酸序列的氨基酸序列。

(4)根据前述项目中任一项所述的抗体或功能片段，其中所述抗体或功能片段包含V_L结构域，所述V_L结构域具有选自如SEQ ID NO：15至17所示的氨基酸序列的氨基酸序列。

(5)根据前述项目中任一项所述的抗体或功能片段，其中所述抗体或其功能片段特异性结合人TNFα。

(6)根据前述项目中任一项所述的抗体或功能片段，其中所述抗体或其功能片段不显著结合TNFβ。

(7)根据前述项目中任一项所述的抗体或功能片段，其中所述抗体或功能片段

(i)与人TNFα结合的解离常数(K_D)小于1nM，特别是小于750pM，更特别是小于100pM；

(ii)与恒河猴TNFα和食蟹猴TNFα交叉反应；

(iii)如通过L929测定所确定的，其抑制TNFα诱导的细胞凋亡的效力是英夫利昔单抗效力的至少10％，特别是比英夫利昔单抗效力更高；和/或

(iv)能够以至少2的化学计量(抗体：TNFα_三聚体)与人TNFα_三聚体结合。

(8)根据前述项目中任一项所述的抗体或功能片段，其与人TNFα结合的K_D小于100pM，特别是小于75pM。

(9)根据前述项目中任一项所述的抗体或功能片段，其与来自恒河猴的TNFα结合的K_D小于1nM。

(10)根据前述项目中任一项所述的抗体或功能片段，其与来自食蟹猴的TNFα结合的K_D小于1nM。

(11)根据前述项目中任一项所述的抗体或功能片段，其中在L929测定中测定的抗体或功能片段抑制TNFα诱导的细胞凋亡的效力相对于英夫利昔单抗的效力(相对效力)大于5，并且其中所述相对效力是L929测定中ng/ml的英夫利昔单抗的IC₅₀值与L929测定中ng/ml的scFv形式的抗体的IC₅₀值的比例。

(12)根据前述项目中任一项所述的抗体或功能片段，其中由差示扫描荧光测定法测定的scFv形式的抗体的可变结构域的融解温度为至少60℃。

(13)根据前述项目中任一项所述的抗体或功能片段，其中由差示扫描荧光测定法测定的scFv形式的抗体的可变结构域的融解温度为至少63℃。

(14)根据前述项目中任一项所述的抗体或功能片段，其中由差示扫描荧光测定法测定的融解温度为至少66℃。

(15)根据前述项目中任一项所述的抗体或功能片段，其中在连续五次冻融循环后，单体含量的损失小于0.2％。

(16)根据前述项目中任一项所述的抗体或功能片段，其中在4℃储存两天，特别是至少一周，更特别是至少两周，最特别是至少四周后，单体含量的损失小于1％。

(17)根据前述项目中任一项所述的抗体或功能片段，其中如在抑制ELISA中所测定的，抗体或功能片段阻断人TNFα和TNF受体I(TNFRI)之间相互作用的效力相对于英夫利昔单抗的效力为至少2，其中所述相对效力是ng/ml的英夫利昔单抗的IC₅₀值与ng/ml的scFv形式的抗体的IC₅₀值的比例。

(18)根据前述项目中任一项所述的抗体或功能片段，其中如在抑制ELISA中所测定的，抗体或功能片段阻断人TNFα和TNF受体II(TNFRII)之间相互作用的效力相对于英夫利昔单抗的效力为至少2，其中所述相对效力是ng/ml的英夫利昔单抗的IC₅₀值与ng/ml的scFv形式的抗体的IC₅₀值的比例。

(19)根据前述项目中任一项所述的抗体或功能片段，其能够在混合淋巴细胞反应中抑制外周血单核细胞的细胞增殖。

(20)根据前述项目中任一项所述的抗体或功能片段，其能够抑制CD14⁺单核细胞中LPS诱导的白细胞介素-1β的分泌。

(21)根据项目(20)所述的抗体或功能片段，其中抑制LPS诱导的白细胞介素-1β的分泌的IC₅₀值小于1nM。

(22)根据项目(21)所述的抗体或功能片段，其中以摩尔计，所述抑制LPS诱导的白细胞介素-1β的分泌的IC₅₀值低于阿达木单抗的IC₅₀值。

(23)根据前述项目中任一项所述的抗体或功能片段，其能够抑制CD14⁺单核细胞中LPS诱导的TNFα的分泌。

(24)根据项目(23)所述的抗体或功能片段，其中抑制LPS诱导的TNFα的分泌的IC₅₀值小于1nM。

(25)根据项目(24)所述的抗体或功能片段，其中以摩尔计，所述抑制LPS诱导的TNFα的分泌的IC₅₀值低于阿达木单抗的IC₅₀值。

(26)根据前述项目中任一项所述的抗体，其是免疫球蛋白G(IgG)。

(27)根据项目(1)至(25)中任一项所述的功能片段，其是单链可变片段(scFv)。

(28)根据项目(27)所述的功能片段，其中所述scFv包含选自如SEQ ID NO：18至20所示的氨基酸序列的氨基酸序列或由其组成，特别是其中所述scFv包含如SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列的氨基酸序列或由其组成。

(29)根据项目(1)至(25)中任一项所述的功能片段，其是双抗体。

(30)一种抗体或其功能片段，其与包含如下V_H结构域和V_L结构域的抗体结合人TNFα上基本上相同的表位，所述V_H结构域具有选自如SEQ ID NO：12至14所示的氨基酸序列的氨基酸序列，特别是如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，所述V_L结构域具有选自如SEQ IDNO：15至17所示的氨基酸序列的氨基酸序列，特别是如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，特别是其中所述抗体或功能片段表现出上文项目(1)至(25)中提到的特征中的一种或多种。

(31)根据前述项目中任一项所述的抗体或功能片段，其中(i)所述抗体或功能片段的可变轻结构域的框架区I至III中与SEQ ID NO：33至35的各自人Vκ1共有序列(参见表6)不同的氨基酸数目，和(ii)所述抗体或功能片段的可变轻结构域的框架区IV中与选自SEQ ID NO：36至39的最相似的基于人λ种系的序列(参见表7)不同的氨基酸数目之和小于7，优选小于4。

(32)根据前述任一项所述的抗体或功能片段，其中所述抗体或功能片段的可变轻结构域的框架区I至III由SEQ ID NO：33至35的人Vκ1共有序列组成，并且框架区IV由选自SEQ ID NO：36至39的基于λ种系的序列组成。

(33)编码根据前述项目中任一项所述的抗体或功能片段的核酸。

(34)包含项目(33)的核酸的载体或质粒。

(35)包含项目(33)的核酸或项目(34)的载体或质粒的细胞。

(36)一种制备根据项目(1)-(32)中任一项所述的抗体或功能片段的方法，其包括在允许表达编码所述抗体或功能片段的核酸的条件下，在培养基中培养根据项目(35)所述的细胞，并从细胞或培养基中回收抗体或功能片段。

(37)一种药物组合物，其包含根据项目(1)至(32)中任一项所述的抗体或功能片段，和任选的药学上可接受的载体和/或赋形剂。

(38)如项目(1)至(32)中任一项所定义的抗体或功能片段，其用于治疗TNFα相关病症或疾病，特别是炎性病症或疾病的方法。

(39)根据项目(38)使用的抗体或功能片段，其中所述TNFα相关病症或疾病选自下文“待治疗的疾病”部分中列出的疾病和病症的列表。

(40)根据项目(38)或(39)使用的抗体或功能片段，其中所述方法包括向受试者口服施用所述抗体或功能片段。

附图简述

图1：人源化过程的示意图。

图2：scFv(2.5g/L)的纯化的人源化scFv制剂的SE-HPLC色谱图。scFv单体在8.5至9.5分钟的保留时间洗脱，而二聚体scFv在约7.8至8.3分钟的保留时间洗脱，并且缓冲组分在>10分钟洗脱。从柱的死体积到相应scFv单体的所有峰均被整合为聚集体/寡聚体并用于计算相对峰面积。

图3：三个scFv构建体的DSF测量的热解折叠曲线。对于每个构建体，均示出了重复测量。将数据拟合到玻尔兹曼方程以获得转变的中点从而确定所得Tm值：16-19-B11-sc01：67.8℃；16-19-B11-sc02：66.4℃；和16-19-B11-sc06：64.6℃。

图4：L929测定中scFv中和人TNFα的效力。示出了scFv和参照抗体英夫利昔单抗的剂量-反应曲线。最高的scFv和英夫利昔单抗浓度以及阴性对照设定为100％和0％的生长。

图5：L929测定中scFv中和非人灵长类动物和人TNFα的效力。示出了中和人、食蟹猴和恒河猴TNFα的剂量-反应曲线。最高的scFv浓度和阴性对照设定为100％和0％的生长。

图6绘出了使用包含抗TNF可变结构域16-19-B11-sc06(特异性(3))的四特异性抗体构建体PRO357测定MATCH形式的TNF结合化学计量。

具体实施方式

本发明涉及能够结合人TNFα的抗体或其功能片段。

在本申请的上下文中，术语“抗体”用作“免疫球蛋白”(Ig)的同义词，其定义为属于IgG、IgM、IgE、IgA或IgD类(或其任意亚类)的蛋白质，并且包括所有常规已知的抗体及其功能片段。在本发明的上下文中，抗体/免疫球蛋白的“功能片段”被定义为亲本抗体的抗原结合片段或其他衍生物，其基本上保持上文项目(1)至(30)中提及的这种亲本抗体的性质中的一种或多种。抗体/免疫球蛋白的“抗原结合片段”被定义为保留抗原结合区的片段(例如IgG的可变区)。抗体的“抗原结合区”通常存在于抗体的一个或多个高变区，即CDR-1、CDR-2和/或CDR-3区中。本发明的“抗原结合片段”包括F(ab’)₂片段和Fab片段的结构域。本发明的“功能片段”包括scFv、dsFv、双抗体、三抗体、四抗体和Fc融合蛋白。可以设计F(ab’)₂或Fab以最小化或完全去除CH1和CL结构域之间发生的分子间二硫键相互作用。本发明的抗体或功能片段可以是双功能构建体或多功能构建体的一部分。例如，抗体或其功能片段可以是包含一个结合特异性的多个拷贝的构建体的形式，例如在二价双抗体、F(ab’)₂或IgG或四价，例如四价四抗体或TandAbs中。或者，抗体或其功能片段可以是包含两个或更多个结合特异性的构建体的一部分，例如在双特异性双抗体或包含两个或更多个特异性的融合蛋白中。最后，抗体或其功能片段可以是多功能构建体的一部分，所述多功能构建体包含一个或多个基于抗体的结合结构域以及一个或多个基于非抗体的功能结构域，所述基于抗体的结合结构域包括根据本发明的抗体或功能片段，所述基于非抗体的功能结构域包括基于非抗体的靶向结构域和效应结构域，例如毒素。

本发明中优选的功能片段是scFv和双抗体。

scFv是单链Fv片段，其中可变轻结构域(“V_L”)和可变重结构域(“V_H”)通过肽桥连接。

双抗体是由两个片段组成的二聚体，每个片段具有通过接头等连接在一起的可变区(下文称为双抗体形成片段)，并通常含有两个V_L和两个V_H。双抗体形成片段包括由V_L和V_H、V_L和V_L、V_H和V_H等组成，优选由V_H和V_L组成的片段。在双抗体形成片段中，连接可变区的接头没有特别限制，但优选足够短以避免同一片段中可变区之间的非共价键。这种接头的长度可以由本领域技术人员适当确定，但通常为2-14个氨基酸，优选3-9个氨基酸，尤其是4-6个氨基酸。在这种情况下，在相同片段上编码的V_L和V_H通过足够短的接头连接，以避免同一链上V_L和V_H之间的非共价键，并避免形成单链可变区片段，使得可以与另一个片段形成二聚体。二聚体可以在双抗体形成片段之间通过共价键或非共价键或者二者形成。

此外，双抗体形成片段可以通过接头等连接以形成单链双抗体(sc(Fv)₂)。通过使用约15-20个氨基酸的长接头连接双抗体形成片段，可以在存在于同一链上的双抗体形成片段之间形成非共价键以形成二聚体。基于与制备双抗体相同的原理，也可以通过连接三个或更多个双抗体形成片段来制备聚合的抗体如三聚体或四聚体。

优选地，本发明的抗体或功能片段特异性地结合TNFα。如本文所用，当抗体或功能片段能够区分人TNFα与一种或多种参照分子时，抗体或其功能片段“特异性地识别”或“特异性地结合”人TNFα。优选地，结合每种参照分子的IC₅₀值比结合TNFα的IC₅₀值大至少1,000倍，特别是如实施例2第2.1.4节中所述。在其最一般的形式中(并且当没有提到确定的参照物)，“特异性结合”是指抗体或功能片段区分人TNFα和不相关生物分子的能力，例如，根据本领域已知的特异性测定方法所确定的。此类方法包括但不限于Western印迹和ELISA测试。例如，可以进行标准ELISA测定。通常，使用一组约三至五个不相关生物分子，例如奶粉、BSA、转铁蛋白等，而非使用单一参照生物分子，来进行结合特异性的确定。在一个实施方案中，特异性结合是指抗体或片段区分人TNFα和人TNFβ的能力。

本发明的抗体或本发明的功能片段包含V_L结构域和V_H结构域。V_L结构域包含CDR1区(CDRL1)、CDR2区(CDRL2)、CDR3区(CDRL3)和框架区。V_H结构域包含CDR1区(CDRH1)、CDR2区(CDRH2)、CDR3区(CDRH3)和框架区。

术语“CDR”是指抗体可变结构域内的六个高变区之一，其主要有助于抗原结合。六种CDR的最常用定义之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication 91-3242提供。如本文所用，Kabat对CDR的定义仅适用于轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3)，以及重链可变结构域的CDR2和CDR3(CDR H2、CDR H3或H2、H3)。然而，如本文所用，重链可变结构域的CDR1(CDR H1或H1)由以下残基(Kabat编号)定义：它从第26位开始并在第36位之前结束。

V_L结构域的CDR1区由与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列组成。优选地，V_L结构域的CDR1区由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：7、SEQID NO：21和SEQ ID NO：22。最优选地，V_L结构域的CDR1区由如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列组成。

V_L结构域的CDR2区由与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列组成。

V_L结构域的CDR3区由与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列组成。优选地，V_L结构域的CDR3区由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：8、SEQID NO：23和SEQ ID NO：24。最优选地，V_L结构域的CDR3区由如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列组成。

V_H结构域的CDR1区由与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列组成。优选地，V_H结构域的CDR1区由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：9、SEQID NO：25和SEQ ID NO：26。最优选地，V_H结构域的CDR1区由如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列组成。

V_H结构域的CDR2区由与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列组成。优选地，V_H结构域的CDR2区由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：10、SEQID NO：27和SEQ ID NO：28。最优选地，V_H结构域的CDR2区由如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列组成。

V_H结构域的CDR3区由与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列组成。优选地，V_H结构域的CDR3区由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：11和SEQID NO：29。最优选地，V_H结构域的CDR3区由如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列组成。

在一个具体实施方案中，本发明的抗体或本发明的功能片段包含(i)V_L结构域，其包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述CDR1区具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，所述CDR2区具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，所述CDR3区具有与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，以及(ii)V_H结构域，其包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述CDR1区具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，所述CDR2区具有与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，所述CDR3区具有与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列。

在一个具体实施方案中，本发明的抗体或本发明的功能片段包含(i)V_L结构域，其包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述CDR1区具有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，所述CDR2区具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，所述CDR3区具有如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，以及(ii)V_H结构域，其包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述CDR1区具有如SEQ IDNO：9所示的氨基酸序列，所述CDR2区具有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，所述CDR3区具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。

在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体或本发明的功能片段包含V_H结构域，所述V_H结构域具有选自SEQ ID NO：12至14所示氨基酸序列的氨基酸序列，特别是SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列。在另一个更优选的实施方案中，所述抗体或功能片段包含V_L结构域，所述V_L结构域具有选自SEQ ID NO：15至17所示氨基酸序列的氨基酸序列，特别是SEQID NO：17所示的氨基酸序列。最优选地，本发明的抗体或本发明的功能片段包含(i)V_H结构域，其具有选自SEQ ID NO：12至14所示氨基酸序列的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，和(ii)V_L结构域，其具有选自SEQ ID NO：15至17所示氨基酸序列的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。

在特别优选的实施方案中，所述功能片段是包含V_H结构域和V_L结构域的单链抗体(scFv)，所述V_H结构域具有选自SEQ ID NO：12至14所示氨基酸序列的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，所述V_L结构域具有选自SEQ ID NO：15至17所示氨基酸序列的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。V_H结构域和V_L结构域优选通过肽接头连接。肽接头(下文中称为“接头A”)的长度通常为约10至约30个氨基酸，更优选约15至约25个氨基酸。接头A通常包含Gly和Ser残基，但也可能包含其他氨基酸。在优选的实施方案中，接头包含序列GGGGS(SEQ ID NO：30)的多个重复，例如SEQ ID NO：31所示氨基酸序列的连续2至6、或3至5或4次重复。最优选地，接头A由如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列组成。scFv可具有以下结构(N末端为左，C末端为右)：

V_L-接头A-V_H；或者

V_H-接头A-V_L。

最优选地，所述功能片段是单链抗体(scFv)，所述单链抗体(scFv)由选自SEQ IDNO：18至20所示氨基酸序列的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列组成。

在另一个特别优选的实施方案中，所述功能片段是包含V_H结构域和V_L结构域的双抗体，所述V_H结构域具有选自SEQ ID NO：12至14所示氨基酸序列的氨基酸序列，特别是SEQID NO：14所示的氨基酸序列，所述V_L结构域具有选自SEQ ID NO：15至17所示氨基酸序列的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。V_H结构域和V_L结构域通过肽接头连接。肽接头(下文中称为“接头B”)的长度优选为约2至约10个氨基酸，更优选约5个氨基酸。接头B通常包含Gly和Ser残基，但也可能包含其他氨基酸。最优选地，接头B由如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列组成。

双抗体优选是双特异性双抗体，即它针对两个表位。双抗体优选是同型二聚体。双抗体可以是两条多肽链的异二聚体，它们彼此非共价结合。两个单体链可以是具有以下结构的多肽链(*表示第二种特异性)：

V_L-接头B-V_H*和V_L*-接头B-V_H；

V_H-接头B-V_L*、V_H*-接头B-V_L；

V_L-接头B-V_L*和V_H*-接头B-V_H；或者

V_L*-接头B-VL和V_H-接头B-V_H*。

此外，双抗体形成片段可以通过接头A等连接以形成单链双抗体(sc(Fv)₂)。通过使用约15-20个氨基酸的长接头连接双抗体形成片段，可以在存在于同一链上的双抗体形成片段之间形成非共价键以形成二聚体。单链双抗体的排列的实例包括以下：

V_H-接头B–V_L*-接头A-V_H接头B-V_L

V_L-接头B-V_H-接头A-V_L-接头B-V_H

优选地，本发明的双抗体具有以下结构：

V_L-接头B-V_H-接头A-V_L-接头B-V_H

优选地，接头B由SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列组成，和/或接头A由SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列组成。最优选地，接头B由SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列组成，并且接头A由SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列组成。

基于与制备双抗体相同的原理，也可以通过连接三个或更多个双抗体形成片段来制备聚合的抗体如三聚体或四聚体。

在另一个具体实施方案中，本发明的抗体是免疫球蛋白，优选免疫球蛋白G(IgG)。本发明的IgG的亚类不受限制，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。优选地，本发明的IgG属于亚类1，即它是IgG1分子。

亲和力

本发明的抗体或功能片段对人TNFα具有高亲和力。术语“K_D”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本发明的抗体或功能片段与人TNFα结合的解离平衡常数(K_D)小于约2×10^-10M，优选小于1×10^-10M，优选小于5×10^-11M，或甚至更低，例如，如在BIACORE仪器中使用表面等离子体共振(SPR)技术所确定的。具体地，如实施例2第2.1.1节中所述进行K_D的测定。

对来自食蟹猴或恒河猴的TNFα的交叉反应性

在具体的实施方案中，本发明的抗体或功能片段对来自动物例如食蟹猴(Macacafascicularis)和/或恒河猴(Macaca mulatta)的TNFα具有显著的亲和力。这是有利的，因为优选用这些动物进行抗人TNFα抗体的临床前试验，例如毒性研究。因此，本发明的抗体或功能片段优选与来自动物如食蟹猴和/或恒河猴的TNFα交叉反应。如实施例2第2.1.1节中所述进行亲和性测量。

在一个实施方案中，本发明的抗体或功能片段与来自食蟹猴的TNFα交叉反应。优选地，本发明的抗体或功能片段对食蟹猴TNFα的亲和力比对人TNFα的亲和力低20倍，特别是低10倍，甚至更特别是低5倍。通常，本发明的抗体或功能片段以一个解离平衡常数(K_D)与来自食蟹猴的TNFα结合，其中(i)与食蟹猴TNFα结合的K_D与(ii)与人TNFα结合的K_D的比例R_食蟹猴小于20。

R_食蟹猴优选小于20，特别是小于10，甚至更特别地小于5。

在另一个实施方案中，本发明的抗体或功能片段与来自恒河猴的TNFα交叉反应。优选地，本发明的抗体或功能片段对恒河猴TNFα的亲和力比对人TNFα的亲和力低20倍，更特别是低10倍。通常，本发明的抗体或功能片段以一个解离平衡常数(K_D)与来自恒河猴的TNFα结合，其中(i)与恒河猴TNFα结合的K_D与(ii)与人TNFα结合的K_D的比例R_恒河猴小于20。

R_恒河猴优选小于20，特别是小于10。

在另一个实施方案中，本发明的抗体或功能片段与来自食蟹猴的TNFα和与来自恒河猴的TNFα交叉反应。优选地，本发明的抗体或功能片段对食蟹猴TNFα的亲和力比对人TNFα的亲和力低20倍，特别是低10倍，甚至更特别是低5倍，并且优选地，其对恒河猴TNFα的亲和力比对人TNFα的亲和力低20倍，更特别是低10倍。抗体或功能片段的比例R_食蟹猴优选小于20，特别是小于10，甚至更特别地小于5，并且抗体或功能片段的比例R_恒河猴优选小于20，特别是小于10。

抑制TNFα诱导的L929细胞凋亡的效力

本发明的抗体或功能片段具有抑制TNFα诱导的L929细胞凋亡的高效力，其为已知抗体英夫利昔单抗的效力的至少10％。在一个具体实施方案中，本发明的抗体或功能片段抑制TNFα诱导的L929细胞凋亡的效力大于英夫利昔单抗的效力。

相对于英夫利昔单抗的效力可以如本申请实施例2第2.1.2节所述在L929测定中测定。本发明的抗体或功能片段的相对效力是英夫利昔单抗效力的至少10％，特别是大于英夫利昔单抗的效力，优选大于1.5，优选大于2，更优选大于3，更优选大于5，更优选大于7.5，或甚至大于10，其中相对效力是(i)L929测定中英夫利昔单抗的IC₅₀值与(ii)L929测定中本发明的抗体或功能片段的IC₅₀值的比例，并且其中IC₅₀表示达到TNFα诱导的L929细胞凋亡的最大抑制的50％所必需的相应分子的浓度，以ng/mL计。

在另一个实施方案中，本发明的抗体或功能片段的相对效力是英夫利昔单抗效力的至少10％，特别是大于英夫利昔单抗的效力，优选大于1.5，优选大于2，更优选大于3，更优选大于5，更优选大于7.5，或甚至大于10，其中相对效力是(i)L929测定中英夫利昔单抗的IC₉₀值与(ii)L929测定中本发明的抗体或功能片段的IC₉₀值的比例，并且其中IC₉₀值表示达到TNFα诱导的L929细胞凋亡的最大抑制的90％所必需的相应分子的浓度，以ng/mL计。

LPS诱导的细胞因子分泌的抑制

通常，本发明的抗体或功能片段能够抑制单核细胞中LPS诱导的细胞因子分泌。单核细胞中LPS诱导的细胞因子分泌可以如实施例7中所述测定。

在一个实施方案中，本发明的抗体或功能片段能够抑制CD14⁺单核细胞中LPS诱导的白细胞介素-1β的分泌。用于抑制LPS诱导的白细胞介素-1β的分泌的IC₅₀值优选小于1nM和/或小于100pg/mL。以摩尔计算和/或以每体积重量计算，用于抑制LPS诱导的白细胞介素-1β的分泌的IC₅₀值优选低于阿达木单抗的IC₅₀值。

在另一个实施方案中，本发明的抗体或功能片段能够抑制CD14⁺单核细胞中LPS诱导的TNFα的分泌。用于抑制LPS诱导的TNFα的分泌的IC₅₀值优选小于1nM和/或小于150pg/mL。以摩尔计算和/或以每体积重量计算，用于抑制LPS诱导的TNFα的分泌的IC₅₀值优选低于阿达木单抗的IC₅₀值。

细胞增殖的抑制

本发明的抗体或功能片段通常能够在混合淋巴细胞反应中抑制外周血单核细胞的细胞增殖。细胞增殖的抑制可以如实施例6中所述测定。根据实施例6测定的，抗体或功能片段例如本发明的scFv或双抗体的刺激指数优选小于5，更优选小于4.5。在具体实施方案中，抗体例如本发明的IgG的刺激指数小于4或甚至小于3。

TNFα和TNF受体之间相互作用的抑制

通常，本发明的抗体或功能片段能够抑制人TNFα和TNF受体I(TNFRI)之间的相互作用。人TNFα和TNFRI之间相互作用的抑制可以如下文实施例2第2.1.3节所述在抑制ELISA中测定。

如在抑制ELISA中所测定的，本发明的抗体或功能片段抑制人TNFα和TNF受体I之间相互作用的效力相对于英夫利昔单抗的效力(相对效力)优选为至少2，其中所述相对效力是ng/ml的英夫利昔单抗的IC₅₀值与ng/ml的抗体或其功能片段的IC₅₀值的比例。

通常，本发明的抗体或功能片段能够抑制人TNFα和TNF受体II(TNFRII)之间的相互作用。人TNFα和TNFRII之间相互作用的抑制可以如下文实施例2第2.1.3节所述在抑制ELISA中测定。

如在抑制ELISA中所测定的，本发明的抗体或功能片段抑制人TNFα和TNF受体II之间相互作用的效力相对于英夫利昔单抗的效力(相对效力)优选为至少2，更优选为至少3，其中所述相对效力是以ng/ml为单位的英夫利昔单抗的IC₅₀值与以ng/ml为单位的抗体或其功能片段的IC₅₀值的比例。

化学计量和交联

本发明的抗体或功能片段通常能够以至少2的化学计量(抗体：TNFα_三聚体)与人TNFα_三聚体结合。化学计量(抗体：TNFα_三聚体)优选大于2，或至少2.5，或至少3。在一个实施方案中，化学计量(抗体：TNFα_三聚体)为约3。化学计量(抗体：TNFα_三聚体)可以如下文实施例4中所述测定。

在另一个实施方案中，本发明的抗体或功能片段能够与人TNFα形成复合物，其中所述复合物包含至少两个分子的TNFα和至少三个分子的抗体或功能片段。根据该实施方案的功能片段包含TNFα的至少两个单独的结合位点，例如双抗体。复合物形成可以如下文实施例5中所述测定。

在一个实施方案中，抗体是IgG，并且能够与TNFα形成至少600KDa的复合物。在另一个实施方案中，功能片段是双抗体，并且能够与TNFα形成至少300KDa的复合物。

靶标选择性

在某些实施方案中，本发明的抗体或功能片段具有高靶标选择性，即它可以区分TNFα和TNFβ。优选地，TNFβ的IC₅₀值比TNFα的IC₅₀值大至少1,000倍，如根据实施例2第2.1.4节所述在竞争ELISA中所测定的。更优选地，TNFβ的IC₅₀值比TNFα的IC₅₀值大至少1,000倍，最优选地至少10,000倍，如根据实施例2第2.1.4节所述在竞争ELISA中所测定的。

表达产率和重折叠产率

在其他实施方案中，本发明的抗体或功能片段，优选scFv或双抗体，可以在微生物如细菌或其他细胞中以高产率重组表达。优选地，如根据实施例2所述测定的，在大肠杆菌中的表达产率为至少0.25g/L。这特别适用于诸如scFv的功能片段。

如根据实施例2所述测定的，重折叠产率为至少5mg/L，更优选至少10mg/L，更优选至少15mg/L，最优选至少20mg/L。这特别适用于诸如scFv的功能片段。

稳定性

通常，本发明的抗体或功能片段，优选scFv或双抗体，具有高稳定性。可以通过不同的方法评估稳定性。如根据实施例2第2.2.4节所述通过差示扫描荧光测定法(DSF)所测定的，本发明的抗体或功能片段的可变结构域的“融解温度”T_m优选为至少60℃，更优选至少63℃，最优选至少66℃。如本文所用，“可变结构域的融解温度”是指由序列V_L-接头A-V_H组成的scFv的融解温度，其中接头A的氨基酸序列由SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列组成。例如，非scFv形式的抗体(例如IgG)的可变结构域的融解温度根据如上定义的其相应scFv的融解温度定义。

如根据实施例2第2.2.5节所述通过分析型尺寸排阻色谱法测定的，在4℃下储存4周后，单体含量的损失(浓度为10g/L；初始单体含量>95％)优选小于5％，更优选小于3％，更优选小于1％，最优选小于0.5％。如根据实施例2第2.2.5节所述通过分析型尺寸排阻色谱法测定的，在-20℃下储存4周后，单体含量的损失(浓度为10g/L；初始单体含量>95％)优选小于5％，更优选小于3％，更优选小于1％，最优选小于0.5％。如根据实施例2第2.2.5节所述通过分析型尺寸排阻色谱法测定的，在-65℃下储存4周后，单体含量的损失(浓度为10g/L；初始单体含量>95％)优选小于5％，更优选小于3％，更优选小于1％，最优选小于0.5％。

如根据实施例2所述测定的，连续五次冻融循环后，单体损失小于5％，更优选小于1％，更优选小于0.5％，最优选小于0.2％，例如0.1％或0.0％。

抗体和功能片段

本发明的特定实施方案涉及本文所述抗体的功能片段。功能片段包括但不限于F(ab’)₂片段、Fab片段、scFv、双抗体、三抗体和四抗体。优选地，功能片段是单链抗体(scFv)或双抗体。更优选地，scFv或双抗体的非CDR序列是人序列。

优选地，为了使在人类中产生免疫原性的可能性最小化，所选择的受体支架由衍生自人共有序列或人种系序列的框架区组成。具体地，可变轻结构域的框架区I至III由根据SEQ ID NO：33至35的人Vκ1共有序列组成，并且框架区IV由选自SEQ ID NO：36至39的基于λ种系的序列组成。由于非人共有的残基或人种系残基可能引起免疫反应，因此每个可变结构域(VH或VL)中此类残基的数量应尽可能低，优选低于7，更优选低于4，最优选为0。

优选地，抗体是单克隆抗体。如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指衍生自单个克隆的抗体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是指产生它的方法。可以使用本领域已知的多种技术制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。(Harlow和Lane，"Antibodies,ALaboratory Manual"CSH Press 1988，Cold Spring Harbor N.Y.)。

在其他实施方案中，包括涉及在人类中体内使用抗TNFα抗体的实施方案，可以使用嵌合、灵长类化、人源化或人抗体。在优选的实施方案中，抗体是人抗体或人源化抗体，更优选单克隆人抗体或单克隆人源化抗体。

如本文所用的术语“嵌合”抗体是指具有来源于非人免疫球蛋白(例如大鼠或小鼠抗体)的可变序列和人免疫球蛋白恒定区(通常选自人免疫球蛋白模板)的抗体。生产嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见，例如Morrison,1985,Science 229(4719):1202-7；Oi等人，1986,BioTechniques 4:214-221；Gillies等人，1985,J.Immunol.Methods 125:191-202；美国专利号5,807,715；4,816,567；和4,816397，其整体通过引用并入本文。

本领域普通技术人员可采用不同的重组方法，通过产生含有最少的来源于该非人免疫球蛋白的序列的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂或抗体的其他靶标结合序列)，而使非人(例如鼠)抗体更像人抗体。通常，所得重组抗体将包含基本上全部的至少一个，通常两个可变结构域，其中对应于非人免疫球蛋白的所有或基本上所有的CDR区和所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的，特别是人免疫球蛋白共有序列的。CDR移植抗体是结合人免疫球蛋白分子的预期抗原和框架(FR)区域的抗体分子，其具有一个或多个来自最初在非人类物种中产生的抗体的互补决定区(CDR)(EP239400；PCT公开WO 91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101和5,585,089)。通常，在称为“人源化”的过程中，人框架区中的框架残基将另外被来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变，优选改善抗原结合。这些框架取代通过本领域熟知的方法确定，例如，通过模拟CDR和框架残基的相互作用来确定对抗原结合比较重要的框架残基，以及序列比较以确定特定位置处的异常框架残基。参见，例如Riechmann等人，1988，Nature 332:323-7和Queen等人，美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762和6,180,370(每篇文献的全部内容均通过引用并入本文)。可以使用本领域已知的各种另外的技术使抗体更具人性，包括例如饰面(veneering)或表面重塑(EP592106；EP519596；Padlan,1991,MoI.Immunol,28:489-498；Studnicka等人，1994,Prot.Eng.7:805-814；Roguska等人，1994,Proc.Natl.Acad.Sci.91:969-973，和链替换(chain shuffling)(美国专利号5,565,332)，所有这些都通过引用整体并入本文。CDR移植抗体或人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是所选择的人免疫球蛋白模板的至少一部分。

在一些实施方案中，如所述Queen等人，美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762和6,180,370(每篇文献均通过引用整体并入本文)制备人源化抗体。

在一些实施方案中，抗TNFα抗体是人抗体。完整“人”抗TNFα抗体可以是用于治疗人类患者的理想型。如使用在本文中，“人抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库中分离的抗体或从一种或多种人免疫球蛋白转基因且不表达内源免疫球蛋白的动物中分离的抗体。可以通过本领域已知的多种方法制备人抗体，包括上述噬菌体展示法，其使用了衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库。参考美国专利号4,444,887和4,716,111；和PCT公开WO 98/46645；WO 98/50433；WO 98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO 96/33735；和WO 91/10741，每篇文献均通过引用整体并入本文。还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。参见例如PCT公开WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598，其通过引用整体并入本文。可以使用称为“引导选择”的技术来产生识别所选表位的完整人抗体。在该方法中，所选择的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，用于引导识别相同表位的完整人抗体的选择(Jespers等人，1988,Biotechnology 12:899-903)。

在一些实施方案中，抗TNFα抗体是灵长类化抗体。术语“灵长类化抗体”是指包含猴可变区和人恒定区的抗体。生产灵长类化抗体的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,658,570；5,681,722；和5,693,780，其通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，抗-TNFα抗体是衍生化抗体。例如但不限于，衍生化的抗体通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质连接(参见下文关于抗体偶联物的讨论)等被修饰。许多化学修饰可以通过已知的技术进行，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，衍生物可以含有一种或多种非经典氨基酸。

在其他方面，抗TNFα抗体的一个或多个高变区中插入了一个或多个氨基酸，例如如US 2007/0280931中所述。

抗体缀合物

在一些实施方案中，抗TNFα抗体是抗体缀合物，其通过例如任意类型的分子与抗体的共价连接被修饰，使得共价连接不干扰与TNFα的结合。将效应部分与抗体缀合的技术是本领域熟知的(参见例如Hellstrom等人，Controlled Drag Delivery，第2版，第623-53页(Robinson等人编辑，1987))；Thorpe等人，1982,Immunol.Rev.62:119-58和Dubowchik等人，1999,Pharmacology and Therapeutics 83:67-123)。

在一个实例中，抗体或其片段在任选的N-末端或C-末端通过共价键(例如肽键)与另一种蛋白质的氨基酸序列(或其中的一部分；优选蛋白质的至少10、20或50个氨基酸部分)融合。优选地，抗体或其片段在抗体恒定结构域的N-末端与另一蛋白质连接。可是使用重组DNA步骤来产生这种融合，例如如WO 86/01533和EP0392745中所述。在另一个实例中，效应分子可以增加体内半衰期。这类合适的效应分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，例如WO 2005/117984中描述的那些。

在一些实施方案中，抗TNFα抗体可以与聚(乙二醇)(PEG)的基团相连接。例如，如果抗体是抗体片段，则PEG基团可以通过位于抗体片段中的任意可用氨基酸侧链或末端氨基酸官能团连接，例如任意游离氨基、亚氨基、硫醇、羟基或羧基。这些氨基酸可以在抗体片段中天然存在，或者可以使用重组DNA方法将其工程化到片段中。参见，例如，美国专利号5,219,996。可以使用多个位点来连接两个或更多个PEG分子。优选地，PEG基团通过位于抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的硫醇基团共价连接。当巯基用作连接点时，可以使用适当活化的效应子基团，例如硫醇选择性衍生物，例如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。

在另一个实例中，抗TNFα抗体缀合物是聚乙二醇化的修饰型Fab'片段，即其上共价连接了PEG(聚(二醇))，例如根据EP0948544中公开的方法。还参见Poly(ethyleneglycol)Chemistry,Biotechnical and Biomedical Applications，(J.MiltonHarris(编辑)，Plenum Press，New York，1992)；Poly(ethyleneglycol)Chemistry andBiological Applications，(J.Milton Harris和S.Zalipsky编辑，American ChemicalSociety，Washington D.C，1997)；和Bioconjugation Protein Coupling Techniques forthe Biomedical Sciences，(M.Aslam和A.Dent编辑，Grove Publishers，New York，1998)；和Chapman,2002,Advanced Drug Delivery Reviews 54:531-545。

药物组合物和治疗

疾病的治疗包括治疗已经被诊断为患有任意临床阶段或表现的任意疾病形式的患者；延迟疾病的症状或体征的发作或进展或加重或恶化；和/或预防和/或降低疾病的严重程度。

向其施用抗TNFα抗体或其功能片段的“受试者”或“患者”可以是哺乳动物，例如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)，或灵长类动物(例如猴子或人类)。在某些方面，人是儿科患者。在其他方面，人是成年患者。

本文描述了包含抗TNFα抗体和任选的一种或多种另外的治疗剂(例如下文描述的第二治疗剂)的组合物。该组合物通常作为包含药学上可接受的载体的无菌药物组合物的一部分提供。该组合物可以是以任意合适的形式(取决于向患者施用所需的方法)。

抗TNFα抗体和功能片段可以通过多种途径向患者施用，例如口服、透皮、皮下、鼻内、静脉内、肌肉内、鞘内、局部。在任意给定情况下，最合适的施用途径将取决于特定抗体、受试者、疾病的性质和严重程度以及受试者的身体状况。通常，静脉内施用抗TNFα抗体或其功能片段。

在特别优选的实施方案中，口服施用本发明的抗体或功能片段。如果通过口服途径施用，则功能片段优选是单链抗体(scFv)、双抗体或IgG。

在典型的实施方案中，抗TNFα抗体或功能片段以足以允许以0.5mg/kg体重至20mg/kg体重静脉内施用的浓度存在于药物组合物中。在一些实施方案中，适用于本文所述组合物和方法的抗体或片段的浓度包括但不限于0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg，或任意上述值之间的浓度范围，例如1mg/kg至10mg/kg,5mg/kg至15mg/kg，或10mg/kg至18mg/kg。

取决于所治疗的病症、施用的途径和受试者的年龄、体重和状况，抗TNFα抗体或功能片段的有效剂量可以介于每单次(例如推注)施用、多次施用或连续施用约0.001至约750mg/kg，或者实现每单次(例如推注)施用、多次施用或连续施用0.01-5000μg/的血清浓度，或其中的任意有效范围或值。在某些实施方案中，每个剂量可以介于约0.5mg至约50mg/千克体重或约3mg至约30mg/千克体重。抗体可以配制成水溶液。

药物组合物可以方便地以单位剂型形式存在，所述单位剂型每剂量含有预定量的抗TNFα抗体或功能片段。这样的单位可以含有0.5mg至5g，例如但不限于，1mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、750mg、1000mg，或任意两个上述值之间的任意范围，例如10mg至1000mg，20mg至50mg，或30mg至300mg。药学上可接受的载体可以采取多种形式，这取决于例如待治疗的病况或施用途径。

抗TNFα抗体或其功能片段的有效剂量、总剂量数和治疗时间的确定在本领域技术人员的能力范围内，并且可以使用标准剂量递增研究来确定。

通过将具有所需纯度的抗体与任选的本领域通常使用的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(所有这些在本文中称为“载体”)，即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子型洗涤剂、抗氧化剂和其他各种添加剂混合，可以制备适合于本文所述方法的抗TNFα抗体和功能片段的治疗制剂，以作为冻干制剂或水溶液储存。参见Remington'sPharmaceutical Sciences，第16版(Osol编辑，1980)。在所用的剂量和浓度下，这些添加剂必须对接受者无毒。

缓冲剂有助于将pH保持在接近生理条件的范围内。它们可以以约2mM至约50mM的浓度存在。合适的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐缓冲剂(如柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(如琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(如富马酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)、葡糖酸盐缓冲剂(如葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-钠氢氧化物混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(如乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外，可以使用磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和三甲胺盐如Tris。

可以添加防腐剂以阻止微生物生长，并且可以以0.2％-1％(w/v)的量添加。合适的防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯甲酰卤化物(例如氯化物、溴化物和碘化物)、氯化六甲基铵和对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。可以添加有时称为“稳定剂”的等渗剂以确保液体组合物的等渗性，并且其包括多元糖醇，优选三元或更高级糖醇，例如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。稳定剂是指一大类赋形剂，其功能范围可以从填充剂到可溶解治疗剂或有助于防止变性或粘附到容器壁上的添加剂。典型的稳定剂可以是多元糖醇(上面列举的)；氨基酸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括诸如肌醇的环醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如10或更少个残基的肽)；蛋白质如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮单糖如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖如乳糖、麦芽糖、蔗糖和三糖如棉子糖；以及多糖如葡聚糖。稳定剂可以以每重量份活性蛋白质0.1至10,000重量份稳定剂的范围存在。

可以添加非离子表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白质免受搅动诱导的聚集的影响，这也使得制剂暴露于剪切表面应力而不会导致蛋白质变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、聚氧乙烯醚(184、188等)、Pluronic多元醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(-20、-80等)。非离子表面活性剂可以以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml的范围存在，或者以约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。

另外的各种赋形剂包括填充剂(例如淀粉)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、蛋氨酸、维生素E)、蛋白酶抑制剂和共溶剂。

除抗TNFα抗体或其功能片段外，本文的制剂还可含有第二治疗剂。以下提供合适的第二治疗剂的实例。

取决于许多临床因素，包括疾病的类型、疾病的严重程度和患者对抗TNFα抗体或功能片段的敏感性，给药方案可以从每月一次到每天一次。在具体的实施方案中，以以下频率施用抗TNFα抗体或其功能片段：每天、每周两次、每周三次、隔天、每5天、每10天、每两周、每三周、每四周或每月一次，或任意两个上述值之间的任意范围，例如从每四天到每个月，从每10天到每两周，或从每周两次到每周三次等等。

待施用的抗TNFα抗体或功能片段的剂量将根据具体抗体、受试者、疾病的性质和严重程度、受试者的身体状况、治疗方案(例如，是否施用第二治疗剂)和所选择的施用途径而变化；本领域技术人员可以很容易地确定合适的剂量。

本领域技术人员将认识到，抗TNFα抗体或其功能片段的单个剂量的最佳量和间隔将由所治疗病况的性质和程度、施用的形式、途径和部位、所治疗的具体受试者的年龄和状况确定，并且将由医生最终确定要使用的适当剂量。该剂量可以适当地重复进行。如果发生副作用，则可以根据正常临床实践改变或减少给药的量和/或频率。

待治疗的疾病

本发明涉及治疗或预防受试者中人TNFα相关疾病的方法，包括向受试者施用本文定义的抗体或功能片段。术语“TNFα相关病症”或“TNFα相关疾病”是指其症状或疾病状态的发作、发展或持续需要TNFα的参与的任何病症。示例性TNFα相关病症包括但不限于，一般炎症的慢性和/或自身免疫性状态、免疫介导的一般炎性病症、炎性CNS疾病、影响眼、关节、皮肤、粘膜、中枢神经系统、胃肠道、泌尿道或肺的炎性疾病、一般葡萄膜炎的状态、视网膜炎、HLA-B27+葡萄膜炎、贝切特氏病( disease)、干眼综合征、青光眼、综合征、糖尿病(包括糖尿病性神经病变)、胰岛素抵抗、一般关节炎的状态、类风湿性关节炎、骨关节炎、反应性关节炎和赖特综合征(Reiter's syndrome)、青少年关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化、Guillain-Barré综合征、重症肌无力、肌萎缩性侧索硬化、结节病、肾小球肾炎、慢性肾病、膀胱炎、银屑病(包括银屑病性关节炎)、化脓性汗腺炎、脂膜炎、坏疽性脓皮病、SAPHO综合征(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎)、痤疮、斯威特氏综合征(Sweet'ssydrome)、天疱疮、克罗恩病(包括肠外表现)、溃疡性结肠炎、支气管哮喘、超敏性肺炎、普通变态反应(general allergies)、变应性鼻炎、变应性鼻窦炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺纤维化、韦格纳氏肉芽肿(Wegener's granulomatosis)、川崎综合征(Kawasakisyndrome)、巨细胞动脉炎、变应性肉芽肿性血管炎(Churg-Strauss vasculitis)、结节性多动脉炎、烧伤、移植物抗宿主病、宿主抗移植物反应、器官或骨髓移植后的排斥事件、一般脉管炎的全身性和局部状态、全身性和皮肤红斑狼疮、多肌炎和皮肌炎、硬皮病、先兆子痫、急性和慢性胰腺炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎、手术后炎症例如眼手术(例如白内障(晶状体置换)或青光眼手术)、关节手术(包括关节镜手术)、关节相关结构(例如韧带)上的手术，口腔和/或牙科手术、微创心血管手术(例如PTCA，旋切术，支架放置)，腹腔镜和/或内窥镜腹膜内和妇科学手术、内窥镜泌尿学手术(例如前列腺手术、输尿管镜检查术、膀胱镜检查、间质性膀胱炎)后的炎症或一般地手术期间的炎症(预防)、大疱性皮炎、中性粒细胞性皮炎、中毒性表皮坏死松解症、脓疱性皮炎、脑型疟疾、溶血性尿毒症综合征、同种异体移植排斥反应、中耳炎、蛇咬伤、结节性红斑、骨髓增生异常综合征、原发性硬化性胆管炎、血清阴性脊柱关节病、自身免疫性血液病性贫血、口面肉芽肿病、菌血症性皮炎、口疮性口炎、地图样舌、迁移性口炎、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、贝尔麻痹、克雅病(Creutzfeld-Jakobdisease)和一般的神经退行性疾病。

癌症相关骨质溶解、癌症相关炎症、癌症相关疼痛、癌症相关恶病质、骨转移瘤(bone metastases)、急性和慢性疼痛(无论此类疾病是否由TNFα的中心或外周作用引起以及无论它们是被分类为炎性、伤害性还是神经病性疼痛)，坐骨神经痛、腰痛、腕管综合征、复杂性局部疼痛综合征(CRPS)、痛风、疱疹后神经痛、纤维肌痛、局部疼痛状态、转移性肿瘤引起的慢性疼痛综合征、痛经(dismenorrhea)。

待治疗的具体病症包括一般的关节炎状态、类风湿性关节炎、骨关节炎、反应性关节炎、幼年型关节炎；银屑病包括银屑病关节炎；炎症性肠病包括克罗恩病、溃疡性结肠炎包括直肠炎、乙状结肠炎、左侧结肠炎、广泛性结肠炎和全结肠炎、未确定型结肠炎、显微镜结肠炎包括胶原性和淋巴细胞性结肠炎、结缔组织病结肠炎、转移性结肠炎、憩室病结肠炎、嗜酸性结肠炎和结肠袋炎(pouchitis)。

联合疗法及其他方面

优选地，用抗TNFα抗体或其功能片段治疗的患者也用另一种常规药物治疗。例如，患有炎性肠病的患者，特别是患有中度至重度疾病的患者通常也用美沙拉嗪(mesalazine)或其衍生物或前药、皮质类固醇例如布地奈德(budesonide)或泼尼松龙(prednisolone)(口服或静脉注射)、免疫抑制剂例如硫唑嘌呤/6-巯基嘌呤(6-MP)或甲氨蝶呤、环孢菌素或他克莫司(tacrolimus)治疗。可以向患者共同施用的其他药物包括生物制剂，例如英夫利昔单抗、阿达木单抗、依那西普、赛妥珠单抗等。可以向患者共同施用的其他药物包括免疫抑制剂(例如硫唑嘌呤/6-MP或甲氨蝶呤或口服环孢菌素)以维持稳定和更长的缓解。本发明的另一方面是使用如上文所定义的抗TNFα抗体或功能片段来减轻炎症。

本发明的又一方面是如上文所定义的抗TNFα抗体或功能片段，其用于减轻患有炎性病况的患者的炎症。

本发明的另一方面是治疗炎性病况的方法，包括向有此需要的患者施用有效量的如上文所定义的抗TNFα抗体或功能片段。炎性病况优选是上述病况之一。

本发明的另一方面是预防炎性病况的方法，包括向有此需要的患者施用有效量的如上文所定义的抗TNFα抗体或功能片段。炎性病况优选是上述病况之一。

表1：氨基酸序列概述

实施例

实施例1：针对人TNFα的兔抗体的生成

1结果

1.1免疫

用纯化的重组人TNFα(Peprotech，货号300-01A)免疫兔。在免疫过程中，通过确定多克隆血清抗体依旧能够与抗原产生可检测的结合的每只兔的血清的最大稀释度(滴度)，从而定性评估针对抗原的体液免疫应答的强度。使用酶联免疫吸附测定(ELISA，参见2.2.1)评估针对固定化重组人TNFα的血清抗体滴度。所有三只兔都显示出非常高的滴度，在ELISA中10×10⁶倍稀释的血清仍然产生阳性信号(比用来自作为背景对照的天然无关动物的血清获得的信号至少高3倍)。此外，使用基于小鼠L929细胞的测定评估了不同兔血清抑制TNFα的生物活性的能力(参见2.2.3)。所有三种血清均抑制TNFα诱导的小鼠L929成纤维细胞的凋亡。兔#3显示出最强的中和活性，在1：155’000的血清稀释度下达到50％抑制(IC₅₀)。与兔#3相比，兔#2和兔#1的活性低了约3和21倍，分别在1：55’500和1：7’210的血清稀释度下达到50％抑制。

选择从所有三只动物的脾中分离的淋巴细胞用于随后的命中物(hit)鉴定程序。基于L929测定中抑制TNFα的生物活性的效力对动物进行优先排序。因此，培养的最高命中物数来自兔#3，最低命中物数来自兔#1。

1.2命中物鉴定

1.2.1命中物分选

在命中物鉴定程序之前，开发了基于流式细胞术的分选程序，其特异性地检测高亲和力TNFα结合B细胞，并将其分离(参见2.1)。

在两个独立的分选工作中，表征了来自全部三只兔的总共33×10⁶个淋巴细胞(相当于分离的总淋巴细胞的1.5％)。从所分析的34×10⁶个细胞中，分离出了总共3452个表达TNFα特异性抗体(IgG)的B细胞。三只兔的克隆的淋巴细胞数量不相同，从在L929测定中血清示出强TNFα抑制的兔中分离出的细胞更多。在分离的B细胞中，792个克隆来自兔#1，1144个克隆来自兔#2且1408个克隆来自兔#3。108个克隆的各自兔来源未知，因为它们来源于残留淋巴细胞的混合物，该残留淋巴细胞混合物来自所有3只兔，以使得可从小瓶中最佳地回收少量淋巴细胞。

1.2.2命中物筛选

在筛选阶段获得的结果是基于用来自抗体分泌细胞(ASC)的培养物上清液的未纯化抗体进行的测定，因为高通量培养的规模不允许纯化单个兔抗体。这些上清液用于将大量抗体相对于彼此进行排序，但除了结合亲和力之外不提供绝对值(例如关于TNFα的生物活性的抑制)。在高通量ELISA中筛选ASC上清液与重组人TNFα的结合。通过ELISA进一步表征TNFα结合上清液与食蟹猴TNFα的结合、结合动力学即其在L929测定中中和人TNFα的生物活性的潜力。除了结合动力学之外，高通量筛选的报告值应解释为答案“是”或“否”，这些答案基于单点测量(无剂量响应)。对于选择用于扩增和测序抗体重链和轻链可变结构域的所有102个克隆，分析其对食蟹猴和小鼠TNFα的亲和力。

1.2.2.1与人TNFα结合

初步筛选的目的是鉴定产生人TNFα特异性抗体的ASC克隆。为此目的，通过ELISA分析3452个ASC克隆的细胞培养上清液中人TNFα抗体的存在(见2.2.1)。所使用的ELISA方法评估了与重组人TNFα结合的IgG亚型的抗体的“量”，但是没有给出关于抗体的亲和力或浓度的信息。在该测定中，来自894个ASC克隆的上清液产生了明显高于背景的信号。对于兔#1和兔#2，筛选的命中物率相似，其中从兔#1中鉴定的792个中有153个命中物(19.3％)，从兔#2中鉴定的1144个中有225个命中物(19.7％)。兔#3显示出显著更高的命中物率34.4％，导致从1408个中鉴定出484个命中物。将在该初步筛选中鉴定的所有894个命中物通过SPR进行结合动力学的测量(二次筛选)。

1.2.2.2TNFα结合动力学

二次筛选的目的是获得关于从表面等离子共振初步筛选中获得的每个命中物的靶标结合质量的定量信息(SPR，见2.2.2)。与初步筛选期间使用的ELISA相反，该方法评估作为时间的函数的靶结合动力学。这允许确定抗体与其靶标结合(k_a)和解离(k_d)的速率常数。比例k_d/k_a提供了平衡解离常数(K_D)，其反映了抗体对其靶标的亲和力。在初步筛选中确定的894个命中物中，可以测定839个单克隆兔抗体对人TNFα的结合亲和力。对于剩余的55个抗体，不能测量亲和力，因为ASC上清液中的抗体浓度低于相应装置中SPR仪器的检测限。可以测量的839种抗TNFα抗体的解离常数(K_D)在1.36×10^-13M至1.14×10^-8M的范围内。所分析的所有抗体中69％的K_D低于0.5nM。

用于筛选从兔#2和兔#3确定的命中物的中值K_D相似，为2.21×10^-10M和2.09×10^-10M，而兔#1的中值K_D高约2倍，为4.65×10^-10M。当仅考虑中和筛选命中物时，所有三只动物的亲和力分布相似，中值K_D值较低(中值K_D在1.4×10^-10M和1.27×10^-10M之间)。对于兔#1、兔#2和兔#3，所测量的5％的筛选命中物亲和力分别低于0.041nM、0.029nM和0.026nM。对于2％的上清液，亲和力甚至在低皮摩尔范围内(低于6.2pM、7.9pM和11pM)。由二次筛选产生的高亲和力抗体的优异产率为选择最适合人源化和重整的抗体提供了广泛的基础。

1.2.2.3效力

为了评估效力，已经开发了一种基于细胞的测定(L929测定)。在L929测定中，894种选定抗体中有506种(56.6％)抑制TNFα诱导的细胞凋亡超过50％。与滴度分析中获得的结果一致，中和命中物的最高百分比来自兔#3，命中物率为62.8％，其次是兔#2，命中物率为56.4％，兔#1命中物率最低，为39.9％。这些中和抗体的亲和力介于1.36×10^-13至1.19×10^-9M之间。

1.2.2.4物种交叉反应(食蟹猴)

通过ELISA检测分析初步筛选中鉴定的所有894个命中物与食蟹猴TNFα的物种交叉反应性(参见2.2.1)。该额外筛选的目的是允许选择已知与食蟹猴TNFα交叉反应的ASC克隆。所使用的ELISA方法评估了与重组食蟹猴TNFα结合的IgG亚型的抗体的“量”，但是没有给出关于抗体的亲和力或浓度的信息。来自414个(46％)ASC克隆的上清液产生清晰的信号(光密度(OD)≥1)。对于兔#1和兔#3，与食蟹猴TNFα的命中物交叉反应的百分比相似，其中从兔#1中鉴定的153个中有81个命中物(52.9％)，从兔#3中鉴定的484个中有236个命中物(48.8％)。兔#2的交叉反应性命中物略低，为37.8％，导致从225个中鉴定出82个命中物。

1.2.2.5选择用于RT-PCR的克隆

作为命中物确认、基因序列分析和随后兔抗体人源化的先决条件，需要检索编码兔抗体可变区的遗传信息。这通过将各信使RNA逆转录(RT)成互补DNA(cDNA)，然后通过聚合酶链式反应(PCR)扩增双链DNA来完成。进行RT-PCR的ASC克隆的选择主要基于亲和力和中和活性。作为另外的标准，考虑与食蟹猴TNFα的交叉反应性。总共选择了102个ASC克隆用于通过RT-PCR进行基因克隆。首先，选择了K_D低于80pM、在L929测定中抑制超过50％的TNFα的生物活性并且与食蟹猴TNFα显著结合的93个最佳排名ASC(就亲和力而言)。此外，还选择了K_D低于20pM、中和超过50％的TNFα活性但不与食蟹猴TNFα结合的全部9个最佳排名ASC克隆。总共分别有12、13和66个ASC成功地从兔#1、#2和#3扩增并测序。

1.2.2.6具有所需特性的相关克隆的鉴定

为了表征分离的ASC克隆组的遗传多样性，提取互补决定区(CDR)的序列并进行多序列比对，从而允许在系统发生树中进行序列聚类。

这种分析一方面允许选择各种克隆序列进行人源化和重整实验，同时它也鉴定了似乎在兔中共享共同亲本B细胞克隆的同源克隆序列簇。这些序列簇的标志在CDR中序列同源性高，并且具有一致的药效学特性模式。表2和3中总结了四个克隆簇的这两种特征。尽管该序列簇具有功能保守性，但表3中的共有序列显示CDR的某些可变性是可耐受的，同时仍导致所需的药效学特性。

表2：ASC上清液中单克隆抗体的药效学特性。

表3：获得以下关于CDR的序列数据用于上述克隆：

1.2.2.7与食蟹猴和小鼠TNFα的交叉反应性(通过SPR)

由于有效中和TNFα的高亲和力命中物数量多，因此评估了所有进行RT-PCR的单克隆兔抗体的物种交叉反应性，以便于选择用于命中物确认的ASC克隆。通过类似于如上所述的SPR测量来确定与食蟹猴TNFα的亲和力(也参见2.2.2)。93种测试抗体对食蟹猴TNFα的亲和力范围为9.6×10^-12至2.1×10^-9M。与人和食蟹猴TNFα结合的93种交叉反应性抗体中有38种具有相似的亲和力(K_D差异小于2倍)。此外，93种交叉反应抗体中有79种在人和食蟹猴之间亲和力差异小于20倍，有62种小于10倍，这使得它们适于在食蟹猴中进行临床前开发。

2.方法

2.1分选试验

如Lalor等(Eur J Immunol.1992；22.3001-2011)所述，进行基于流式细胞的分选程序以从兔淋巴组织中分离抗原特异性B细胞。

2.2筛选试验

2.2.1TNFα结合ELISA(人和食蟹猴TNFα)

将重组人TNFα(Peprotech，货号300-01)包被在96孔微量滴定ELISA板上。通过二级HRP标记的抗兔IgG(JacksonImmuno Research，货号111-035-046)检测ASC培养物上清液中兔抗体与固定化TNFα的结合。加入TMB底物(3,3',5,5’-四甲基联苯胺，KPL，货号53-00-00)并通过加入H2SO4终止显色反应。使用微量滴定板读数器(Infinity读数器M200Pro，Tecan)在450nM波长下读板。

通过市售的阳性对照抗TNFα兔多克隆抗体(AbD Serotec，货号9295-0174)监测筛选工作期间的试验表现。为此目的，在每个筛选平板上以100和250ng/ml一式两份对阳性对照抗体进行测试。监测每个板的阳性对照响应的稳定性和精确度。在最终测定条件下，对于250ng/ml的阳性对照，信号-背景比在30至40之间，阳性对照的变异系数(CV)低于10％。相对于250ng/ml阳性对照，光密度≥100％的信号被认为是主要的筛选命中物。

对于血清滴度测定，使用与上述相同的ELISA设置。当与天然无关动物的信号相比，免疫血清的结合信号至少高3倍时，血清稀释液被认为是阳性的。

使用与上述类似的ELISA测定与食蟹猴的交叉反应性。将重组食蟹猴TNFα(SinoBiological，货号90018-CNAE)包被在96孔微量滴定ELISA板上。如上所述，通过HRP标记的二抗检测ASC培养物上清液中的兔抗体与固定化食蟹猴TNFα的结合。来自兔#2的免疫血清用作阳性对照，稀释度为1：80’000和1：320’000。监测每个板的阳性对照响应的稳定性和精确度。在最终测定条件下，对于1:80’000稀释度的阳性对照，信号-背景比在20至30之间，阳性对照的变异系数(CV)低于10％。

2.2.2通过SPR进行与TNFα的结合动力学(人、食蟹猴)

使用MASS-1SPR仪器(Sierra Sensors)通过表面等离振子共振(SPR)测量抗体对人TNFα的结合亲和力。通过标准参照溶液并分析参照抗体-抗原相互作用(例如英夫利昔单抗-TNFα相互作用)来鉴定仪器的性能。

对于亲和力筛选，使用标准胺偶联程序将对兔IgG(Bethyl Laboratories，货号A120-111A)的Fc区特异性的抗体固定在传感器芯片(SPR-2Affinity Sensor,HighCapacity Amine,Sierra Sensors)上。通过固定化抗兔IgG抗体捕获ASC上清液中的兔单克隆抗体。在捕获单克隆抗体后，将人TNFα(Peprotech，货号300-01)以90nM的浓度注入流动细胞中3分钟，并使蛋白质与传感器芯片上捕获的IgG解离5分钟。在每次注射循环后，用两次注射10mM甘氨酸-HCl再生表面。使用一对一Langmuir结合模型，用MASS-1分析软件(Analyzer，Sierra Sensors)计算表观解离(k_d)和缔合(k_a)速率常数和表观解离平衡常数(K_D)，并基于相对Chi²(Chi²归一化至分析物的外推最大结合水平)监测拟合的质量，其中相对Chi²是曲线拟合质量的量度。对于大多数命中物，相对Chi²值低于15％。如果配体结合的响应单位(RU)是抗体捕获的RU的至少2％，则认为结果有效。配体结合的RU少于2％的抗体捕获的RU的样品被认为TNFα与捕获的抗体没有特异性结合。

使用相同的测定装置和TNFα浓度并应用相同的质量测量来测量与食蟹猴TNFα(Sino Biological，货号90018-CNAE)的物种交叉反应性。对于所分析的大多数ASC上清液，相对Chi²低于15％。

2.2.3TNFα诱导的L929成纤维细胞凋亡

使用小鼠L929成纤维细胞(ATCC/LGC Standards，货号CCL-1)评估来自ASC培养上清液的兔IgG中和重组人TNFα的生物活性的能力。通过加入1μg/ml放线菌素D使L929细胞对TNFα诱导的细胞凋亡敏感。在50％ASC培养上清液和100pM(5.2ng/ml)人TNFα(Peprotech，货号300-01)的存在下，将细胞在96孔平底微量滴定板中培养24小时。与纯化的抗体相比，在ASC上清液的存在下必须使用更高浓度的TNFα进行命中物筛选。使用WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓单钠盐)细胞增殖试剂(Sigma Aldrich，货号96992)，通过比色测定法测定细胞的存活率。WST-8被细胞脱氢酶还原成橙色甲臜产物。产生的甲臜的量与活细胞的数量成正比。使用Softmax数据分析软件(Molecular Devices)，使用四参数逻辑曲线拟合分析数据，计算中和50％TNFα诱导的细胞凋亡所需的英夫利昔单抗浓度(IC₅₀)，为36.2ng/ml。因此，该测定的预估检测下限为30至40ng/ml。该值仅是对检测限的粗略估计，因为阻断TNFα的潜力不仅取决于单克隆抗体的浓度，还取决于抗体对靶标的亲和力。然而，该测定的灵敏度足以筛选ASC上清液，因为大多数ASC上清液中的IgG浓度高于40ng/ml。导致50％中和TNFα诱导的细胞凋亡的上清液被认为是阳性。

为了确保在筛选工作期间稳定的测定性能，以115ng/ml(0.8nM)和58ng/ml(0.4nM)在每个筛板上一式两份对阳性对照抗体英夫利昔单抗进行测试。监测每个筛选板对阳性对照的抑制百分比和响应精确度。每个平板的验收标准设定如下：被浓度为115ng/ml的阳性对照抗体抑制至少60％，变异系数(CV)低于20％。

实施例2：scFv1的人源化和产生

1.结果

1.1命中物确认和人源化命中物的选择

在命中物筛选期间检索了73组独特的亲本兔轻链和重链可变结构域，并通过序列比对进行分析。基于筛选测定结果和各个兔IgG克隆的序列同源性，选择30个候选物用于命中物确认。制备了29种单克隆抗体，并且选择了在亲和力和效力方面性能最佳的克隆用于人源化和先导候选物生成。选择克隆的标准是i)在L929测定中中和人TNFα，ii)对人TNFα亲和力高，iii)与食蟹猴和恒河猴TNFα有交叉反应性，和iv)序列多样性。已选择了一个克隆(16-19-B11)用于人源化——就L929测定中中和人TNFα的效力而言，其是最佳排名的IgG之一。关于结合强度，期望尽可能好的亲和力，因为由于人源化和重定格式为scFv形式，预计需要一定的亲和力损失。

IgG克隆编号16-19-B11的数据总结于下表4中。

1.2人源化scFv片段的生成和选择

如WO 2014/206561中所述，通过CDR-环接枝将编码互补决定区(CDR)的序列计算机模拟(in silico)转移到人可变结构域支架序列上。此外，每个兔克隆产生第二个构建体，其在与免疫球蛋白结构域和CDR定位具有结构相关性的位置从供体序列转移另外的氨基酸。合成编码相应人源化单链抗体Fv(scFv)的人工基因(为细菌表达优化密码子使用)(来自相应的可变轻链和重链)。然后产生多肽，随后使用与命中物确认中所描述的类似的测定法表征。

1.2.1人源化scFv(API)的人源化和制造

如WO 2014/206561中所述，所选克隆的人源化包括将兔CDR转移到Vκ1/VH3型的scFv受体框架上。图1示意性地示出了该过程，在该过程中，在供体序列(兔mAb)上确定了六个CDR区的氨基酸序列并将其移植到受体支架序列中，产生称为“CDR移植物”的构建体(克隆16-19-B11sc01；参见SEQ ID NO：18)。

此外，设计了两个另外的移植物(克隆16-19-B11sc02和16-19-B11sc06；分别参见SEQ ID NO：19和20)，其在某些框架位置上包含来自兔供体的另外的氨基酸修饰，这可能会影响CDR定位并因此影响抗原结合(Borras等人，2010；J.Biol.Chem.,285:9054-9066)。这些人源化构建体被称为“结构化(STR)移植物”。在比较这三种初始构建体的表征数据显示STR构建体具有显著优点的情况下，可以设计另外的变体，其将CDR移植的VL与STR移植的VH组合。已经证明这种组合通常足以保留STR移植物的活性(Borras等人JBC.2010；285:9054-9066)并且通常是优选的，因为人受体支架中的非人类改变较少，降低了稳定性受损的风险以及免疫原性的可能性。

完成前一部分中描述的计算机模拟构建体设计后，合成相应的基因并构建细菌表达载体。在DNA水平上确认表达构建体的序列，并根据通用表达和纯化方案制备构建体。

蛋白质的异源表达在大肠杆菌中以不溶性包涵体进行。用指数生长的起始培养物接种表达培养物。使用市售的富媒培养基在轨道式振荡器中的摇瓶中进行培养。使细胞生长至规定的OD₆₀₀为2，并通过用1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)过夜表达诱导。在发酵结束时，通过离心收获细胞并通过超声处理均化。此时，通过SDS-PAGE分析细胞裂解物来确定不同构建体的表达水平。通过离心方案从均质化的细胞沉淀中分离包涵体，该离心方案包括几个洗涤步骤以去除细胞碎片和其他宿主细胞杂质。将纯化的包涵体溶解于变性缓冲液(100mM Tris/HCl pH 8.0，6M Gdn-HCl，2mM EDTA)中，并通过可扩展的重折叠方案使scFv重折叠，产生毫克量的天然折叠的单体scFv。采用标准化方案纯化scFv，其包括以下步骤。通过使用Capto L琼脂糖(GE Healthcare)的亲和层析捕获重折叠后的产物，得到纯化的scFv。通过使用HiLoad Superdex75柱(GE Healthcare)的抛光尺寸排阻色谱法进一步纯化在初始测试中满足亲和力和效力标准的先导候选物。在纯化方案之后，将蛋白质配制在缓冲盐水溶液中，并通过各种生物物理、蛋白质相互作用和生物学方法表征，如下所述。通过测定批次的纯化蛋白质的最终产量并将该值标准化为1L的重折叠体积来比较不同构建体的生产性。

1.2.2人源化scFv的生物物理表征

scFv构建体的生产性和稳定性可以通过如后续章节中所讨论的不同报告点来表征。

可以根据某些标准来调查scFv，如下所述。

生产性标准应确保所选择的scFv实体能够以足够支持后续先导分子开发的量表达、重折叠和纯化。定义的标准是如通过SDS-PAGE评估的，每升发酵液中scFv的表达产率，以及如通过UV光谱法测量纯化蛋白质的量评估的，计算回1升重折叠溶液的在通用实验室规模的过程中实现的纯化产率。

稳定性标准旨在评估分子制造过程中的聚集倾向及其在储存和进一步处理期间的结构完整性。通过SE-HPLC测定的单体含量允许在纯化过程中评估分子的胶体稳定性(2.2.3)。在随后的稳定性研究中，可以以1和10mg/mL、储存在4、-20和<-65℃下，在长达4周的持续时间测试单体含量。此外，可以在5次冻融循环后测试蛋白质的胶体稳定性。作为一项另外的指示稳定性的参数，热解折叠的中点可以通过差示扫描荧光测定法(DSF)(2.2.4)来确定，以提供先导候选物的构象稳定性的读数。

1.2.2.1生产性评估

可以通过摇瓶发酵以分批模式表达先导候选scFv分子，并通过通用实验室规模方法纯化以产生蛋白质样品用于进一步表征。在此过程中，可以监测一些关键性能参数以比较候选分子并确定开发构建体可能的困难。

可以在离心收获细胞后，在粗大肠杆菌裂解物的水平上测定表达效价。在收获期间，预期损失少量细胞，然而，计算表达产量时可以选择忽略该因子，有利于更保守地估计生产性。为了定量裂解物中的scFv产物，可以选择考马斯染色的还原SDS-PAGE(2.2.1)，因为该方法的高特异性允许将产物与样品中的宿主细胞蛋白区分开。

评估生产性的第二个标准是每升重折叠溶液所计算的scFv的纯化产率。该参数解决了包括蛋白质重折叠步骤的预期制造过程中的潜在瓶颈。由于重折叠方案的效率已经证明在可比较的制造过程中是有限的，因此可以将不同构建体的性能与标准化为限定重折叠体积的生产性进行比较。为了计算产率，可以通过UV吸光度(2.2.2)定量来自各批次的最终蛋白质样品，并除以相应纯化物的实际重折叠体积。

1.2.2.2稳定性评估

对scFv构建体的构象稳定性、单分散性和结构完整性的评估是使不同分子在可行性方面进行排序的不可或缺的部分。对不同构建体进行有意义的比较的先决条件是制备具有相似质量的纯化分子。由SE-HPLC确定的标准“单体纯度”旨在确保不同测试物质的兼容质量(compatible quality)。除了SE-HPLC分析之外，还进行用于测定蛋白质纯度和特性的SDS-PAGE以证实测试制剂的可比较质量。

scFv纯化的SE-HPLC结果表明，所有制剂均可以纯化至单体含量为至少97％相对峰面积的纯度大于97％(图2)。

通过差示扫描荧光测定法(DSF)测试先导候选物的热解折叠行为，以允许分子就其预期构象稳定性而言进行排序。图3示出了荧光原始数据的归一化图，其描绘了每个样品的重复测量。观察到了协作的解折叠行为。三个分子16-19-B11-sc01、16-19-B11-sc02和16-19-B11-sc06的T_m分别为67.8℃；66.4℃；和64.6℃。

在稳定性评估的第二组中，可以在不同温度下在4周的持续时间内监测到分子的单分散性。预计相对于各自的起始值，浓度为10mg/ml的scFv构建体超过最低95％单体并且损失少于5％的单体。在-20℃和<-65℃的冷冻状态下，可以预期样品随时间推移仅显示出最小的差异。在最严格的条件下(4℃)，预计scFv构建体在4周期间损失少于0.5％的单体。此外，应力稳定性研究可以在37℃的温度和10mg/ml的scFv浓度下进行长达4周。在这种情况下，预期会更严格地区分不同构建体的聚集倾向。另外，scFv样品可以反复冻融总共5个循环。预计通过分析型SE-HPLC得到的单体含量的定量显示两种样品间没有变化。

此外，在不同条件下，在双特异性单链双抗体(第二特异性针对不同于TNFα的抗原)的背景下监测两种scFv构建体的单分散性：(A)20℃，10mg/ml，8小时；(B)4℃，10mg/ml，48小时；(C)4℃，10mg/ml，4周(D)10mg/ml，冻/融循环。在所有情况下，观察到单体损失小于2.5％，在(A)、(B)和(D)的情况下甚至小于1％。

可以对三种scFv进行SDS-PAGE分析以获得用于通过UV吸光度定量的支持数据，确认样品制备品的纯度，从而赋予含量定量的特异性。在该分析的另一个方面，SDS-PAGE结果可以揭示稳定性研究期间不存在蛋白质降解(4℃、浓度10mg/ml储存28天，与从第0天储存在-65℃下的样品相比)，这是从可发展性观点来看的一个重要特征。

值得注意的是，在本评估范围内提出的不同研究涉及蛋白质稳定性的不同机制方面。确定蛋白质的热解折叠温度将得到在高温储存时通过SE-HPLC测量单分散性的互补结果。虽然两种方法都旨在估计可能的产品保质期和稳定性，但所解决的机制却截然不同。通过热解折叠评估的转变中点(Tm)是蛋白质结构域稳定性的定性测量(不能够热力学测定ΔG)。高度稳定的蛋白质结构域(高Tm)在环境温度下不太可能自发地解折叠，因此不易于发生由未折叠的结构域相互作用驱动的不可逆聚集/沉淀。结构域稳定性高表明氨基酸残基的包装紧密，这也与蛋白酶切割的耐受性相关。另一方面，SE-HPLC评估定量地确定单体级分以及可溶性低聚物/聚集体的含量。这种可溶性寡聚体通常是可逆的，并且由正确折叠的蛋白质之间的静电或疏水相互作用驱动而相对松散的缔合。通过热解折叠评估的Tm与通过SE-HPLC评估的低聚物/聚集体形成的倾向之间存在一些相关性，特别是对于具有“边界线”稳定性的蛋白质。超过约60℃的特定阈值Tm，抗体可变结构域通常足够稳定以抵抗在环境温度下由于部分结构域解折叠而产生的聚集/沉淀和蛋白水解降解。然而，仍然会发生由表面残基的疏水和/或静电相互作用驱动的低聚反应。重要的是，在温度升高(例如37℃)的加速(应力)稳定性研究中，各种机制的低聚物形成和沉淀的可同时发生。

1.2.3人源化scFv的体外结合和活性的表征

在下文中，在体外表征人源化scFv的靶结合特性和效力。分析了与人TNFα的结合动力学(ka、kd和KD)和中和TNFα诱导的L929成纤维细胞凋亡的效力。此外，还可以确定抑制食蟹猴(Macaca fascicularis)和恒河猴(Macaca mulatta)TNFα诱导的细胞凋亡的效力，以及通过ELISA确定抑制人TNFα和TNFRI/TNFRII之间相互作用的效力并且确定与TNFα结合相对于与TNFβ结合的靶标选择性。

为了理解下面的结果，重要的是要注意，将兔CDR转移到人可变结构域支架上以及形式从全尺寸(full-size)IgG变化为scFv片段都可能影响药理学性质。例如，亲和力的某种丧失通常与人性化有关。此外，由于与IgG相比scFv的尺寸较小，scFv通过空间位阻干扰相互作用配偶体的能力大大降低。最后但并非最不重要的是，应注意，由于其与同源三聚体TNFα结合的二价模式，亲本IgG的亲和力可能太高(SPR假象)。因此，当比较亲本二价兔IgG和人源化单价scFv之间的亲和力时，所报道的“亲和力损失”可能被高估。

1.2.3.1亲和力

通过SPR测量确定人源化scFv对人TNFα的亲和力(还参见2.1.1)。使用相应scFv的2倍系列稀释液测定亲和力。scFv衍生自兔单克隆抗体。生成了不同的scFv变体，命名为“CDR”(CDR)和“结构移植物”(STR)，如上所述。

scFv 16-19-B11-sc01(CDR)、16-19-B11-sc02(STR)和16-19-B11-sc06(STR)分别以7.0×10^-10、2.2×10^-10和5.9×10^-11的亲和力结合。

1.2.3.2效力

使用L929测定分析了人源化scFv中和人TNFα的能力(还参见2.1.2)。分析了16-19-B11衍生的scFv中和TNFα诱导的细胞凋亡的效力(IC₅₀和IC₉₀)，并与参照抗体英夫利昔单抗的效力比较，以允许直接比较来自不同测定板的IC₅₀和IC₉₀值。以英夫利昔单抗和scFv的质量单位(ng/ml)计算相对IC₅₀和IC₉₀值。使用不同批次的抗体片段在不同天进行数次效力分析。图4示出了来自三个scFv之一的一个实验的代表性剂量-反应曲线。

1.2.3.3物种交叉反应性(食蟹猴和恒河猴TNFα)

最高排名的scFv的物种交叉反应性可以通过两种方法确定：1)在L929测定中中和食蟹猴和恒河猴TNFα的效力，和2)通过SPR确定对食蟹猴和恒河猴TNFα的亲和力。中和来自不同物种的TNFα的效力可以通过L929测定来确定，类似于上文分别使用食蟹猴和恒河猴TNFα对人TNFα的描述(参见图5；还参见2.1.2)。预期来自两个物种的TNFα均显示出非常相似的诱导L929细胞凋亡的效力。因此，使用相同浓度的人和猴TNFα进行物种交叉反应性测试。另外，使用与用于人TNFα类似的测定法测定与食蟹猴和恒河猴TNFα的结合动力学(通过SPR)(也参见2.1.1)。

预期来自克隆16-19-B11的所有scFv均显示出与食蟹猴和恒河猴TNFα的交叉反应性。预计分别对食蟹猴和恒河猴的亲和力相似。人和猴TNFα之间的亲和力差异预计在约2倍至约10倍之间。预计中和食蟹猴、恒河猴和人TNFα的效力与对各自TNFα的亲和力相关。

1.2.3.4阻断人TNFα-TNFRI/II相互作用

除L929测定外，还可以通过ELISA评估每种人源化scFv抑制人TNFα和TNFRI/II之间相互作用的效力(参见2.1.3)。与L929测定相似，将每个平板上的单个IC₅₀值针对每个平板上取得的参照分子英夫利昔单抗的IC₅₀进行校准，并且相对IC₅₀和IC₉₀值以质量单位(ng/ml)的英夫利昔单抗和scFv计算。

只有当靶标阻断抗体与其靶标结合的平衡结合常数(KD)高于效力测定中使用的靶标浓度时(KD>目标浓度)，中和测定才可以区分靶标阻断抗体的效力。对于L929测定，使用的TNFα浓度为5pM，而在TNFRI/II抑制ELISA中，使使用的TNFα浓度为960pM。因此，理论上，L929测定可以区分KD>5pM的scFv的效力，而抑制ELISA只能区分KD>960pM的scFv的效力。由于所分析的所有scFv的KD均低于960pM，因此不同亲和力(但具有相似的作用机制)的scFv的效力仅可以在L929测定中区分。

1.2.3.5靶标特异性(结合TNFα相对于结合TNFβ的选择性)

scFv对TNFα相对于TNFβ的特异性可以通过评估TNFβ与TNFα相比半数最大限度地抑制TNFα与每种scFv的结合的相对潜力来确定，并且在竞争ELISA中测量(也参见2.1.4)。蛋白质制造商已经1)通过SDS-page和HPLC分析分析了重组人TNFβ的质量，并分析了2)在小鼠L929细胞毒性测定中的生物活性。每个scFv与生物素化的TNFα之间的相互作用均被未标记的TNFα阻断，IC₅₀值范围为60至260ng/ml，而预计甚至在所测试的TNFβ的最高浓度下，TNFβ也不显示任何显著效果(1250μg/ml)。因此，预计所分析的所有scFv都与TNFα特异性地结合，但不与其最接近的同源物TNFβ结合。预计TNFβ在测试浓度下不显示TNFα与scFv结合的任何显著抑制。因此，半数最大抑制TNFα结合所需的TNFβ浓度必然显著高于测定中使用的TNFβ的最高浓度(1250μg/ml)。当比较半数最大限度地抑制TNFα与scFv结合的TNFα和TNFα浓度时，对于所有测试片段，与TNFα结合相对于与TNFβ结合的选择性预计显著高于大约5000至20’000倍。因此，任何scFv的脱靶结合似乎都不太可能。

表4：纯化的单克隆抗体(16-19-B11)的体外结合和活性特性

*：IC_{50，英夫利昔单抗}/IC_{50，测试样品}

表5：人源化scFv的体外结合和活性特性。CDR：“CDR移植物”，STR：“结构化移植物”。

*：IC_{50，英夫利昔单抗}(ng/ml)/IC_50，scFv(ng/ml)

*：用90nM的scFV在SPR中筛选

#：IC₉₀，英夫利昔单抗(ng/ml)/IC_90，scFv(ng/ml)

2.方法

2.1先导表征分析

2.1.1SPR的结合动力学和物种交叉反应性

使用MASS-1SPR仪器(Sierra Sensors)通过表面等离振子共振(SPR)测量scFv对人TNFα的结合亲和力。通过分析参照抗体抗原相互作用例如赛妥珠单抗-TNFα相互作用来限定SPR测定的性能。选择聚乙二醇化Fab片段赛妥珠单抗作为参照品，因为其单价结合模式类似于scFv。使用与scFv的亲和力测量相同的测定设置，确定赛妥珠单抗对TNFα的亲和力的值为9.94×10^-11M。该值与公布的K_D值9.02±1.43×10^-11M(BLA赛妥珠单抗；BLA号：125160；提交日期：2007年4月30日)非常一致。

对于scFv的亲和力测量，通过胺偶联将人TNFα(Peprotech，货号300-01)固定在传感器芯片(SPR-2Affinity Sensor，Amine，Sierra Sensors)上以达到50至100RU的固定水平(在SPR分析期间达到的固定水平在40至120RU之间)。在第一步中，仅使用一种scFv浓度(90nM)进行scFv的亲和力筛选。在第二步中，对于性能最佳的scFv，通过同时将不同浓度的六个分析物样品注入MASS-1系统中的八个平行通道中的每一个，从单个注射循环测量单次注射循环动力学(SiCK)。对于亲和力筛选，将人源化scFv以90nM的浓度注入流动池中3分钟，并监测解离12分钟。对于随后更精确的亲和力测定，将范围为45至1.4nM的scFv的两倍连续稀释液注射到流动池中3分钟，并使蛋白质与固定在传感器芯片上的TNFα解离12分钟。使用一对一Langmuir结合模型，用MASS-1分析软件(Analyzer，Sierra Sensors)计算表观解离(k_d)和缔合(k_a)速率常数和表观解离平衡常数(K_D)，并基于Chi²监测拟合的质量，其中Chi²是曲线拟合质量的量度。Chi²的值越小，对一对一Langmuir结合模型的拟合越准确。对于亲和力筛选，如果所分析的浓度的Chi²低于10，则认为结果有效。在分析了几种scFv浓度的情况下，如果测试的所有浓度的平均Chi²均低于10，则认为结果有效。所有测试的scFv均满足验收标准。

使用与上述人TNFα相同的试验设置并应用相同的质量评估来测量与食蟹猴(SinoBiological，货号90018-CNAE)和恒河猴(R&D Systems，货号1070-RM-025/CF)TNFα(Peprotech，货号315-01A)的物种交叉反应性。对于食蟹猴和恒河猴，TNFα固定化水平分别为50至180RU和90至250RU。使用浓度范围为45至1.4nM的两倍系列稀释液分析scFv。对于测试的所有scFv，平均Chi²值均低于10。

2.1.2TNF诱导的L929成纤维细胞凋亡(scFv对人、非人灵长类动物TNFα的中和)

使用小鼠L929成纤维细胞(ATCC/LGC Standards，货号CCL-1)评估scFv中和重组人TNFα的生物活性的能力。通过加入1μg/ml放线菌素D使L929细胞对TNFα诱导的细胞凋亡敏感。将三倍连续稀释的抗TNFα参照抗体或scFv(3000-0.05ng/ml)与5μM重组人TNFα(Peprotech，货号300-01)在室温下预孵育1小时。使用的TNFα浓度(5pM)诱导次最大强度的L929细胞凋亡(EC90)。加入激动剂/抑制剂混合物后，将细胞孵育24小时。使用WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓单钠盐)细胞增殖试剂(Sigma Aldrich，货号96992)，通过比色测定法测定细胞的存活率。WST-8被细胞脱氢酶还原成橙色甲臜产物。产生的甲臜的量与活细胞的数量成正比。使用Softmax数据分析软件(Molecular Devices)，使用四参数逻辑曲线拟合分析数据，并计算中和50％和90％TNFα诱导的细胞凋亡所需的参照抗体或scFv的浓度(IC₅₀和IC₉₀)(另见图4)。为了使IC₅₀值和IC₉₀值可以在不同天或不同测定板上进行的实验之间直接比较，针对参照抗体英夫利昔单抗校准IC₅₀值和IC₉₀值。为了控制响应的精确度，一式两份地分析剂量-反应曲线。计算每个测量点的标准偏差和CV(CV<20％)。

使用与上述人TNFα相同的试验设置并应用相同的质量评估来测量与食蟹猴(SinoBiological，货号90018-CNAE)和恒河猴(R&D Systems，货号1070-RM-025/CF)TNFα的物种交叉反应性。与人类配队物相似，使用诱导次最大强度的L929凋亡的TNFα浓度(EC90)进行物种交叉反应性测试。预期来自两个物种的TNFα均显示出与人TNFα非常相似的诱导L929小鼠成纤维细胞凋亡的效力。因此，对于所测试的两种物种，使用相同浓度的TNFα(5pM)。在物种交叉反应性测试期间，预计大多数重复测量点的CV低于10％。

2.1.3TNFα抑制ELISA

使用ELISA评估scFv对配体结合的抑制作用，ELISA是一种仅再现TNFα与TNFRI和TNFRII之间的相互作用的生化方法。

对于第一次抑制ELISA，将与人IgG的Fc区融合的TNFRI(R&D Systems，货号372-RI)的细胞外结构域以0.5μg/ml的浓度包被在96孔Maxisorp ELISA上。对于第二次抑制ELISA，将与人IgG的Fc区融合的TNFRII(R&D Systems，货号726-R2)的细胞外结构域以2μg/ml的浓度包被。两种测定的所有后续步骤均相同。为了检测TNFα与TNFRI和TNFRII的结合，在使用前将TNFα生物素化。首先将生物素化的人TNFα(960pM，50ng/ml)与3倍系列稀释的人源化抗TNFαscFv和英夫利昔单抗(10’000ng/ml-0.2ng/ml)在室温下孵育1小时。将TNFα/抗体片段混合物转移至TNF受体固定的平板，并在室温下与生物素结合的链霉抗生物素蛋白-HRP(SDT Reagents，货号SP40C)孵育20分钟后检测未封闭的TNFα与固定的TNFα受体的结合。加入3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)底物得到比色读数，其与TNFα与TNFRI和TNFRII的结合成比例。在用于竞争ELISA之前，在L929测定中证实生物素化的TNFα的生物活性。生物素化的TNFα的IC₅₀与未标记的TNFα的IC₅₀相似(数据未显示)。与上述L929测定类似，使用Softmax数据分析软件(Molecular Devices)，使用四参数逻辑曲线拟合分析数据，并计算抑制50％和90％TNFα和TNFR相互作用所需的scFv浓度(IC₅₀和IC₉₀)。为了使IC₅₀值和IC₉₀值可以在不同天或不同测定板上进行的实验之间直接比较，针对参照抗体英夫利昔单抗校准IC₅₀值和IC₉₀值。

为了控制响应的精确度，一式两份地分析剂量-反应曲线。计算每个测量点的标准偏差和CV(CV<25％)。

2.1.4靶标特异性

为了证实抗TNFαscFv的特异性，可以评估与最同源的家族成员TNFβ的结合。通过竞争ELISA，通过未标记的TNFβ(Peprotech，货号300-01B)和TNFα(Peprotech，货号300-01)分析抑制生物素化的TNFα与scFv相互作用的潜力。为此目的，将scFv以1μg/ml的浓度包被在96孔Maxisorp ELISA板上。如上所述使用生物素结合的链霉抗生物素蛋白-HRP(SDTReagents，货号SP40C)检测在5倍连续稀释的未标记的TNFα(50μg/ml-0.00013μg/ml)或TNFα(1250μg/ml-0.00013μg/ml)的存在下，生物素化的TNFα(75ng/ml)与包被的scFv的结合。对于与TNFα的剂量-反应曲线，使用Softmax数据分析软件(Molecular Devices)使用四参数逻辑曲线拟合分析数据，并计算阻断50％生物素化的TNFα与包被的scFv的相互作用所需的未标记的TNFα的浓度(IC₅₀)。预计TNFβ对生物素化的TNFα和scFv之间的相互作用没有任何显著的抑制作用。为了量化TNFβ与TNFα相比抑制TNFα与每种scFv结合的相对潜力，计算TNFβ相对于TNFα抑制相互作用的IC₅₀。由于当以比TNFα的IC₅₀高约5’000至20’000倍的浓度使用TNFβ时没有观察到明显的抑制作用，因此确定与TNFα结合比与TNFβ结合的选择性显著高于5’000至20’000倍。为了控制响应的精确度，一式两份地分析剂量-反应曲线。计算每个测量点的标准偏差和CV(除了一种测试的TNFα/b浓度外，所有CV均<25％)。预计所有scFv都符合这一标准。

2.2CMC分析

2.2.1还原SDS-PAGE

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是一种用于定性表征并控制蛋白质纯度的分析技术。根据美国药典(USP)(USP第1056章)，分析凝胶电泳是鉴定和评估药物中蛋白质的同质性的合适且常规的方法。

该方法用于量化来自大肠杆菌裂解物的scFv产物的量，以得到发酵后的表达产量。该方法的另一个应用是基于其相对于理论值的分子量来验证测试物质的身份。为了支持性目的，该方法用于量化测试样品相对于过程相关杂质(宿主细胞蛋白质)和产物相关杂质(降解产物或加合物)的纯度。

用购自Bio-Rad Laboratories有限公司的市售预制凝胶系统“Mini Protean”进行SDS-PAGE分析。在“Any KD”拆分凝胶(#456-9036)上分析人源化scFv。

在两种情况下，使用制造商推荐的Tris/甘氨酸缓冲体系。为了检测蛋白质条带，使用SimplyBlueTM染色溶液(Life Technologies公司，#LC6060)进行考马斯染色或使用Pierce Silver Stain Kit(Thermo Fisher Scientific有限公司，#24612)进行银染色。对于染色步骤，遵循相应供应商的方案。

使用文档系统ChemiDoc XRS System(Bio-Rad Laboratories有限公司，#170-8265)和软件Image Lab，版本4.0.1(Bio-Rad Laboratories有限公司，#170-9690)进行染色的蛋白质凝胶的记录和分析。

裂解物样品的滴度测定

SDS-PAGE允许特异性检测宿主细胞蛋白质混合物中的目的蛋白质。在每个凝胶上均包括了该方法的线性范围(其预先确定)内的参照标准稀释系列。使用条带强度(通过光密度测定法测量)与参照标准品的标称浓度的线性回归来计算标准曲线，该标准曲线转而用于外推样品中的scFv含量。

将产物浓度未知的裂解物样品以不同稀释度(在稀释缓冲液中至少1:10)加载，以在该方法的线性范围内具有至少一个scFv浓度。基于测量的scFv的条带强度计算产物量，并使用样品制备的稀释因子测定浓度。将标准曲线的线性范围内的所有样品的值进行平均。

作为裂解物样品定量方法的适合性的另外测试，通过在裂解物样品掺入已知量的参照标准品来进行抑制/增强测试。在1:10的在稀释缓冲液中的样品稀释度计算掺料回收率，得到值为95.4％，其与用稀释缓冲液中的参照标准品观察到的精确度相同。因此，在细胞裂解物中没有观察到显著的基质干扰，该方法被认为适合于细胞裂解物中scFv含量的定量。

蛋白质纯度和含量

为了显示该方法确定测试样品的含量并由此确定测试样品的纯度的适用性，以0.02μg的额定负荷目测(通过辨别蛋白质条带)参照品scFv的下检测限(LOD)，相应泳道的强度直方图的评估显示在该负荷下的信噪比约为2。此外，通过密度测量分析主要条带来确定定量的线性范围。

数据与线性回归的拟合，得到测定的系数(R²)为0.9998，因此表明拟合的质量良好。除了拟合的总体质量之外，还确定了每个单独数据点的相对误差以记录该方法在所选范围内的适用性。所有数据点的相对误差均低于10％，表明该方法具有良好的准确性。

2.2.2 280nM处的UV吸光度

该280nm处的UV吸光度法是如USP第1057章中概述的总蛋白质测定法。由于芳族氨基酸的存在，蛋白质溶液吸收280nm波长的UV光。UV吸光度是蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基含量的函数，并且与蛋白质浓度成比例。可以通过应用比尔定律：A＝ε*l*c，根据USP第851章关于光谱学的内容来确定未知蛋白质溶液的吸光度，其中吸光度(A)等于摩尔吸光系数(ε)、吸收路径长度和物质的浓度的乘积。用软件Vector NTI(Life TechnologiesCorporation)计算scFv的摩尔吸光系数。

使用配备有Nanoquant板(Tecan Group有限公司)的Infinity读数器M200Pro进行UV吸光度的测量。在280nm和310nm处测量蛋白质样品的吸光度，其中后一波长用作从280nm信号中减去的参照信号。为了解释样品基质的潜在干扰，对每次测量均进行扣空白(blanksubtraction)处理。获得的蛋白质样品的最终吸光度信号用于使用Lambert-Beer定律计算蛋白质浓度。

所有测量均在仪器规格给出的范围内进行，测量范围为0-4OD，制造商规定的重现性<1％，均匀度<3％。

2.2.3SE-HPLC(尺寸排阻高压液相色谱法)

SE-HPLC是一种基于固体固定相和液体流动相的分离技术，如USP第621章所述。该方法利用疏水固定相和水性流动相基于分子的大小和形状来分离分子。分子的分离发生在特定柱的空隙体积(V₀)和总渗透体积(V_T)之间。通过SE-HPLC测量Chromaster HPLC系统(Hitachi High-Technologies Corporation)上进行，该系统配备有自动样品注射和检测波长设定为280nm的UV检测器。该设备由软件EZChrom Elite(Agilent Technologies，Version 3.3.2SP2)控制，该软件还支持对所得色谱图进行分析。在注射前通过离心清除蛋白质样品，并在将自动进样器的温度保持在6℃。对于scFv样品的分析，使用ShodexKW402.5-4F柱(Showa Denko有限公司，#F6989201)，标准缓冲盐水流动相(50mM乙酸钠pH6.0，250mM氯化钠)，推荐流速为0.35mL/min。每次注射的目标样品加载为5μg。在280nm的波长下通过UV检测器检测样品，并通过合适的软件套件记录数据。在V₀至V_T的范围内分析所得色谱图，从而排除洗脱时间>10分钟的基质相关的峰。

为了确保该方法的中间精确度，在每个HPLC序列的开始和结束时常规测量参照标准品。用于该系统适用性测试的参照标准品是一个批次生产并等分以用于每个测量时间点的scFv。

2.2.3DSF(差示扫描荧光法)

DSF法是测量温度依赖性蛋白质去折叠的非药典方法。由DSF测量热解折叠温度使用MX3005P qPCR仪(Agilent Technologies)进行，该MX3005P qPCR仪由MX Pro软件包(Agilent Technologies)控制，并配备有设定在492/610nm处的激发/发射滤光片。反应设置在Thermo快速96白色PCR板(Abgene；#AB-0600/W)中。为了检测蛋白质去折叠，使用市售的染料SYPRO橙的储备溶液(Molecular Probes；#S6650)，最终稀释度为1：1’000。为了解折叠测量，将蛋白质样品在标准化缓冲盐水溶液中稀释至终浓度为50μg/mL。热解折叠通过如下温度程序进行：以25℃开始，以1℃的步长升温至96℃，每步持续时间为30秒。在该温度程序期间，记录每个样品的荧光发射。使用Microsoft Excel模板包(Niesen，NatureProtocols 2007，第2卷第9号)处理并评估记录的原始数据，并使用GraphPad Prism(GraphPad Software有限公司)程序使用玻尔兹曼方程拟合荧光数据以获得过渡中点(T_m)。

为了产生解折叠中点的可靠且稳定的测量，进行至少两次测量。关于数据质量，仅考虑拟合优度(R²)>0.9900且95％的T_m的置信区间小于0.5％的测量。

为了评估中间精度，每次测量都包括参照标准品(特征已知的scFv)，以允许比较不同日期的测定性能。

2.2.4稳定性研究

为了评估不同scFv构建体的稳定性作为这些分子可行性的读数，可以设计一项短期稳定性研究方案。将蛋白质构建体在简单的缓冲盐水制剂(参见上文)中浓缩至目标浓度为1和10mg/mL。通过SE-HPLC测定单体含量以确认纯度超过>95％的成功标准。随后将蛋白质样品在<-65℃、-20℃、4℃和37℃下储存4周，并在不同时间点分析等分试样。主要读数是通过SE-HPLC的分析，其允许对可溶性较高分子量的低聚物和聚集体定量。作为支持性测量，通过280nm处的UV吸光度确定蛋白质含量，这表明在储存期间是否通过沉淀损失了大量蛋白质。对于储存，使用螺旋盖管(Sarstedt，货号72.692.005)，每个等分试样的填充量为30-1500μg。另外，通过SDS-PAGE测定纯度，其表明构建体在降解或共价多聚化方面的稳定性。

实施例3：人源化双抗体和IgG的生成

通过将可变结构域排列为VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA构型来设计单链双抗体构建体。在这些构建体中，VLA和VHA以及VLB和VHB结构域共同形成TNFα的结合位点。连接可变结构域的肽接头L1-L3由甘氨酸/丝氨酸重复构建。两个短接头L1和L3由单个G₄S重复组成，而长接头L2由序列(G₄S)₄组成。编码人源化可变结构域的核苷酸序列(实施例2；1.2.1。)从头合成并克隆到适合大肠杆菌表达的载体中，该载体基于pET26b(+)骨架(Novagen)。如在实施例2第1.2.1节中关于scFv所述进行表达和纯化。

通过将可变结构域克隆到适于瞬时异源表达的哺乳动物表达载体中来构建人源化IgG，该哺乳动物表达载体含有前导序列和相应的恒定结构域，例如，pFUSE-rIgG载体(Invivogen)。通过在CHO S细胞中用FreeStyle^TM MAX系统共转染编码重链和轻链的载体来进行功能性IgG的瞬时表达。培养数天后，回收抗体分泌细胞的上清液用于纯化。随后，通过蛋白A琼脂糖凝胶(GE Healthcare)亲和纯化分泌的IgG。通过SDS-PAGE、在280nm处的UV吸光度和SE-HPLC分析洗脱级分。

可以使用如实施例2第2.1.1节所述的Biacore仪器来测定抗体分子的亲和力。

可以在L929测定(该方法描述于实施例2第2.1.2节)中测定抗体分子的效力。

实施例4：TNFα结合的化学计量的测定

使用SE-HPLC测定16-19-B11(在四特异性抗体构建体PRO357的背景下，其包含抗TNF可变区16-19-B11-sc06作为四种特异性之一)与TNFα的结合化学计量。将四特异性构建体和TNFα以两种不同的摩尔比孵育，即以1：1和4.5：1的摩尔比孵育。由于TNFα在溶液中以三聚体存在，因此所示的摩尔比是指TNFα三聚体。因此，在4.5：1比例中，四特异性构建体中16-19-B11的结合结构域过量，并且应该占据所有TNFα三聚体结合位置，产生1个TNFα三聚体与3个scFv的复合物。然而，在等摩尔条件下，没有足够的16-19-B11结合结构域来饱和所有的3个理论上的TNFα结合位点。因此，预期还具有结合了少于3个结合结构域的复合物变体。将TNFα和四特异性构建体在室温下孵育2小时以使复合物形成。然后将样品在4℃下离心10分钟。在SE-HPLC上分析10μL的每种样品。用50mM磷酸盐缓冲液pH 6.5，以300mM NaCl作为洗脱液，以0.35mL/min的流速进行SE-HPLC分析。在280nM的波长下检测到洗脱的蛋白质峰。使用GE Healthcare(LMW，HMW)的凝胶过滤校准试剂盒预先校准柱子以测定表观分子量。

图6的下图显示了等摩尔量的四特异性构建体和TNFα的洗脱曲线，其与单独的TNFα三聚体和单独的四特异性构建体的曲线重叠。由于溶液中TNFα的三聚化，理论上每个三聚体上存在至多三个16-19-B11的结合结构域的等同结合位点，因此四特异性构建体是有限的。在这些条件下，鉴定了所有三种复合物质(3：1、2：1、1：1)。图6的上图示出了具有过量四特异性构建体的复合物的洗脱曲线。剩余的未结合的四特异性构建体在预期的保留时间洗脱。TNFα峰被定量消耗用于复合物形成并完全消失。该复合物的峰向较低保留时间移动，并且与等摩尔设置的最大分子量的峰的保留时间良好相关。由于这个原因，可以得出结论，TNFα上所有可用地结合位点都被16-19-B11占据，因此，如果四特异性构建体过量，则结合化学计量为3：1(16-19-B11：TNFα)。

除了这些定性观察之外，还可以基于SE-HPLC所测定的复合物的表观MW来计算表观结合化学计量。可以基于保留时间，根据以下方程式计算表观MW：

实施例5：细胞增殖的抑制

在混合淋巴细胞反应(MLR)中测试了不同抗体形式的16-19-B11和阿达木单抗抑制外周血单核细胞(PBMC)增殖的能力。将来自2个健康供体的PBMC在96孔板中以1：1的比例在37℃/5％CO₂下培养(RPMI1640)48小时。活化后，在37℃/5％CO₂下用抗TNFα抗体或IgG对照抗体(终浓度均为10μg/mL)再处理细胞5天，一式六份。在孵育结束前24小时，向每个孔中加入BrdU(20uL/孔)，并使用市售细胞增殖ELISA(Roche Diagnostics)通过测量BrdU摄取来测定增殖。通过计算抗体处理的细胞和丝裂霉素C(25ng/mL)处理的细胞之间BrdU摄取的比例来确定刺激指数。

实施例6：LPS诱导的细胞因子分泌的抑制

将RPMI1640中的CD14⁺单核细胞接种在96孔板中，并在加湿培养箱中在37℃/5％CO₂下孵育16小时。然后使用2至2000ng/mL的最终抗体浓度用抗TNFα抗体或IgG对照抗体处理细胞1小时，一式两份。用细胞培养基洗涤单核细胞3次，然后用LPS(100μl/mL)在37℃/5％CO₂下孵育4小时。使用市售ELISA试剂盒(R&D Systems)测定细胞培养上清液中的IL-1β和TNFα浓度。

表6：Vκ1共有序列(重排)

表7：基于Vλ种系的框架IV序列

SEQ ID NO：	序列
		36	FGTGTKVTVL
37	FGGGTKLTVL
		38	FGGGTQLIIL
39	FGSGTKVTVL

序列表

<110> 努玛创新有限公司

<120> 抗TNFα抗体及其功能片段

<130> 112257P877PC

<150> EP16000653.2

<151> 2016-03-17

<160> 39

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工CDR序列; 位置"X"代表有限多样性的位置

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> X (或Xaa) 是由氨基酸残基E和Q组成的有限多样性的占位符

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> X (或Xaa) 是由氨基酸残基N和S组成的有限多样性的占位符

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> X (或Xaa)是由氨基酸残基A和S组成的有限多样性的占位符

<400> 1

Gln Ala Ser Xaa Ser Ile Ser Xaa Trp Leu Xaa

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工CDR序列

<400> 2

Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工CDR序列; 位置 "X"代表有限多样性的位置

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> X (或Xaa)是由氨基酸残基N和S组成的有限多样性的占位符

<400> 3

Gln Gly Tyr Tyr Tyr Ser Xaa Ser Gly Asp Asp Asn Ala

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工CDR序列; 位置 "X"代表有限多样性的位置

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> X (或Xaa)是由氨基酸残基R、S和T组成的有限多样性的占位符

<400> 4

Gly Ile Asp Phe Ser Xaa Tyr Gly Ile Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工CDR序列; 位置 "X"代表有限多样性的位置

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> X (或Xaa)是由氨基酸残基I和T组成的有限多样性的占位符

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> X (或Xaa)是由氨基酸残基N和S组成的有限多样性的占位符

<400> 5

Tyr Ile Tyr Pro Asp Tyr Gly Xaa Thr Asp Tyr Ala Xaa Trp Val Asn

1 5 10 15

Gly

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工CDR序列; 位置 "X"代表有限多样性的位置

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> X (或Xaa)是由氨基酸残基R和S组成的有限多样性的占位符

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> X (或Xaa)是由氨基酸残基E和H组成的有限多样性的占位符

<400> 6

Arg Ser Gly Ser Tyr Tyr Ser Xaa Gly Trp Gly Ala Xaa Tyr Phe Asn

1 5 10 15

Leu

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工CDR序列

<400> 7

Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工CDR序列

<400> 8

Gln Gly Tyr Tyr Leu Asp Ser Ser Val Asp Asp Asn Val

1 5 10

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工CDR序列

<400> 9

Gly Ile Asp Phe Ser Thr Tyr Gly Ile Ser

1 5 10

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工CDR序列

<400> 10

Tyr Ile Tyr Pro Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Val Asn

1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工CDR序列

<400> 11

Arg Ser Gly Ser Tyr Tyr Ser Arg Gly Trp Gly Ala His Tyr Phe Asn

1 5 10 15

Leu

<210> 12

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体VH序列

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Val

50 55 60

Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Ser Tyr Tyr Ser Arg Gly Trp Gly Ala His Tyr Phe

100 105 110

Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 13

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体VH序列

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Tyr Ile Tyr Pro Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Val

50 55 60

Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Ser Tyr Tyr Ser Arg Gly Trp Gly Ala His Tyr Phe

100 105 110

Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 14

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体VH序列

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Tyr Ile Tyr Pro Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Val

50 55 60

Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Ser Tyr Tyr Ser Arg Gly Trp Gly Ala His Tyr Phe

100 105 110

Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 15

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体VL序列

<400> 15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Leu Asp Ser Ser

85 90 95

Val Asp Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体VL序列

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro

65 70 75 80

Ala Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Leu Asp Ser Ser

85 90 95

Val Asp Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 17

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体VL序列

<400> 17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Arg Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Leu Asp Ser Ser

85 90 95

Val Asp Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 18

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体scFv序列

<400> 18

Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser

20 25 30

Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Leu Asp Ser

85 90 95

Ser Val Asp Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

130 135 140

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile

145 150 155 160

Asp Phe Ser Thr Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

165 170 175

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Asp Tyr Gly Ile Thr Asp

180 185 190

Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

195 200 205

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

210 215 220

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Ser Tyr Tyr Ser Arg Gly Trp

225 230 235 240

Gly Ala His Tyr Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

245 250 255

Ser Ser

<210> 19

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体scFv序列

<400> 19

Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser

20 25 30

Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Pro Ala Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Leu Asp Ser

85 90 95

Ser Val Asp Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

130 135 140

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ile

145 150 155 160

Asp Phe Ser Thr Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

165 170 175

Gly Leu Glu Trp Ile Ala Tyr Ile Tyr Pro Asp Tyr Gly Ile Thr Asp

180 185 190

Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ser

195 200 205

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

210 215 220

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Ser Tyr Tyr Ser Arg Gly Trp

225 230 235 240

Gly Ala His Tyr Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

245 250 255

Ser Ser

<210> 20

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体scFv序列

<400> 20

Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser

20 25 30

Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Arg Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Leu Asp Ser

85 90 95

Ser Val Asp Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

130 135 140

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile

145 150 155 160

Asp Phe Ser Thr Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

165 170 175

Gly Leu Glu Trp Ile Ala Tyr Ile Tyr Pro Asp Tyr Gly Ile Thr Asp

180 185 190

Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ala

195 200 205

Gln Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

210 215 220

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Ser Tyr Tyr Ser Arg Gly Trp

225 230 235 240

Gly Ala His Tyr Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

245 250 255

Ser Ser

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工CDR序列

<400> 21

Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ser

1 5 10

<210> 22

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工CDR序列

<400> 22

Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 23

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工CDR序列

<400> 23

Gln Gly Tyr Tyr Tyr Ser Ser Ser Gly Asp Asp Asn Ala

1 5 10

<210> 24

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工CDR序列

<400> 24

Gln Gly Tyr Tyr Tyr Ser Asn Ser Gly Asp Asp Asn Ala

1 5 10

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工CDR序列

<400> 25

Gly Ile Asp Phe Ser Ser Tyr Gly Ile Ser

1 5 10

<210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工CDR序列

<400> 26

Gly Ile Asp Phe Ser Arg Tyr Gly Ile Ser

1 5 10

<210> 27

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工CDR序列

<400> 27

Tyr Ile Tyr Pro Asp Tyr Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Val Asn

1 5 10 15

Gly

<210> 28

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工CDR序列

<400> 28

Tyr Ile Tyr Pro Asp Tyr Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Asn Trp Val Asn

1 5 10 15

Gly

<210> 29

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工CDR序列

<400> 29

Arg Ser Gly Ser Tyr Tyr Ser Ser Gly Trp Gly Ala Glu Tyr Phe Asn

1 5 10 15

Leu

<210> 30

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物序列

<400> 30

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 31

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物序列

<220>

<221> REPEAT

<222> (1)..(5)

<223> 通用接头序列 (GGGGS)n, n选自2, 3, 4, 5和6

<400> 31

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 32

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物序列

<400> 32

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 33

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体框架序列

<400> 33

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

20

<210> 34

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体框架序列

<400> 34

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 35

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体框架序列

<400> 35

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 36

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体框架序列

<400> 36

Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

1 5 10

<210> 37

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体框架序列

<400> 37

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

1 5 10

<210> 38

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体框架序列

<400> 38

Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ile Ile Leu

1 5 10

<210> 39

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工抗体框架序列

<400> 39

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

1 5 10

Claims

1.能够与人肿瘤坏死因子α(TNFα)结合的抗体或其功能片段，其中所述抗体或功能片段包含

(i)V_L结构域，其包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述CDR1区具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，所述CDR2区具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，所述CDR3区具有与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，以及

(ii)V_H结构域，其包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述CDR1区具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，所述CDR2区具有与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，所述CDR3区具有与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或功能片段包含

(i)V_L结构域，其包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述CDR1区具有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，所述CDR2区具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，所述CDR3区具有如SEQ IDNO：8所示的氨基酸序列，以及

(ii)V_H结构域，其包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述CDR1区具有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，所述CDR2区具有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，所述CDR3区具有如SEQID NO：11所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或功能片段

(ii)与恒河猴(Rhesus)TNFα和食蟹猴(Cynomolgus)TNFα交叉反应；

(iii)抑制TNFα诱导的细胞凋亡的效力大于英夫利昔单抗的效力；

(iv)包含可变结构域，所述可变结构域具有由差示扫描荧光测定法所测定的至少60℃，特别是至少63℃，更特别是至少66℃的融解温度；和/或

(v)能够以至少2的化学计量(抗体：TNFα_三聚体)与人TNFα_三聚体结合。

4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其功能片段，其与人TNFα结合的K_D小于75pM。

5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或功能片段包含V_H结构域，所述V_H结构域具有如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。

6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其功能片段，其中所述抗体或功能片段包含V_L结构域，所述V_L结构域具有如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。

7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其功能片段，其是单链可变片段(scFv)。

8.根据权利要求7所述的抗体或其功能片段，其中所述scFv具有如SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列。

9.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其功能片段，其是免疫球蛋白G(IgG)。

10.一种抗体或其功能片段，其与根据权利要求8所述的功能片段结合基本上相同的表位。

11.编码根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其功能片段的核酸。

12.包含根据权利要求11所述的核酸的载体或质粒。

13.包含根据权利要求11所述的核酸或根据权利要求12所述的载体或质粒的细胞。

14.一种制备根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其功能片段的方法，其包括在允许表达编码所述抗体或其功能片段的核酸的条件下，在培养基中培养根据权利要求13所述的细胞，并从细胞或培养基中回收抗体或其功能片段。

15.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其功能片段，和任选的药学上可接受的载体和/或赋形剂。

16.如权利要求1至10中任一项所定义的抗体或其功能片段，其用于治疗TNFα相关病症或疾病的方法。