CN109152355A - 用于冷冻保存的生物样本的温度监测的方法和设备 - Google Patents

用于冷冻保存的生物样本的温度监测的方法和设备 Download PDF

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Abstract

一种用于冷冻保存的生物样本的温度监测的设备，包括具有用于接收生物样本(6)的接收空间(2)和用于封闭该接收空间的盖(3)的样本容器(1)。该设备还包括设置在样本容器内部，特别是在接收空间内和/或在盖内的腔室，该腔室的内部空间(12；22；32；42)不与接收空间(2)流体连接，并且仅部分填充有至少一种熔化温度在‑20℃至‑140℃范围的指示剂物质(7)。本发明还包括用于监测冷冻保存样本的温度的方法，包括下列步骤：提供用于监测温度的设备(10；20；30；40)；冻结一种或多种指示剂物质，其中所述至少一个腔室在冻结一种或多种指示剂物质期间设置在第一位置，和冻结后在低于一种或多种指示剂物质的熔化温度的温度下设置到第二位置，在该第二位置处一种或多种指示剂物质的熔化由于重力作用导致腔室填充物的至少部分位移和/或形状变化。

Description

用于冷冻保存的生物样本的温度监测的方法和设备
本发明涉及一种用于冷冻保存的生物样本的温度监测的方法。本发明还涉及一种用于冷冻保存的生物样本的监测温度的设备。
细胞的低温保存(冷冻保存)是迄今为止在细胞层面上可逆(活性保持)地保持生命过程、从而在加热到生理温度后可以再次启动该生命过程的唯一途径。冷冻保存在近几十年来经由大型生物库发展成为对于临床机构、医药公司、物种保存、环境保护和保健来说不可或缺的要素。生物材料被储存在不同尺寸的耐受低温的样本容器(冷冻容器)例如管、吸管和袋中。在冷冻保存过程中，被储存的生物材料被冷冻以保持样本材料的活力，大多冷冻到低于-80℃的温度，对于活体采集品冷冻到低于-140℃直至液氮温度。在下文中，对于冷冻保存样本或供冷冻保存的样本还使用术语“冷冻样本(Kryoprobe)”。
对于宏观样本，例如比如血液或组织，已经开发了用于在低温情况下储存样本的许多技术。在现代医学、基因工程和生物学中，存在对越来越小的样本进行冷冻保存的趋势。例如冷冻含有悬浮细胞或细胞群的小体积悬浮液(毫升或更小)。来自体外培养物的细胞主要在悬浮液中进行冷冻保存。然而，大多生物医学相关细胞为了进行繁殖和有序发育需要与底物接触。因此，样本必要时在底物结合状态下培养之后被冷冻。
样本的品质是至关重要的，这是因为它们对于临床机构的细胞疗法、药物和生物技术产品的开发来说被用作国家资源并且用于许多其他应用。储存时间为几天到几十年，且存在长期储存的趋势。样本存放在冷藏容器中，后者大多数存放在金属抽屉和货架中，在新的存入或取出时它们会经历温度波动。对于活体货架(Lebendablagen)(细胞、细胞悬浮液和组织片段)，不仅不中断的冷链起着决定性的作用，而且也要避免在深冻阶段大的温度跃升。因为在取出时冷冻容器从-80℃加热到-20℃的温度很少甚至不会被发现，所以尽管该冷冻容器再次经冷冻，但发生了未被识别的品质降低，这不仅降低了样本的价值，而且在临床领域应用时还会导致危及生命的情况。即便是曾短暂解冻样本，在重新冷冻的状态下，也不会注意到这些样本已不再与初始状态相符。但特别重要的不仅是识别生物材料的解冻，而是记录处于-140℃至-20℃范围的极限温度被超过。需要对每个样本进行温度控制和温度记录，然而该需求到目前为止很少被满足——而且即便是满足了该需求，也需要高的技术投入。此外，还有大量的解冻后实验室研究，这同样消耗有价值的样本材料，并且即使在当前已变得没有价值的冷冻样本的情况下也会产生费用。
因此本发明的任务在于提供一种用于冷冻保存生物样本的温度监测的改进方法，凭借该方法可以避免常规技术的缺陷并且其特点在于简化的方法实施。另一任务在于提供一种用于冷冻保存的生物样本的温度监测的设备，凭借该设备可以避免常规技术的缺陷。
另一项任务在于提供一种可能性，以便能够以尽可能简单的标志物或标记识别冷冻样本曾经被加热超过可定义的极限温度，即便是仅仅在短时间内超过该可定义的极限温度。在冷冻前，极限温度必须可在-20℃至-140℃的范围内确定。这应当能够在每一个单独的冷冻样本上、进而在数百万个样本上快速且容易地识别，不得改变生物材料并且应当已经在深度冷冻状态下进行。如果可能的话，样本的状况应当即便在储存容器中也是可探测的，因为每次取出和存入都会给储存物中多个样本带来发生样本改变的风险，这是因为通常整个货架都被拉开。该设备或方法应当能够简易操作，耐低温且可调节的。其允许消耗很少或不消耗能量并且尽可能仅产生极低的费用，因为生物样本在冷藏状态下的储存在其整个应用过程中应仅花费几欧元。所用材料也必须符合所述要求。
这些任务通过具有独立权利要求的特征的设备和方法得以实现。本发明的有利实施方式和应用由从属权利要求得到，并且将在后续说明中部分地参照附图予以详述。
根据本发明的第一观点，所述任务通过一种用于冷冻保存的生物样本的温度监测的方法来实现。为了实施该方法，提供了一种用于冷冻保存的生物样本的温度监测的设备。
根据本发明的第二观点，应当公开和请求保护一种用于冷冻保存的生物样本的温度监测的设备本身作为主题。为了避免重复，与设备有关的描述、特别是与设备的有利实施方式变型有关的描述，应当认为是作为纯设备公开的且作为方法公开的，并且可请求保护。
用于冷冻保存的生物样本的温度监测的设备包括具有用于接收样本、特别是生物样本的接收空间(样本贮器)的样本容器。接收空腔可包含冷冻保存的生物样本。
所述设备还包括其内部空间不与接收空间流体连接的腔室。此外，所述内部空间仅部分填充有至少一种指示剂物质，该指示剂物质在标准压力下(即在1013.25mbar下)的熔化温度在-20℃至-140℃的范围。
通过根据本发明的设备的腔室提供了附加隔间，其可以通过部分填充指示剂物质而用作指示元件或指示装置，以指示不希望的超过极限温度。该用指示剂物质部分填充的腔室因此在下文中也称为指示装置。
根据一个特别优选的实施方式，将所述腔室设置在样本容器的内部，特别是在接收空间内和/或在盖内。设置在样本容器的内部提供了下面的特别优点：无需提供在样本容器外部的额外结构空间。然而，所述腔室也可以设置在样本容器的外部，或者整合到接收空间的壁中。
样本容器是适于冷冻保存的容器，例如管，吸管(也称为精液管)，用于储存血液或干细胞的袋子、盒子或适于冷冻保存的其他容器。这类容器也相应地称为冷冻管，冷冻吸管，冷冻袋，冷冻盒或统称为冷冻容器。
根据一个特别优选的实施方式，所述样本容器是冷冻管。冷冻管也称为生物库管或冷冻库管。冷冻管具有接收空间，该接收空间形成用于接收生物样本的内部空腔。冷冻管通常还具有用于封闭接收空间的盖。盖可以具有嵌接部(Eingriff)，该盖可以用工具经由嵌接部旋转。冷冻管还可以具有底部元件，该底部元件具有标识，例如为机器可读代码的形式的标识。
该方法还包括冷冻指示剂物质，其中将用于冷冻指示剂物质的腔室引入第一位置，使得液态的指示剂物质流入腔室的第一部分容积并在那里冻结。然后，尤其是冷冻储存的监测阶段之前和期间，将带有经冻结的指示剂物质的腔室引入第二位置，在此第二位置所述指示剂物质的熔化由于重力作用导致腔室填充物的配置改变。所述配置改变可以为腔室填充物的至少部分位移和/或腔室填充物的形状改变。所述腔室填充物可以由指示剂物质形成，或者由指示剂物质和一种或多种设置在该腔室内并具有比指示剂物质更高密度的固体物体形成。
换句话说，指示剂物质在这样的几何形状或位置被冷冻并且腔室在处于冷冻的状态中(例如在储存温度或至少低于设定的极限温度或指示剂物质的熔化温度时)改变其位置，使得在该位置改变后指示剂物质的熔化导致液体或其边界几何形状的可见位移，或者导致布置在腔室内的固体物体的位移，该固体物体在指示剂物质熔化后不再冻结在其中。
腔室填充物的这种配置变化可以通过观察或者也在技术上自动化地来立即确定“是否超过了极限温度”。
根据该方法现在提供了这样的可能性：将包含具有冷冻保存样本的样本容器和至少一个具有冻结的指示剂物质的腔室的设备储存以进行冷冻保存，其中用于监测温度的所述至少一个腔室设置在所述样本容器上的所述第二位置。
在之后的时间点可以检查或确定：是否发生了由于超过指示剂物质的熔化温度而引起的腔室填充物的配置变化，例如是否发生了腔室填充物的至少部分位移和/或形状变化。
如果发生了这种情况，则可以推断出：超过了指示剂物质的熔点和因此超过了待监测的极限温度，特别是即便所述超过仅仅在短时间内发生也是如此。
因此，本发明的一个特别的优点在于：腔室填充物(例如指示剂物质)的配置改变直接指示冷冻样本是否曾经被加热到超过可定义的极限温度，即便仅在短时间内超过也是如此。这可以通过目视检查或者通过相应设置的测量装置在技术上自动化地来快速且容易地确定，而不必将样本从样本容器中取出或解冻。根据一个特别优选的实施方式，该腔室的内部空间可以分隔成多个彼此分开的部分空间，这些部分空间各自仅部分地填充有熔化温度在-20℃至-140℃范围的指示剂物质，其中在这些部分空间内的指示剂物质具有不同的熔化温度。因此，可以监测不同的温度极限值，其中如此选择每种指示剂物质和/或设定它们的混合比，使得它们的熔点相应于待监测的温度极限值之一。该实施方式具有的优点是，可以更精确地缩小样本到达的所实现的温度区间。
此外，样本容器和腔室壁在至少一个位置处可以是透明的或半透明的，使得从外部可以看到是否发生了指示剂物质的配置改变，例如位置变化。优选地，样本容器和腔室的整个壁设为透明或半透明的。
为了能够更好地识别，指示剂物质可以含有指示剂添加剂，该指示剂添加剂增加指示剂物质的物理性质的可探测性。指示剂添加剂可以例如是染料，使得指示剂物质是有色的或被着色，也即是不透明的，因此其形状和/或位置在视觉上更容易识别。
原则上，任何满足至少下列条件的染料都可以考虑作为染料：
-即使在少量和低浓度下(例如，从<1体积％的饱和染料溶液添加起，通常在千分之几或万分之几范围)也具有强烈的染色能力。
-耐霜冻
-在发运以及重要的低温情况下是耐光的
-可溶于指示剂物质的所有成分
-在冷冻时不脱混
-不与指示剂物质所接触的塑料材料反应。
优选地，染料选自包括下列物质的组：三苯甲烷染料、罗丹明染料、尤其是呫吨，偶氮染料以及吩嗪和吩噻嗪染料。
在更具体的实施方式中，所述染料选自包括下列物质的组：油红、甲基红、亮绿、罗丹明B、中性红、亚甲基蓝或在细胞学中用于细胞染色的其他染料。
指示剂添加剂可以是颗粒，特别是纳米颗粒，其增加指示剂物质对照射在该指示剂物质上的电磁辐射的散射效应和/或偏振效应。由此，可以通过光学透射测量、散射测量和/或偏振测量更可靠地探测指示剂物质的配置改变。指示剂添加剂可以是导电颗粒。通过混入导电颗粒可以影响指示剂物质的导电性或阻抗。以这种方式，可以通过导电性测量或阻抗测量来探测指示剂物质的配置改变。
根据一个优选实施方式，该设备可具有被设计用于检测腔室填充物的配置状态(例如指示剂物质在腔室中的位置)的测量装置。该测量装置可以是光学或光电的测量装置，以例如借助光学透射、散射光或反射测量来确定指示剂物质的配置改变。
作为指示剂物质，可以选择熔化温度相应于预定极限温度的物质，其中该极限温度的超过要被监测。指示剂物质是液体或不同液体的混合物，该液体或该混合物熔点相应于所期望的极限温度。仅仅作为举例，作为指示剂物质可以选择水(H2O)和乙醇(C2H6O)的混合物、水(H2O)和氢氧化钾(KOH)的混合物或者水和防冻剂的混合物。在此，混合比根据说明熔点与混合比之间的关系曲线的相应熔点图进行调节，使得液体混合物的熔点具有所希望的值，即待监测的极限温度。
在一个优选的实施方式中，指示剂物质包含选自包括下列物质的组的至少一种醇：1-辛醇、1-壬醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、2-丁醇、1,5-戊二醇、1-戊醇、环戊醇、苯甲醇。特别优选地，所述至少一种醇选自1,3-丙二醇、1,2-丙二醇和2-丁醇。
在另一个优选的实施方式中，指示剂物质包含至少两种不同的醇组分：
a)醇，选自包括下列物质的组：1-辛醇、1-壬醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、2-丁醇、1,5-戊二醇、1-戊醇、环戊醇、苯甲醇；
b)醇，选自包括下列物质的组：1-辛醇、1-壬醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、2-丁醇、1,5-戊二醇、1-戊醇、环戊醇、苯甲醇，其具有低于组分a)的醇的熔点；其中组分a)和b)混合比如此调节，使得该混合物的熔化温度落入-20℃至-160℃，尤其是-25℃至-160℃或-50℃至-150℃的温度范围内。
更具体的实施方式的特点在于，指示剂物质包含组分a)和b)的以下组合之一：
-1-辛醇和2-丁醇，混合比为5-95体积％；
-1-辛醇和1-戊醇，混合比为5-95体积％；
-1-辛醇和1,2-丙二醇，混合比为5-95体积％；
-1-壬醇和2-丁醇，混合比为5-95体积％；
-1-壬醇和1,2-丙二醇，混合比为5-95体积％；
-1-壬醇和1-戊醇，混合比为5至95体积％；
-1,2-丙二醇和2-丁醇，混合比为5至95体积％；
-1,2-丙二醇和1,3-丙二醇，混合比为5-95体积％；
-1,2-丙二醇和1,2-丁二醇，混合比为5-95体积％；
-1,3-丙二醇和2-丁醇，混合比为5-95体积％；
-1,3-丙二醇和1,2-丁二醇，混合比为5-95体积％；
-1,5-戊二醇和2-丁醇，混合比为5-95体积％；
-苯甲醇和2-丁醇，混合比为5至95体积％；
-1-戊醇和2-丁醇，混合比为5-95体积％；
-1-戊醇和甲醇，混合比为5至95体积％；
-环戊醇和2-丁醇，混合比为5-95体积％；
-环戊醇和1,2-丙二醇，混合比为5-95体积％；
-环戊醇和1-戊醇，混合比为5至95体积％；
-环戊醇和1,2-丁二醇，混合比为5-95体积％；
其中给出的混合比的值分别是指两种组分的混合物中首先提到的组分的份额。
在特别优选的实施方式中，指示剂混合物包括例如混合比为40-60体积％的1,2-丙二醇和2-丁醇(产生约-90℃的熔化温度)、混合比为30-70体积％的1,2-丙二醇和1,3-丙二醇、或混合比为30-70体积％的1,3-丙二醇和2-丁醇。
除了所述至少一种醇之外，指示剂物质优选还包含至少一种如上所述的染料。特别优选地，这种染料选自包括下列物质的组：油红、甲基红、亮绿和罗丹明B。
更具体的实施方式的特征在于，所述指示剂物质包含两种醇a)和b)，选自优选呈如上所列的混合比的1,3-丙二醇、1,2-丙二醇和2-丁醇，并且包含染料，所述染料选自油红、甲基红、亮绿和罗丹明B。
醇组分中染料的浓度可根据染料和醇的不同而剧烈变化。
通常，在强烈着色情况下浓度应保持尽可能低，使得染料分子不会改变溶解它们的醇的冻结特性和熔融特性，或者不升高其粘度。染料浓度通常在<10体积％的范围内，特别是<1％或<0.1％，即处于百分之几或千分之几或万分之几的范围。
在一个本发明的变型方案中，待监测的极限温度并不直接相应于指示剂物质的熔化温度，而是相应于高于熔化温度的某温度，熔化物质的粘度在此温度降低到能够发生所希望的流体输送的程度。
这种温度在本文中也称为阈值温度，并且通常处于在标称熔化温度之上3-30℃或5-30℃例如3-10℃、3-20℃、5-10℃或5-20℃的温度范围内。
由此，在一个有利的实施方式中，所述指示剂物质的特征在于，该液体混合物在高于熔化温度3-30℃或5-30℃的温度范围内具有10-106mPa*s，优选10-104mPa*s的粘度。
所述样本容器还可以具有用于封闭接收空间的盖。该盖可以具有与接收空间的上部末端区域嵌接的柄。该柄可以模制到盖的头部部件，使得该头部部件在盖处于套上或拧上的状态下套在接收空间上，而柄嵌接到接收空间的上部末端区域中。
根据一个特别优选的实施方式，所述腔室可以整合到盖中，例如头部和/或柄中。这提供了以下优点：引入的指示装置不会污染储存在接收空间内的生物样本，因为其不与生物样本相接触，而是被封闭在无论如何都要用到的盖中。另外的优点在于，用作指示装置的腔室连同盖可以与剩余的样本容器在空间上分开地进行储存和准备(例如在第一位置冻结指示剂物质)。特别有利的是将腔室整合到盖的柄中。根据这一变型方案，盖的柄具有部分填充有指示剂物质的空腔。特别在冷冻管的情况下经常只有接收空间的下部部分容积填充有生物样本，使得上部部分容积可以用来安置指示剂物质。
根据另一优选实施方式，腔室设计为封闭的中空体，其布置在盖下方的样本容器的接收空间中。该变型方案提供了可以利用常规冷冻容器的优点。
在该实施方式中，封闭的中空体可以松散地设置在存在于接收空间中的冷冻保存的生物样本上，例如放在其上面。
实现本发明的一种可能性在于，在腔室的内部空间中松散地布置至少一个固体物体，其具有比指示剂物质更高的密度。固体物体可以是金属物体。松散地布置是指，所述至少一个物体被放置在腔室的内部空间内，并且在此处至少在指示剂液体的液体凝聚态情况下原则上可自由运动，除非其被指示剂物质冻住。
根据一种变型方案，只有体积大于指示剂物质体积的固体物体可以松散地布置在腔室中。根据另一变型方案，至少两个固体物体可以存在于腔室的内部空间中，其中固体物体的体积均小于指示剂物质的体积。
这种设置的优点在于，甚至可以利用熔点低于-100℃，更优选远低于-100℃的液体，其大多具有相当高的粘度。这样，指示剂物质不会在壁上流到腔室的底部，而是保留在腔室的上部。与此不同，松散地布置在腔室中的一个或多个重的物体从液体掉落到底部。这可以是例如通过针对性设计的测量装置例如光学传感器、用于测量导电性的传感器等来进行探测。也可以目视确定该状态。
术语“样本容器”特别是指被设计用于冷冻保存的容器。样本容器优选使用对于低于-140℃温度的具有低温耐受性的塑料材料制成。塑料材料可以承受反复的温度变化而不会发生变化而且不会损坏。优选使用吸水能力<自重的1％，特别是<自重的0.1％的塑料材料。根据本发明的冷冻储存元件例如基于聚氨酯或聚乙烯。
术语“生物样本”是指生物材料如细胞、组织、细胞成分、生物大分子等，其在样本容器中经受冷冻保存——必要时在悬浮液中和/或与底物材料相结合。因此，可以将底物布置在接收空间中，该底物被设置用于粘附性地接收作为生物样本的一部分的生物细胞。
本发明的上述优选实施方式和特征可以彼此组合。下面将参考附图描述本发明的进一步细节和优点。其中：
图1-4是用于冷冻保存的生物样本的温度监测的设备的各种实施例的示意图；
图5是阐述用于冷冻保存的生物样本的温度监测的方法的实施例的流程图；
图6A、6B、7A分别是液体混合物的熔点图；
图7B是具有一些纯液体熔点的表格；和
图8示出了溶剂的混溶性矩阵。
在所有附图中，相同或功能等同的元件由相同的附图标记表示，和部分未特别绘出。
图1的示意性剖面图A-E阐述了本发明的第一工作实施例。
在此，在图1A中以剖面绘出了冷冻管的圆柱形接收部件1。由圆柱形接收部件1形成的接收空腔2在这里已经被生物样本6填充。生物样本6可以例如是细胞悬浮液。在图1B中示出了用于冷冻管1、3的可通过螺纹8拧上的盖3，其立在头部，封闭接收部件1并且在上部任选地具有嵌接部4，盖3可以借助工具(未示出)经由该嵌接部4在自动化的情况下旋转。该盖在可拧上的部件(即在柄5)中含有形成空容积12的腔室11，该柄5在拧上的状态下嵌接到接收容积2中。该空容积12部分填充有液体或液体混合物形式的指示剂物质7，所述液体或液体混合物的凝固点/熔点在-20℃至-100℃的范围内通过混合比如此选择，使得熔点具有待监测的温度极限值的值。在下文中还将依据图5-8对此进行更详细地解释。
为了储存这样的生物样本6，将处于如图1A所示的敞开状态的冷冻管1和处于如图1B所示的立在头部位置的盖3深度冷冻到储存温度。由此，最初处于液体凝聚态的指示剂物质7在重力作用下汇集在腔室11的空容积12的部分容积12b中，并在此处在冷却到储存温度或者冷却到至少低于指示剂物质7熔化温度的温度时冻结。
在至少低于指示剂物质7的熔化温度的储存温度，将可拧上的盖3旋转180°并如图1C和图1D那样拧上以封闭在图1中示出的圆柱形接收部件1。在部分容积12b中冻结的指示剂物质7保留在腔室的上部部分容积12b中。下部部分容积12a基本没有指示剂物质7。
由此形成的用于温度监测的设备10现在可以进行冷冻储存。在此形式，大多以竖直立在接收部中的方式将设备10储存在低温容器中。
如果生物样本6现在在某个操作或事故情况下在储存箱中超过了指示剂物质7的熔点，那么指示剂物质7变成液体，向下滴落，并产生在图1E中绘出的图像。如果相反地恰当地储存了样本，那么指示剂物质在储存过程后继续保留在腔室11的部分区域12a中。该状态在图1D中绘出。以此方式可以容易地识别出样本6的不允许的加热。在腔室11内的指示剂物质的位置可以通过观察被光学探测。通过由虚线100示意性绘出的水平探测还可以在冷冻管1、3的透明或半透明设计情况下以自动化光路方式确定指示剂物质7的位置。
设备10的另一个优点在于，盖11的可重复使用性和使用具有可自由选择的凝固点的用作指示剂物质7的标志液体。对于活体货架推荐大约-80℃的熔化温度，这是因为细胞中和在细胞周围的冰在这里发生明显的重结晶，这导致冷冻样本的品质降低。对于生物液体和在-80℃储存的遗传物质储存，推荐大约-30℃的熔点。
图2示出了用于冷冻保存的生物样本的温度监测的设备20的另一工作实施例。该设备20再次包含冷冻管作为样本容器，和包含可设置在冷冻管内部的呈部分填充有指示剂物质7的空心圆柱体21或21a形式的指示装置21。
在图2A中示出了冷冻管，其还可以例如深冻。该冷冻管再次包括形成接收空腔2的圆柱形接收部件1，在此该接收空腔2已经填充有生物样本6。该冷冻管还包含封闭接收部件1的冷冻管的盖3。
为了在之后探测临界极限温度的超过利用封闭的空心圆柱体21，该空心圆柱体21部分填充有指示剂物质7并可以以此方式用作监测温度的指示装置。再次如此选择指示剂物质7，使得其熔点位于-20℃至-100℃的范围，并且具有待监测的温度极限值的值。
空心圆柱体21在图1B所示位置在冷冻管外冻结。指示剂物质汇集在下部的部分容积21b并在此处冻结。
然后打开如图1A所示的冷冻管1、23，其方式是，拧开盖23，将空心圆柱体21旋转180°放到已经冻结的生物样本6上，并再次封闭冷冻管1、23，使得产生在图1C中绘出的图像。空心圆柱体21由此以如下取向松散地位于生物样本上，在该取向中指示剂物质最初在冷冻状态位于空腔22的上部。
如果随后达到了指示剂物质7的熔化温度，液体再次位于圆柱体21的底部，位于部分容积21a中，由此可以识别出超过了临界极限温度。
代替地，在图2D中绘出了四腔室空心圆柱体21a，其可以代替空心圆柱体21类似地使用，并可以以相同的方式引入冷冻管1、23中。在这种情况下，空心圆柱体21的内部空间通过分隔壁25分成4个流体隔离的部分空腔，它们各自部分填充有指示剂物质。在部分空腔中的指示剂物质7a、7b、7c、7d是不同的并且具有不同的熔点。
针对性地选择指示剂物质7a、7b、7c、7d的熔点的分级，例如指示剂物质7a为-20℃，指示剂物质7b为-50℃，指示剂物质7c为-80℃，而指示剂物质7d为-110℃。
如果现在在一次监控中发现，冻结的指示剂物质7a-7c仍然位于空心圆柱体的上部区域22b，但是指示剂物质7d位于底部(部分区域22a)，那么在样本6的情况下-110℃的温度被超过。如果发现指示剂物质7c也在底部，那么超过了-80℃，如果全部标识液体7a-7d都位于底部，那么甚至超过了-20℃。
装入接收空间2的空心圆柱体21或21a应当是表面无菌的或者以其他方式变得无细菌或无污染的。
图3示出了用于冷冻保存的生物样本的温度监测的设备30的另一个工作实施例。该设备30相对于图1示出的设备10的特点在于，整合到冷冻管的盖3中的腔室31不仅部分填充有指示剂物质7，而且还含有小的固体物体33，这些固体物体33松散地装入腔室33的内部空间或空腔32中。
这样，图3A以剖面图示出了类似于图1A的冷冻管的接收部件1。整合到立在头部的盖3的柄5中的腔室(如图3B所示)仅在底部填充有指示剂物质7。在指示剂物质中存在具有比指示剂物质相对更高密度和由此更高重量的小的物体33。物体33可以例如为金属球。现在将接收部件1和立在头部的盖3置于储存温度。由此将小的物体33冻结在指示剂液体7中。如果现在将如图1的盖按照图3C绘出的那样旋转180°拧上，那么由冻结的指示剂物质7连同固定住的小物体33组成的腔室填充物位于腔室31的空腔32的顶上。
如果在冷冻保存期间未超过指示剂物质7的熔化温度，则产生如图3D所示的图像。腔室填充物的配置没有改变，指示剂物质7和其中的冻结小物体33都位于腔室31的空腔32的顶上。
如果超过了指示剂物质7的熔化温度，重的物体33至少如图3E所绘出的那样跌落到腔室31的空腔32的底部。这种设置的优点在于，甚至可以使用熔点远低于-100℃的液体，其大多具有相当高的粘度。这样，指示剂物质7不会在壁上流到空腔32的底部，而是保留在上部。与此不同，重的物体33从变成液体的指示剂物质7如图3E所示的那样跌落到底部。这可以例如通过传感器(导电性、光学等)探测到。同样可以可视确定这种状态。
图4显示了用于冷冻保存的生物样本的温度监测的设备40的另一个工作实施例。设备40相对于图3示出的设备30的特点在于，在整合到盖3的腔室41中除了指示剂物质之外存在相对较大且较重的物体43替代多个小的物体。
在图4中再次以剖面示出了用于生物样本6的冷冻管的接收部件1。图4B再次示出了冷冻管的立在头部的盖3，在其内部再次整合有腔室41，该腔室41形成部分填充有指示剂物质7的空腔42。此外，在空腔42中松散地装有较大且较重的物体43。指示剂物质的冻结和设备40的储存类似于针对设备30的那样进行。类似于在图3中示出的设备，在超过指示剂物质7的熔化温度时大的物体43在本情况下脱落更不容易受干扰，同时该大的物体通过下降或者清出、或者阻挡光学透明路径。该光学透明路径通过虚线100在图4E中示意性示出。
图5按照流程图阐述了用于冷冻保存的生物样本的温度监测的方法。在步骤S1中，提供了用于监测温度的设备，例如，设备10、20、30或40之一。在此，根据在冷冻储存中打算监测的温度极限值，选择合适的液体或液体混合物作为指示剂物质7。
通过选择合适的液体和液体的混合比，可以将它们的熔点设定在所需值,特别是-20℃至-140℃范围。
在图6A中示例性给出了作为醇与水的混合比的函数的熔点曲线，藉此在随着温度降低、温和的粘度升高情况下可以覆盖0℃至-118℃的温度范围。如果例如要监测-118℃的温度极限值，可以将乙醇份额确定为93.5％。还可以通过将氢氧化钾(KOH)混入到水中来调节熔点直至略低于-60℃的值，这在图6B中按照熔点图示出。水和防冻剂的混合物也可用作指示剂物质，其通过图7A的熔点图说明。图7B的表列出了其他纯液体的凝固点/熔点，它们可以单独或作为与其他液体的混合物用作指示剂物质。其他适合作为指示剂物质的液体混合物是氯仿-环己烷混合物或其他可混溶的液体，这些液体可例如由图8的溶剂的混溶性矩阵获知。
尤其是要选择在低温下具有好的润湿性和低粘度的液体和塑料材料，以便设置尽可能宽范围的位置变化和小的附加隔室。
如果在冷冻储存时要监测多个温度极限值、或者要精确缩限样本达到的所实现的温度区间，可以相应使用具有不同熔点的多种不同的指示剂物质，它们随后被设置到腔室的不同部分空腔中。
在步骤S2中，然后冻结腔室中的指示剂物质，其中在指示剂物质冻结期间让腔室进入第一位置。在不同的指示剂物质和多个腔室的情况下，让它们以类似的方式各自进入第一位置并被冻结。在图1、3和4的工作实施例的情况下，第一位置各自相应于盖3如图1B、3B或4B所绘出的立在头部的位置。
此后，在步骤S3中，将具有经冻结的指示剂物质的所述至少一个腔室置于第二位置，并设置在样本容器的内部。根据在图1-4中示出的实施例，第二位置相对于第一位置旋转180°。根据在图1、3和4中示出的实施例，所述腔室通过将盖3和接收部件1拧上进入第二位置。在图2的实施方式变型中，空心圆柱体旋转180°放置到接收空间2的经冻结的生物样本6上。
在这种状态下，可以将带有冷冻样本的设备在低于熔化温度的储存温度情况下储存在样本容器的接收空间中(步骤S4)。
随后，可以在储存过程期间的任意时间点通过检查腔室填充物的状态检验：是否曾经发生不希望的、即便是仅仅暂时的冷冻样本加热(步骤S5)。为此目的，如在前文中在图1-4中已经解释过的那样检查“是否曾经发生由熔化过程引起的腔室填充物的至少部分位移和/或形状变化”。如果是这种情况，可以得出超过了要监测的一个或多个极限温度的结论。
虽然本发明已经参照特定的工作实施例进行描述，但是对于本领域技术人员显而易见地是，可以实施各种改变和可以应用等同物作为替代，而不脱离本发明的范围。因此，本发明不应受限于所公开的工作实施例，而应包括落入所附专利权利要求范围内的所有工作实施例。特别地，本发明还请求保护从属权利要求的主题和特征，而不论其引用的是哪个权利要求。

Claims (18)

1.用于冷冻保存的生物样本的温度监测的设备(10；20；30；40)，包括：
a)样本容器(1)，其具有用于接收生物样本(6)的接收空间(2)和用于封闭接收空间的盖(3)；和
b)设置在该样本容器的内部、特别是在接收空间中和/或盖中的腔室(11；21；21a；31；41)，该腔室的内部空间(12；22；32；42)不与接收空间(2)流体连接，并且仅部分填充有至少一种指示剂物质(7)，所述至少一种指示剂物质(7)的熔化温度在-20℃至-140℃的范围中。
2.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述样本容器(1)是冷冻管。
3.根据权利要求1或2所述的设备，其特征在于，所述腔室(21a)的内部空间(22a)被分成多个彼此分开的部分空间，这些部分空间各自仅部分地填充有熔化温度处于-20℃至-140℃范围内的指示剂物质(7a，7b，7c，7d)，其中在所述部分空间内的指示剂物质(7a，7b，7c，7d)具有不同的熔化温度。
4.根据前述权利要求之一所述的设备，其特征在于，
a)所述盖(3)具有与所述接收空间(2)的上部末端区域嵌接的柄(5)，和
b)将所述腔室(11；31；41)整合在柄(5)中。
5.根据权利要求1至3之一所述的设备，其特征在于，所述腔室设计为封闭的中空体(21；21a)，所述中空体布置在盖(3)下面的样本容器(1)的接收空间(2)中。
6.根据权利要求5所述的设备，其特征在于，所述封闭的中空体(21；21a)松散地布置在存在于所述接收空间中的冷冻保存的生物样本(6)上。
7.根据前述权利要求之一所述的设备，其特征在于，在所述腔室(31；41)的内部空间中松散地布置有至少一个固体物体(33；43)，其具有比指示剂物质(7)更高的密度。
8.根据权利要求7所述的设备，其特征在于，所述指示剂物质(7)的熔化温度低于-100℃。
9.根据权利要求7或8所述的设备，其特征在于，在所述腔室(41)中松散地布置有固体物体(43)，其体积大于所述指示剂物质(7)的体积。
10.根据权利要求7或8所述的设备，其特征在于，
a)在所述内部空间(32)中存在至少两个固体物体(33)；以及
b)固体物体(33)的体积各自小于指示剂物质(7)的体积。
11.根据前述权利要求之一所述的设备，其特征在于，
a)腔室壁在至少一个部位处是透明或半透明的；和/或
b)所述指示剂物质是有色的。
12.根据前述权利要求之一所述的设备，其特征在于光学、电学或光电测量装置，其设计为用于检测所述指示剂物质和/或固体物体在腔室中的位置。
13.用于冷冻保存的样本的温度监测的方法，包括以下步骤：
a)提供根据前述权利要求之一的用于监测温度的设备(10；20；30；40)；
b)冻结一种或多种指示剂物质，其中
使所述至少一个腔室在指示剂物质冻结期间进入到第一位置、以及在冻结后并且在低于指示剂物质的熔化温度的温度进入到第二位置，在该第二位置处，所述指示剂物质的熔化通过重力作用而导致腔室填充物的至少部分位移和/或形状变化。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，选择如下物质作为指示剂物质：该物质的熔化温度或阈值温度相应于预定的极限温度，在该熔化温度或阈值温度下熔化的指示剂物质的粘度低于确定的目标值，其中超过所述预定的极限温度要被监测。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其特征在于，
a)将冷冻保存的样本储存在样本容器中；以及
b)确定：是否由于暂时超过指示剂物质的熔化温度而发生了腔室填充物的至少部分位移和/或形状变化。
16.根据前述权利要求之一所述的设备或方法，其特征在于，所述指示剂物质包括选自包括下列物质的组中的至少一种醇：1-辛醇、1-壬醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、2-丁醇、1,5-戊二醇、1-戊醇、环戊醇、苯甲醇；并且任选地包含至少一种染料。
17.根据权利要求16所述的设备或方法，其特征在于，所述染料选自包括下列物质的组：三苯甲烷染料、罗丹明染料尤其是呫吨、偶氮染料以及吩嗪和吩噻嗪染料。
18.根据权利要求16或17所述的设备或方法，其特征在于，所述指示剂物质包括选自包括下列物质的组的至少两种醇组分：1-辛醇、1-壬醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、2-丁醇、1,5-戊二醇、1-戊醇、环戊醇、苯甲醇，和/或所述指示剂物质包括选自包括下列物质的组的至少一种染料：油红，甲基红，亮绿，罗丹明B，中性红，亚甲基蓝或细胞学中用于使细胞染色的其他染料。
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