CN109115924A - 大鼠脑血浆和脑组织中维格列汀衍生物的检测方法 - Google Patents

大鼠脑血浆和脑组织中维格列汀衍生物的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109115924A
CN109115924A CN201811040614.7A CN201811040614A CN109115924A CN 109115924 A CN109115924 A CN 109115924A CN 201811040614 A CN201811040614 A CN 201811040614A CN 109115924 A CN109115924 A CN 109115924A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cmd
plasma
sample
brain tissue
rat
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811040614.7A
Other languages
English (en)
Inventor
蒋心惠
杜婷婷
黄丹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing Medical University
Original Assignee
Chongqing Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing Medical University filed Critical Chongqing Medical University
Priority to CN201811040614.7A priority Critical patent/CN109115924A/zh
Publication of CN109115924A publication Critical patent/CN109115924A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/74—Optical detectors

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种大鼠血浆和脑组织中维格列汀衍生物的检测方法，包括以下步骤：步骤一、标准品的配制；步骤二、除脑组织和血浆样品中的蛋白质；步骤三、除血浆样品中的蛋白质；步骤四、HPLC‑UV测定大鼠脑组织和血浆样品中CMD‑05；步骤五、结果计算。本发明提供的大鼠脑组织和血浆中CMD‑05检测方法具有步骤简便、准确度和灵敏度好的优点，可实现样品中CMD‑05的快速检测。

Description

大鼠脑血浆和脑组织中维格列汀衍生物的检测方法
技术领域
本发明涉及医药化学检测领域，更具体地说，本发明涉及一种大大鼠体内维格列汀衍生物的检测方法。
背景技术
二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidase IV，DPP-IV)是一类跨膜丝氨酸蛋白酶，但凡N端第二位有脯氨酸或丙氨酸的多肽都可作为该酶的底物，它能从肽链N端水解2个氨基酸残基，进而使多肽失活，是体内外促进胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素分泌多肽(GIP)降解和失活的关键酶之一。
维格列汀是一种高选择性的DPP-IV底物抑制剂，通过DDP-IV形成可逆的共价键而紧密结合，缓慢解离，解离时间达到了55min，因而可以更为强效的抑制DDP-IV的活性。DPP-IV抑制剂与DPP-IV的结合存在着几个关键位点：1.酶上的疏水性S1口袋，2.酶侧链的谷氨酸205、206，3.酶侧链的丝氨酸630。目前大部分的DPP-IV抑制剂均是围绕这3方面设计。吡咯烷类具有较好的化学稳定性，吡咯烷环能与DPP-Ⅳ疏水性S1口袋的结合是对底物保持亲和力的关键。作为维格列汀(Vildagliptin)的衍生物(CMD-05)同样具有降血糖作用，其化学结构式见图1。在维格列汀的基础上，其在P2位的N上被衍生化形成酰基，极性降低，脂溶性增强，更有可能通过血脑屏障。因此本文建立了一种分离测定CMD-05的高效液相色谱法。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测大鼠脑组织和血浆中维格列汀衍生物(CMD-05)的方法。
为了实现根据本发明的这些目的，提供了一种大鼠脑组织和血浆中维格列汀衍生物(CMD-05)的检测方法，包括以下步骤：
步骤一、标准品溶液的配制；
步骤二、除脑组织浆样品中的蛋白质；
步骤三、、除血浆样品中的蛋白质
步骤四、HPLC-UV测定大鼠脑组织和血浆样品中CMD-05；
步骤五、结果计算。
优选的是，步骤一中对标准品溶液的配制具体方法为：
取CMD-05和内标卡马西平各10.0mg标准品，分别用乙腈配制成浓度为1.0mg.mL-1的储备液，放置-20℃保存备用；
优选的是，步骤二中除脑组织中的蛋白质具体方法为：
步骤a、SD大鼠断头取血并离心取上清液保存于-80℃，并在冰盒上迅速分离出脑组织保存于-80℃；
步骤b、脑组织称重并剪碎，加入内标溶液50μL(含内标2.00μg.mL-1)，脑组织加1:2倍(m/v)体积的乙腈于玻璃匀浆器中匀浆。匀浆液于12000×g,4℃条件下离心15min。取上清液50μL直接进样分析。
优选的是，步骤三中除血浆样品中蛋白质的具体方法为：
取血浆100μL，加入内标溶液50μL(含内标2.00μg.mL-1)，加入150μL乙腈,涡旋1.0min后于12000×g,4℃条件下离心15min。取上清液50μL直接进样分析。
优选的是，步骤四中HPLC-UV测定大鼠脑组织和血浆样品中CMD-05，测定条件如下：
检测器：岛津DAD二极管阵列检测器；
色谱柱：C18柱(Phecda,250mm×4.5mm,5μm)；
保护柱：安捷伦C18柱(Agilent,40mm×3.0mm,5μm)；
流动相A：乙腈
流动相B：10mmoL.L-1乙酸铵，10％冰醋酸调pH至6.0，
等度洗脱，洗脱程序为：A:B＝37:63；
柱温：30℃；
流速：1.0mL.min-1；
检测波长：204nm；
进样量：50μL。
优选的是，步骤五中结果计算具体为：
按公式(1)计算脑组织样品中CMD-05的含量；按公式(2)计算血浆样品中CMD-05的含量；
Y＝0.325X-0.0125 (1)
Y＝0.5267X-0.0796 (2)
式中：
Y：待测物与内标物质的峰面积之比；
X：待测物的浓度，单位为微克每毫升。
本发明至少包括以下有益效果：
1、本发明提供的岛津SPD-20AD紫外检测器，稳定性好，灵敏度高。
2、采用本发明的大鼠脑组织和血浆中CMD-05的测定，检测过程简单方便，可实现实际样品中CMD-05的快速检测。
本发明的其他优点、目标和特征将分别通过下面的说明体现。
附图说明
图1为本发明所述实施例中卡马西平，维格列汀和CMD-05化学结构图。
图2为本发明所述实施例中CMD-05标准品和内标卡马西平的高效液相色谱图。其中：1号峰为CMD-05、2号峰为卡马西平。
图3为本发明所述实施例中测定大鼠脑组织中CMD-05的高效液相色谱图。其中：1号峰为CMD-05、2号峰为卡马西平。
图4为本发明所述实施例中大鼠血浆中CMD-05的高效液相色谱图。其中：1号峰为CMD-05、2号峰为卡马西平。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式做进一步的描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
<实施例>
1仪器
高效液相色谱仪(岛津)
2试剂
水：超纯水(0.45μm水系微孔滤膜滤过)。
乙腈：沃凯HPLC甲醇(0.45μm有机系微孔滤膜滤过)。
乙酸铵溶液：10mmol.L-1乙酸铵配制成1L的水溶液，然后用10％冰醋酸调pH到6.0(0.45μm水系微孔滤膜滤过)。
标准品：CMD-05对照品(99％，重庆医科大学药学院药物化学教研室)、卡马西平(中国药品生物制品检定研究院)。
3检测方法
(1)标准品和样品的准备：
1a)标准品的制备：
准确称取CMD-0510.0mg，用乙腈溶解，配制成1.0mg.mL-1储备液，放置-20℃保存备用，工作液用乙腈逐级稀释成所需浓度，分装，放置于-20℃备用，临用是用乙腈稀释。
准确称取内标(卡马西平)10.0mg，用乙腈溶解，配制成1.0mg.mL-1的储备液。用乙腈逐级稀释储备液，配制成含内标2.00μg.mL-1的乙腈溶液，分装，放置于-20℃备用，临用是用乙腈稀释。
2a)样品溶液的制备：
SD大鼠断头取血并离心取上清液保存于-80℃，并在冰盒上迅速分离出脑组织保存于-80℃。脑组织称重并剪碎，加入内标溶液50μL(含内标2.00μg.L-1)，脑组织加1:2倍(m/v)体积的乙腈于玻璃匀浆器中匀浆。匀浆液于12000×g,4℃条件下离心15min。取上清液50μL供HPLC-UV测定。
取血浆100μL，加入内标溶液50μL(含内标2.00μg.mL-1)，加入150μL乙腈,涡旋1.0min后于12000×g,4℃条件下离心15min。取上清液50μL供HPLC-UV测定。
(2)高效液相色谱检测
色谱条件：检测器：岛津紫外测器SPD-20AV(LC-20AD.,Tokyo,Japan)；色谱柱：C18柱(Phecda,250mm×4.5mm，5μm)；柱温：30℃；流速：1.0mL.min-1；检测波长：204nm；进样量：50μL；流动相：乙腈与乙酸铵溶液体积比为37:63。
将标准品溶液在0.1-10μg.mL-1范围内配制6个不同浓度的标准系列，分别进样后，以待测物与内标物峰面积的比值为Y，以待测物的浓度为X进行线性回归，线性关系R2≥0.9991。
将标准品和样品溶液分别进样，根据标准品的保留时间定性样品中各组分的色谱峰；以内标法对样品中CMD-05的含量进行计算。
4结果计算
按公式(1)计算脑组织样品中CMD-05的含量；按公式(2)计算血浆样品中CMD-05的含量；
Y＝0.325X-0.0125 (1)
Y＝0.5267X-0.0796 (2)
式中：
Y：待测物与内标物质的峰面积之比；
X：待测物的浓度，单位为微克每毫升；
5专属性
实验CMD-05的测定专利条件下，在空白溶剂的色谱图中，在待测物的保留时间处，未见峰，表明此方法具有良好的专属性。
6线性和灵敏度
实验CMD-05在专利条件下的线性，线性回归得脑组织标准曲线方程为Y＝0.325X-0.0125(r2＝0.9999)，表明CMD-05脑组织质量浓度在0.09-5.00μg.mL-1范围内具有良好的线性，线性回归得血浆标准曲线方程为Y＝0.5267X-0.0796(r2＝0.9995)，表明CMD-05血浆质量浓度在0.10-10.00μg.mL-1范围内具有良好的线性。
测定一系列的对照品稀释液以确定定量限(LOQ)和检测限(LOD)，以信噪比为3作为LOD，测得其LOD为0.030μg.mL-1；以信噪比为10作为定量限，测得其LOQ为0.090μg.mL-1。
7回收率
取空白血浆100μL，加入系列CMD-05对照品溶液50μL，配制成低、中、高3种不同浓度(0.20,2.00,8.00μg.mL-1)的标准血浆样品各5份进样分析。连续测定3天，计算日内、日间精密度。
取空白脑组织匀浆100μL，加入系列CMD-05对照品溶液50μL，配制成低、中、高3种不同浓度(0.10,1.00,5.00μg.mL-1)的标准脑组织样品各5份进样分析。连续测定3天，计算日内、日间精密度。
8方法回收率
回收率通过向样品基质中加入已知量的标准品。取空白血浆100μL，加入0.2μg.mL-1,2.00μg.mL-1,8.00μg.mL-1三个浓度的标准品，每个浓度5份平行，在一天内测定，用于计算回收率和日内精密度。
取空白脑组织匀浆100μL，加入0.10μg.mL-1,1.00μg.mL-1,5.00μg.mL-1三个浓度的标准品，每个浓度5份平行，在一天内测定，用于计算回收率和日内精密度。
9精密度
精密度通过测定向样品基质中加入已知量的标准品得出。取空白血浆100μL，加入0.2μg.mL-1,2.0μg.mL-1,8.0μg.mL-1三个浓度的标准品，每个浓度3个平行，连续测定3天，用于计算日间精密度。
取空白脑组织匀浆100μL，加入0.10μg.mL-1,1.00μg.mL-1L,5.00μg.mL-1三个浓度的标准品，每个浓度3个平行，连续测定3天，用于计算日间精密度。
大鼠血浆中添加0.2μg.mL-1,2.0μg.mL-1,8.0μg.mL-1三个浓度和空白脑组织中添加的0.10μg.mL-1,1.00μg.mL-1,5.00μg.mL-1三个浓度的回收率和精密度见表1。
表1 CMD-05在脑组织和血浆中的准确度和精密度(n＝5)
Tab.1 The precision and recovery of CMD-05(n＝5，)
9稳定性
稳定性通过测定向样品基质中加入已知量的标准品得出。取空白血浆100μL，加入CMD-05对照品溶液，分别配制成低、中、高浓度(0.20,2.00,8.00μg.mL-1)的标准血浆样品各3份，每个浓度3个平行样品分别放置0h,24h,48h后进样分析，当减少量小于10％时，可认为样品稳定。大鼠血浆中添加0.2μg.mL-1，2.0μg.mL-1，8μg.mL-1三个浓度在4℃条件下的放置稳定性见表2。
取空白脑组织匀浆100μL，加入CMD-05对照品溶液，分别配制成低、中、高浓度(0.10,1.00,5.00μg.mL-1)的标准脑组织样品各3份，每个浓度3个平行样品分别放置0h,24h,48h后进样分析，当减少量小于10％时，可认为样品稳定。大鼠脑组织和血浆中添加的高、中、低3个浓度在4℃条件下的放置稳定性可见表3，脑组织和血浆中的样品经放置48h小时后，依旧稳定。这表明经处理后的样品在48h内测定完成均可。
表2 CMD-05在脑组织和血浆中的稳定性
Tab.2 The stability of CMD-05 in plasma and brain tissue(n＝5)
由以上实例可以看出，本发明实施例通过对大鼠脑组织和血浆中CMD-05进行了检测，方法有较高的灵敏度、准确度和精密度。

Claims (6)

1.一种大鼠血浆和脑组织中维格列汀衍生物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、标准品溶液的配制；
步骤二、除脑组织样品中的蛋白质；
步骤三、、除血浆样品中的蛋白质
步骤四、HPLC-UV测定大鼠脑组织和血浆样品中CMD-05；
步骤五、结果计算。
2.如权利要求1所述的大鼠脑组织和血浆中CMD-05的检测方法，其特征在于，步骤一中对标准品溶液的配制具体方法为：
取CMD-05标准品和内标卡马西平各10.0mg标准品，分别用乙腈配制成浓度为1.0mg.mL-1的储备液，放置-20℃保存备用。
3.如权利要求1所述的大鼠脑组织和血浆中CMD-05的检测方法，其特征在于，步骤二中对脑组织样品的除蛋白的具体方法为：
步骤a、SD大鼠断头取血并离心取上清液保存于-80℃，并在冰盒上迅速分离出脑组织保存于-80℃；
步骤b、脑组织称重并剪碎，加入内标溶液50μL(含内标2.00μg.mL-1)，脑组织加1:2倍(m/v)体积的乙腈于玻璃匀浆器中匀浆。匀浆液于12000×g，4℃条件下离心15min。取上清液50μL直接进样分析。
4.如权利要求1所述的大鼠血浆中高半胱氨酸和半胱氨酸的检测方法，其特征在于，步骤三中除血浆样品中蛋白质的具体方法为：
取血浆100μL，加入内标溶液50μL(含内标2.00μg.mL-1)，加入150μL乙腈,涡旋1.0min后于12000×g,4℃条件下离心15min。取上清液50μL直接进样分析。
5.如权利要求1所述的大鼠脑组织和血浆中CMD-05的检测方法，其特征在于，步骤四中HPLC-UV测定大鼠脑组织和血浆样品中CMD-05，测定条件如下：
检测器：岛津DAD二极管阵列检测器；
色谱柱：C18柱(Phecda,250mm×4.5mm,5μm)；
保护柱：安捷伦C18柱(Agilent,40mm×3.0mm,5μm)；
流动相A：乙腈
流动相B：10mmoL.L-1乙酸铵，10％冰醋酸调pH至6.0，
等度洗脱，洗脱程序为：A:B＝37:63；
柱温：30℃；
流速：1.0mL.min-1；
检测波长：204nm；
进样量：50μL。
6.如权利要求1所述的大鼠脑组织和血浆中CMD-05的检测方法，其特征在于，步骤五中结果计算具体为：
按公式(1)计算脑组织样品中CMD-05的含量；按公式(2)计算血浆样品中CMD-05的含量；
Y＝0.325X-0.0125 (1)
Y＝0.5267X-0.0796 (2)
式中：
Y：待测物与内标物质的峰面积之比；
X：待测物的浓度，单位为微克每毫升。
CN201811040614.7A 2018-09-07 2018-09-07 大鼠脑血浆和脑组织中维格列汀衍生物的检测方法 Pending CN109115924A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811040614.7A CN109115924A (zh) 2018-09-07 2018-09-07 大鼠脑血浆和脑组织中维格列汀衍生物的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811040614.7A CN109115924A (zh) 2018-09-07 2018-09-07 大鼠脑血浆和脑组织中维格列汀衍生物的检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109115924A true CN109115924A (zh) 2019-01-01

Family

ID=64858827

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811040614.7A Pending CN109115924A (zh) 2018-09-07 2018-09-07 大鼠脑血浆和脑组织中维格列汀衍生物的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109115924A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111796035A (zh) * 2020-06-24 2020-10-20 中南大学湘雅医院 一种定量分析人血浆维格列汀浓度的lc-ms/ms检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014164404A1 (en) * 2013-03-13 2014-10-09 The General Hospital Corporation 2-aaa as a biomarker and therapeutic agent for diabetes
CN104316606A (zh) * 2014-09-24 2015-01-28 万特制药(海南)有限公司 一种用液相色谱法分离测定维格列汀有关物质的方法
CN106432026A (zh) * 2016-09-12 2017-02-22 重庆医科大学 一类对糖尿病具有潜在治疗活性的化合物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014164404A1 (en) * 2013-03-13 2014-10-09 The General Hospital Corporation 2-aaa as a biomarker and therapeutic agent for diabetes
CN104316606A (zh) * 2014-09-24 2015-01-28 万特制药(海南)有限公司 一种用液相色谱法分离测定维格列汀有关物质的方法
CN106432026A (zh) * 2016-09-12 2017-02-22 重庆医科大学 一类对糖尿病具有潜在治疗活性的化合物

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BURUGULA, L 等: "Simultaneous determination of sitagliptin and simvastatin in human plasma by LC-MS/MS and its application to a human pharmacokinetic study", 《BIOMEDICAL CHROMATOGRAPHY》 *
JIE MA 等: "CMD-05, a novel promising clinical anti-diabetic drug candidate, in vivo and vitro studies", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
MAHESH ATTIMARAD 等: "Development of a rapid reversed phase-high performance liquid chromatography method for simultaneous determination of metformin and vildagliptin in formulation and human plasma", 《JOURNAL OF YOUNG PHARMACISTS》 *
SHANTIKUMAR, S 等: "A sensitive and selective liquid chromatography mass spectrometry method for simultaneous estimation of anti-diabetic drugs inhibiting DPP-4 enzyme in human plasma: overcoming challenges associated with low recovery and sensitivity", 《ANALYTICAL METHODS》 *
龙友琦 等: "维格列汀衍生物的药代动力学和组织分布研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111796035A (zh) * 2020-06-24 2020-10-20 中南大学湘雅医院 一种定量分析人血浆维格列汀浓度的lc-ms/ms检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lu et al. Detection of ractopamine residues in pork by surface plasmon resonance-based biosensor inhibition immunoassay
Wang et al. Simultaneous detection and quantitation of highly water-soluble herbicides in serum using ion-pair liquid chromatography–tandem mass spectrometry
WO2005116629A1 (ja) アミノ官能性化合物の分析方法及び装置
CN103163226A (zh) 30种氨基酸同时定量检测方法及试剂盒制备
CN102539564B (zh) 奥硝唑注射液杂质的检测方法及含量测定方法
Ng et al. HPLC separation of tetracycline analogues: comparison study of laser-based polarimetric detection with UV detection
Yeniceli et al. A simple and sensitive LC–ESI-MS (ion trap) method for the determination of bupropion and its major metabolite, hydroxybupropion in rat plasma and brain microdialysates
Koželj et al. Simple validated LC–MS/MS method for the determination of atropine and scopolamine in plasma for clinical and forensic toxicological purposes
CN102788852A (zh) 一种液相色谱-串联质谱法检测人体尿液中七种芳香胺化合物的方法
CN104749288A (zh) 一种帕瑞昔布钠有关物质的液相色谱分析方法
Zhang et al. On-line solid phase extraction using organic–inorganic hybrid monolithic columns for the determination of trace β-lactam antibiotics in milk and water samples
CN105717237A (zh) 一种血清中GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类毒品的检测方法
Horňák et al. High-throughput determination of dissolved free amino acids in unconcentrated freshwater by ion-pairing liquid chromatography and mass spectrometry
Kabashima et al. A selective fluorescence reaction for peptides and chromatographic analysis
CN103134892A (zh) 复方氨基酸(15)双肽(2)注射液的分析方法
CN109115924A (zh) 大鼠脑血浆和脑组织中维格列汀衍生物的检测方法
CN113671077A (zh) 丙烯酰氯及其有关物质检测方法
EP4046982A1 (en) Method for quantifying amino group-containing compound protected by protecting group having fmoc skeleton
Zhang et al. Simultaneous determination of the active ingredients in composite pseudoephedrine hydrochloride tablets by capillary electrophoresis
Aydoǧmuş Simultaneous determination of aliskiren, amlodipine and hydrochlorothiazide in spiked human plasma and urine by high performance liquid chromatography
CN112946099A (zh) 一种氨基酸葡萄糖注射液中有关物质的检测方法
Fanciulli et al. Quantification of Gluten Exorphin A5 in cerebrospinal fluid by liquid chromatography–mass spectrometry
Kadam et al. Application of mixed hydrotropic solubilization technique for simultaneous spectrophotometric estimation of metronidazole and miconazole nitrate from different pharmaceutical dosage forms
Taleuzzaman et al. Particle size role, Importance and Strategy of HPLC Analysis-An update
AbuHeshmeh et al. A new method for determination of human insulin in aqueous injections

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190101

RJ01 Rejection of invention patent application after publication