CN109111981A - 一种生物复合酶法制备高纯度花生油脂体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于油料精深加工技术领域，具体涉及一种生物复合酶法制备高纯度花生油脂体的方法。该复合酶用于花生油脂体的提取，为蜗牛酶、木聚糖酶、果胶酶、纤维素酶中不少于两种的组合物。制备高纯度花生油脂体时，包括花生预处理、生物复合酶法酶解、提纯制备等步骤。本发明所提供的生物复合酶法制备高纯度花生油脂体的方法，对复合酶进行了进一步筛选，并对相关加工工艺做了优化。初步应用效果表明，该方法具有提取效率高、纯度高、工艺条件温和、操作简单、生产周期短等优点，可为花生油脂体在工业上的应用奠定生产基础，对于拓宽花生的工业化应用范围具有较好的促进作用。
Description
技术领域
本发明属于油料精深加工技术领域，具体涉及一种生物复合酶法制备高纯度花生油脂体的方法。
背景技术
油脂体是由磷脂单分子层、嵌插在磷脂层中的膜蛋白和被磷脂层包裹的中性脂组成的简单细胞器，是油料作物内储存脂肪的重要亚细胞结构，具有乳化性及稳定性好的特点，在食品、医药、化妆品及饲料等领域具有广阔的开发前景。花生中油脂体含量高且含有丰富的不饱和脂肪酸和维生素E，营养价值高且应用前景广。
由于油脂体特殊的结构和性质，近年来被研究者广泛关注，但这些研究大多以水剂法获得油脂体，如Jason T.C.（A new method for seed oil body purification andexamination of oil body integrity following germination，Biochemistry, 1997,121:762-768）提出多步清洗分级纯化制备油脂体的方法即去污剂清洗、盐洗、脲洗以及正己烷漂洗四个清洗步骤；Showa Sangyo CO LTD（Method for production oil body andfat and oil，Japan: JP2004043584-A，20041202）以及Virginie N（Enzyme-AssistedAqueous Extraction of Oleosomes from Soybeans (Glycine max)，Food chemistry,2008, 56:1766-177）提出的整个过程只用水来清洗离心提取油料中油脂体的方法；康波（花生油体乳液稳定性及乳液凝胶的研究，硕士学位论文，华南理工2010年）将花生加入到NaCl和蔗糖的Tris-HCl溶液中搅拌过胶体磨、离心，上浮物加入Tween20去污剂的方法制备油脂体。总体而言，水剂法技术虽然具有无溶剂污染和相对安全性高的优点，但该法生产油脂体存在提取效率较低、纯度不高的缺点，有待采取适当的方法对其进行改进。
随着生物技术的发展，酶制剂在食品工业中的应用也越来越广泛，利用酶制剂辅助提取油脂体是一种具有较高研究价值的方法。如Virginie N（Enzyme-Assisted AqueousExtraction of Oleosomes from Soybeans (Glycine max), Food chemistry, 2008,56:1766-177）应用果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶等复合制备大豆油脂体；赵自通（复合植物水解酶提取花生油脂体工艺研究, 食品科学技术学报, 2017, 35(3):31-35）采用商业复合植物水解酶Viscozyme L.辅助提取花生油脂体，提取率为48.92%。但是对这些酶辅助提取方法进行研究后发现，现有多数酶法提取油脂体的方法虽然反应条件温和，但是油脂体产品纯度较低，油脂回收率低，而且针对不同油脂体其所适用的生物酶类型、生物酶用量也差别较大，也无较为统一的规律可以借鉴和遵循。而针对花生的精深加工而言，设计、开发一种提取率高且提取周期短、色泽良好且高纯度的油脂体提取工艺具有十分重要的应用意义和现实价值。
发明内容
本发明目的在于提供一种生物复合酶法制备高纯度花生油脂体的方法，该方法具有较高的花生油脂体提取率、较短油脂体生产周期，而且可制备出高纯度的花生油脂体，对于花生的精深加工具有较大的应用意义。
本发明所采取的技术方案详述如下。
一种制备高纯度花生油脂体用生物复合酶，该复合酶为蜗牛酶、木聚糖酶、果胶酶、纤维素酶中不少于两种的组合物；
各生物酶的酶活具体为：
蜗牛酶=0.8×104~1.7×104 U/g，果胶酶=1.5×104~2.5×104 U/g，
果胶酶=2.5×104~3.5×104 U/g，木聚糖酶=2.5×104~3.5×104 U/g；
以酶活比计，不同生物酶具体组合例如为：
蜗牛酶:纤维素酶=1:1，
蜗牛酶:果胶酶=1:1，
蜗牛酶:木聚糖酶=（30~70）:（10~40），具体为1:1或者7:3；
纤维素酶:果胶酶=1:1，
纤维素酶:木聚糖酶=1:1，
果胶酶:木聚糖酶=1:1，
蜗牛酶:纤维素酶:果胶酶=1:1:1，
蜗牛酶:纤维素酶:木聚糖酶=1:1:1，
纤维素酶:果胶酶:木聚糖酶=（50~70）:（15~30）:（10~20），具体为1:1:1或者6:3:1，
应用时，以质量比例计，复合酶用量（此处酶用量为复合酶的总用量）相当于花生用量的0.4~4.0%。
利用所述生物复合酶法制备高纯度花生油脂体的方法，包括如下步骤：
（一）花生预处理
将花生脱壳并进行去红衣预处理，然后将去红衣后的花生仁在粉碎机中进行粉碎；
所用花生原料可以为高油酸花生，也可以为非高油酸花生；
花生去红衣时可采用冷水浸泡方法或热烫冷漂法，具体而言：
采用冷水浸泡方法时，常温（22~27 ℃）浸泡时间为0.5~12 h；
采用热烫冷漂法时，60~100 ℃热烫3~6 s，随即冷漂（常温22~27 ℃）3~10 s；
具体粉碎操作时，粉碎时间为0.5~2 min，粉碎成平均粒径为0.02~2 mm的花生粉；
（二）生物复合酶法酶解
将步骤（一）中粉碎后花生与水混合后，在混合液中加入复合酶至浓度为300~800 U/g，搅拌均匀进行均质化处理；
以质量比计，粉碎后花生粉:水=1:3~6；
所述复合酶为蜗牛酶与木聚糖酶混合物，以酶活比计，蜗牛酶:木聚糖酶=（30~70）:（10~40）；
所述复合酶或者为纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶的混合物，以酶活比计，纤维素酶:果胶酶:木聚糖酶（50~70）:（15~30）:（10~20），
所述均质化处理，均质速度为6000~20000 r/min，均质时间为5~20 min；
将均质化处理后混合液30~60 ℃进行酶解0.5~4.0 h，对酶解后酶解液离心，分离得到粗油脂体、水解液和残渣；
所述离心，具体参数为：3000~5000 r/min离心5~30 min；
优选操作中，可对残渣进一步加水混合（以质量比计，残渣:水=1:3~10）后进行均质化处理，并进一步离心分离得到粗油脂体、水解液和残渣，可将此步骤分离所得粗油脂体与前述分离所得粗油脂体合并。
（三）提纯制备高纯度花生油脂体
在步骤（二）所得粗油脂体中加入PBS-蔗糖缓冲液（以质量比计，粗油脂体:PBS-蔗糖缓冲液=1:3~7），搅拌混合均匀后，5000~12000 r/min离心10~30 min，收集离心上层得到油脂体、洗涤液和残渣；
所述PBS-蔗糖溶液中，PBS浓度为0.01~0.05 mol/L，蔗糖质量浓度5~25%，pH=6.8~7.2；
优选操作中，对上述离心所得油脂体重复此步骤操作，最后所得即为高纯度花生油脂体。
本发明所提供的生物复合酶法制备高纯度花生油脂体的方法，对复合酶进行了进一步筛选，并对相关加工工艺做了优化。初步应用效果表明，该方法具有提取效率高、纯度高、工艺条件温和、操作简单、生产周期短等优点，可为花生油脂体在工业上的应用奠定生产基础，对于拓宽花生的工业化应用范围具有较好的促进作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分背景情况简要介绍说明如下。
生物酶：
下述实施例中所采用生物酶的部分基本情况简介如下：
蜗牛酶，是一种从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶制剂，含有纤维素酶、蛋白水解酶和果胶酶等多种酶，多应用于生物、食品、饲料等领域；其有效作用温度范围为35~65 ℃，pH 4.5~6.5；易受氧化剂抑制和还原性物质激活；下述实施例中所用蜗牛酶酶活为1.5×104 U/g左右，为上海源叶生物科技有限公司产品；
纤维素酶，是一种由木霉菌深层发酵培养，后经微滤、超滤及真空冷冻干燥技术精制提取而成的一种酶，主要用于降解纤维素生成葡萄糖以及在食品加工中破坏植物细胞壁；易溶于水，水溶液为澄清的浅棕色液体，其有效作用温度范围为45~55 ℃，pH 4.5~6.5；易受氧化剂抑制和还原性物质激活；下述实施例中所用纤维素酶酶活为2.0×104 U/g左右，为庞博生物工程有限公司产品；
果胶酶，是一种特定用于果胶质降解的生物酶，主要应用于食品加工中果胶质的分解，以促进果汁澄清或细胞壁分解，其有效作用温度范围为40~55 ℃，pH 3.8~6.0；易受氧化剂抑制和还原性物质激活；下述实施例中所用果胶酶酶活为3.0×104 U/g左右，为庞博生物工程有限公司产品；
木聚糖酶，是一种由青霉深层发酵培养，后经微滤、超滤及真空冷冻干燥技术精制提取而成的一种酶，主要用于降解植物细胞壁中的木聚糖生成木寡糖及葡萄糖，多应用在食品、酿造、饲料工业中；其有效作用温度范围为40~60 ℃，pH 3.5~6.5；易受氧化剂抑制和还原性物质激活，下述实施例中所用木聚糖酶酶活为3.0×104 U/g左右；为庞博生物工程有限公司产品。
实施例1
为考察不同种类生物酶对花生油脂体提取率及纯度的影响情况，本实施例以同等质量脱壳花生仁（高油酸花生）作为样品，进行了具体提取实验，具体情况简介如下。
（一）花生预处理
对花生仁去红衣处理时，采用热烫冷漂法，具体而言：先100℃热烫5s，再25℃冷漂10s；
将脱红衣后的花生放入粉碎机中粉碎1.5 min，粉碎后花生粉平均粒径为0.27 mm左右。
（二）生物复合酶法酶解
将步骤（一）中粉碎后花生与水混合后，以质量比计，粉碎后花生:水=1:5；在混合液中加入复合酶至浓度为400 U/g，搅拌均匀后，10000 r/min均质化处理4 min；
将混合液50℃进行酶解2 h（酶解时，溶液pH=5.5），对酶解后酶解液5000 r/min离心10min，分离得到粗油脂体、水解液和残渣；
进一步地，将残渣加水混合（以质量比计，残渣:水=1:4）后，10000 r/min均质化处理4min，进一步5000 r/min离心10 min分离得到粗油脂体、水解液和残渣，将此步骤分离所得粗油脂体与前述分离所得粗油脂体合并。
（三）提纯制备高纯度花生油脂体
在步骤（二）所得粗油脂体中加入PBS-蔗糖缓冲液（以质量比计，粗油脂体:PBS-蔗糖缓冲液=1:5），搅拌10 min混合均匀后，5000 r/min离心10 min，收集离心上层得到油脂体、洗涤液和残渣；
所述PBS-蔗糖溶液中，PBS浓度为0.015 mol/L，蔗糖质量浓度为25%；
对所得油脂体重复此步骤操作一次，即为高纯度花生油脂体。
对不同种类酶对花生油脂体纯度和提取率的影响进行统计分析。
具体生物酶组合情况及粗油脂体提取情况如下表1所示。
表1，不同酶组合及对花生油脂体纯度和提取率的影响结果
。
对上表结果进行分析可以看出，不同生物酶组合应用情况下，对于花生油脂体提取影响有所不同，就生物酶选择而言，组合酶的应用显然优于单一酶，但不同类型组合时对于提取率及纯度影响又是有所不同的。总体而言，综合考虑提取率和纯度效果时，应至少选择不少于两种生物酶的组合应用。
实施例2
以300 g高油酸花生（油酸含量＞75%）为例，就本申请所提供的生物复合酶法制备高纯度花生油脂体的制备过程介绍如下。
（一）花生预处理
将花生脱壳（去壳后花生仁质量为195 g）并进行去红衣预处理，然后将去红衣后的花生在粉碎机中进行粉碎；
花生去红衣时采用热烫冷漂法，具体而言：先90℃热烫4 s，再25℃冷漂10 s以便于去除红衣；
将脱红衣后的花生放入粉碎机中粉碎1.5 min，粉碎后花生粉平均粒径为0.27 mm左右。
（二）生物复合酶法酶解
将步骤（一）中粉碎后花生与水混合后，在混合液中加入复合酶至浓度为400 U/g，搅拌均匀后，8000 r/min均质化处理5 min；
以质量比计，粉碎后花生:水=1:3；
所述复合酶为蜗牛酶与木聚糖酶混合物，以酶活比计，蜗牛酶:木聚糖酶=70:30；
将均质化处理后混合液45℃进行酶解1.5 h，对酶解后酶解液5000 r/min离心10 min，分离得到粗油脂体、水解液和残渣（残渣质量89.7 g）；
进一步地，将残渣加水混合（以质量比计，残渣:水=1:3）后，8000 r/min均质化处理5min，进一步5000 r/min离心10 min分离得到粗油脂体、水解液和残渣，将此步骤分离所得粗油脂体与前述分离所得粗油脂体合并。
（三）提纯制备高纯度花生油脂体
在步骤（二）所得粗油脂体中加入PBS-蔗糖缓冲液（以质量比计，粗油脂体:PBS-蔗糖缓冲液=1:5），搅拌30 min混合均匀后，5000 r/min离心10 min，收集离心上层得到油脂体、洗涤液和残渣；
所述PBS-蔗糖溶液中，PBS浓度为0.02 mol/L，蔗糖质量浓度为20%；
对所得油脂体重复此步骤操作一次，即为高纯度花生油脂体。
检测结果表明，最终花生油脂体提取率46%，纯度89%，脂肪回收率86%，蛋白质含量2.1%，油脂体亮白、纯净。
作为对照，同上述花生原料及制备方法，发明人采用另一种复合酶进行了花生油脂体制备，
另一种复合酶为纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶混合物，以酶活比计，纤维素酶:果胶酶:木聚糖酶=50:30:20；酶解过程中，在花生碎粒与水混合液中，复合酶终浓度为300 U/g。检测结果表明：最终花生油脂体提取率44%，纯度81%，脂肪含量79%，蛋白质含量5.7%，油脂体亮白、纯净。
这一结果也表明，不同复合酶所制备花生油脂体特性是存在一定区别的。
实施例 3
本实施例以300 g非高油酸花生为例（脱壳后花生仁质量210 g左右），总体的生物复合酶法制备高纯度花生油脂体的制备过程同实施例1，但就部分工艺参数调整如下。
步骤（一）中：采用冷水（25℃）浸泡12 h方式去除红衣；
步骤（二）中，复合酶终浓度为400 U/g，粉碎后花生:水=1:5，粉碎后花生与水混合均匀、并加入复合酶后，6000 r/min均质化处理5 min；
所述复合酶中，酶活计，蜗牛酶:木聚糖酶=55U:35U；
均质化后45℃酶解1.5 h；
步骤（三）中，PBS-蔗糖缓冲液加入量，以质量比计，粗油脂体:PBS-蔗糖缓冲液=1:5；
所述PBS-蔗糖溶液中，PBS浓度为0.04 mol/L，蔗糖质量浓度为18%。
检测结果表明，最终花生油脂体提取率48.6%，纯度93%，脂肪回收率89%，蛋白质含量1.7%，油脂体亮白、纯净。
作为对照，同此实施例花生原料及制备方法，发明人采用另一种复合酶进行了花生油脂体制备，
另一种复合酶为纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶混合物，以酶活比计，纤维素酶:果胶酶:木聚糖酶=60:25:15；酶解过程中，在花生碎粒与水混合液中，复合酶终浓度为300 U/g。检测结果表明：最终花生油脂体提取率47.1%，纯度90%，脂肪含量75%，蛋白质含量0.8%，油脂体亮白、纯净。
Claims (10)
1.一种制备高纯度花生油脂体用生物复合酶，其特征在于，该复合酶用于花生油脂体的提取，为蜗牛酶、木聚糖酶、果胶酶、纤维素酶中不少于两种的组合物；
各生物酶的酶活具体为：
蜗牛酶=0.8×104~1.7×104 U/g，果胶酶=1.5×104~2.5×104 U/g，
果胶酶=2.5×104~3.5×104 U/g，木聚糖酶=2.5×104~3.5×104 U/g。
2.如权利要求1所述制备高纯度花生油脂体用生物复合酶，其特征在于，以酶活比计，生物酶具体组合为：
蜗牛酶:纤维素酶=1:1，
蜗牛酶:果胶酶=1:1，
蜗牛酶:木聚糖酶=（30~70）:（10~40）；
纤维素酶:果胶酶=1:1，
纤维素酶:木聚糖酶=1:1，
果胶酶:木聚糖酶=1:1，
蜗牛酶:纤维素酶:果胶酶=1:1:1，
蜗牛酶:纤维素酶:木聚糖酶=1:1:1，
纤维素酶:果胶酶:木聚糖酶=（50~70）:（15~30）:（10~20）。
3.如权利要求2所述制备高纯度花生油脂体用生物复合酶，其特征在于，以酶活比计，蜗牛酶:木聚糖酶=1:1或者7:3。
4.如权利要求2所述制备高纯度花生油脂体用生物复合酶，其特征在于，以酶活比计，纤维素酶:果胶酶:木聚糖酶=1:1:1或者6:3:1。
5.权利要求1~4任一项所述生物复合酶在高纯度花生油脂体制备中的应用，其特征在于，以质量比例计，复合酶用量相当于花生用量的0.4~4.0%。
6.利用权利要求1~4任一项所述生物复合酶的高纯度花生油脂体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（一）花生预处理
将花生脱壳，对所得花生仁进行去红衣预处理，然后将去红衣后的花生仁进行粉碎；
（二）生物复合酶法酶解
将步骤（一）中粉碎后花生与水混合后，在混合液中加入复合酶至浓度为300~800 U/g，搅拌均匀进行均质化处理；
以质量比计，粉碎后花生粉:水=1:3~6；
将均质化处理后混合液30~60℃酶解0.5~4.0 h，对酶解后酶解液离心，分离得到粗油脂体、水解液和残渣；
（三）提纯制备高纯度花生油脂体
在步骤（二）所得粗油脂体中加入PBS-蔗糖缓冲液，以质量比计，粗油脂体:PBS-蔗糖缓冲液=1:3~7，搅拌混合均匀后，离心，收集离心上层得到油脂体、洗涤液和残渣，所得油脂体即为高纯度花生油脂体。
7.如权利要求6所述高纯度花生油脂体的制备方法，其特征在于，步骤（一）中，花生去红衣时采用冷水浸泡法或热烫冷漂法，具体而言：
采用冷水浸泡法时，22~27℃浸泡0.5~12 h；
采用热烫冷漂法时，60~100℃热烫3~6 s后，随即22~27℃冷漂3~10 s。
8.如权利要求6所述高纯度花生油脂体的制备方法，其特征在于，步骤（一）中，将花生仁粉碎成平均粒径为0.02~2 mm的花生粉。
9.如权利要求6所述高纯度花生油脂体的制备方法，其特征在于，步骤（二）中，对酶解后酶解液离心时，具体参数为：3000~5000 r/min离心5~30 min。
10.如权利要求6所述高纯度花生油脂体的制备方法，其特征在于，步骤（三）中，所述PBS-蔗糖溶液，PBS浓度为 0.01~0.05 mol/L，蔗糖质量浓度5~25%，pH=6.8~7.2。
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