CN109097423A - 应用交替糖蔗糖酶催化合成单、二葡萄糖基莱鲍迪苷a - Google Patents
应用交替糖蔗糖酶催化合成单、二葡萄糖基莱鲍迪苷a Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了应用交替糖蔗糖酶催化合成单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A,属于甜味剂的生物合成技术领域。本发明以蔗糖为糖基供体,莱鲍迪苷A为受体,用交替糖蔗糖酶催化莱鲍迪苷A的葡萄糖基化,合成单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A。莱鲍迪苷A的转化率可超过90%,产品中单葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比大于37%,单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比之和大于50%。
Description
技术领域
本发明涉及应用交替糖蔗糖酶催化合成单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A,属于甜味剂的生物合成技术领域。
背景技术
单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A具有良好的口感和溶解性,广泛作为甜味剂和风味调节剂用于食品中。目前,葡萄糖基莱鲍迪苷A的制备多以淀粉等多糖为糖基供体,以环糊精葡萄糖基转移酶催化莱鲍迪苷A的转苷反应,得到的葡萄糖基甜菊糖苷的组成相对复杂。在环糊精葡萄糖基转移酶催化的转苷反应中,单糖和二糖不能作为糖基供体,而且莱鲍迪苷A由于分子比甜菊苷的大,空间位阻大,反应性也略差。换言之,由于多糖类糖基供体的结构复杂性,以及环糊精葡萄糖基转移酶催化转苷反应时对底物的特异性,以环糊精葡萄糖基转移酶催化合成低取代葡萄糖基莱鲍迪苷A相对较为困难。
Ishikawa等利用β-味喃果糖苷酶(FFase),在甜菊苷C-19位所连的葡萄糖基上通过β-2,6糖苷键引入一分子呋喃果糖,得到高纯度的甜菊苷-呋喃果糖产物(Ishikawa,1991);但是FFase在反应过程中又会水解产物,使产率减小到不利于工业化生产。Kusakabe等从土壤中筛选得到一种存在于放线菌菌株K-128细胞表面的β-葡萄糖转移酶(Kusakabe,1992),该酶只特异性地催化凝胶多糖和甜菊苷反应,得到在甜菊苷C13槐糖基上以β-1,6-糖苷键连接一分子葡萄糖的产物,虽然改性后的产品口感得到改善,但是反应时间长,反应148h后产物的产率只有20%。
尽管许多酶都有转苷的能力,但只有少部分能催化甜菊糖苷的转苷反应。例如日本天野酶制品株式会社出售的来源于黑曲霉的转苷酶L-500(500TGU/g,商品名Transglucosidase L)就不能用于甜菊苷的转苷(Wan,2012)。Thermus thermophilus DSM579所产的α-葡萄糖苷酶,对甜菊苷的转苷能力也非常低,反应24h甜菊苷的转化率小于1%(Ye,2013)。
实际上,目前用于甜菊糖苷改性的糖酶,就研发人员的初衷而言,糖酶的目标底物和产物大都与甜菊糖苷改性无关----比如环糊精葡萄糖基转移酶。
交替糖蔗糖酶(alternansucrase,EC2.4.1.140),通常被用来合成交替糖寡糖,交替糖寡糖的主链是葡萄糖单元通过α-1,3-吡喃葡萄糖苷键和α-1,6-吡喃葡萄糖苷键交替连接而成。例如以蔗糖为底物合成含有α-1,3糖苷键和α-1,6糖苷键的交替糖;或以麦芽糖、异麦芽糖、龙胆二糖等寡糖为受体,蔗糖为供体,通过葡糖基转移作用生成低聚糖。且这些低聚糖具有较好的益生作用,能够有效的改善人体的肠道健康。
交替糖寡糖聚合的程度可随蔗糖与受体麦芽糖的浓度和相对比率而变化,当然也随酶的性质而改变。反应产物交替糖寡糖通常由具有不同聚合度的寡糖的混合物组成。在相对高的蔗糖和麦芽糖比率时,更多的糖基单元被转移至葡聚糖中,并获得具有更高聚合度的产物。与此相反,在低的蔗糖和麦芽糖比率时,主要的反应产物是单个糖基单元转移至受体而产生的产物。例如,申请号为CN201810148068.2的专利申请中,用来源于柠檬明串珠菌的交替糖蔗糖酶,以马铃薯淀粉和蔗糖为原料,调节马铃薯淀粉和蔗糖的比例,添加高温酸性α淀粉酶、β粉淀粉酶、普鲁兰酶、麦芽糖淀粉酶和交替糖蔗糖酶先后催化反应72h时,最终底物转苷效率达88.9%,合成得到二糖、三糖、四糖、五糖、六糖和七糖。但是,来源于柠檬明串珠菌的交替糖蔗糖酶催化合成葡萄糖基莱鲍迪苷A的酶活很低。
发明内容
本发明以蔗糖为糖基供体,莱鲍迪苷A为受体,用来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis WB600,CGMCC NO.5757)的交替糖蔗糖酶催化莱鲍迪苷A的转苷反应,合成单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A;莱鲍迪苷A的转化率可超过90%,产品中单葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比大于37%,单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比之和大于50%。
本发明提供了用交替糖蔗糖酶催化合成单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的方法,是将莱鲍迪苷A(RA)与蔗糖配制成反应液,加入交替糖蔗糖酶,于20-45℃恒温搅拌反应。
在本发明一种实施方式中,反应过程中用高效液相色谱仪分析反应体系组成,待单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比之和大于50%或莱鲍迪苷A的转化率高于86%后,停止反应。所述反应体系包括底物、产物、催化剂、溶剂。
在本发明一种实施方式中,当反应进行到莱鲍迪苷A的转化率不再升高时,停止反应。
在本发明一种实施方式中,反应进行3-24h。
在本发明的一种实施方式中,配制反应液时,所用的溶剂为水。
在本发明的一种实施方式中,配制的反应液中RA的质量浓度为40-100g/L,RA与蔗糖质量比为1:(0.2-4)。
在本发明的一种实施方式中,配制的反应液中RA的质量浓度为80-100g/L。
在本发明的一种实施方式中,配制的反应液中RA与蔗糖质量比为1:(2-4)。
在本发明的一种实施方式中,所述交替糖蔗糖酶来源于枯草杆菌(Bacillussubtilis)WB600。
在本发明的一种实施方式中,交替糖蔗糖酶的加酶量为1-60U/g RA。
在本发明的一种实施方式中,交替糖蔗糖酶的加酶量为10-60U/g RA。
在本发明的一种实施方式中,反应温度为25-38℃。
在本发明的一种实施方式中,反应过程中可以补加底物和/或酶。所述酶可以以酶液的形式或者酶粉的形式添加。
所述的来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WB600)的交替糖蔗糖酶参照以下方法制备得到:将枯草芽孢杆菌接种于组成为:蛋白胨8-12g/L,酵母粉4-6g/L,氯化钠8-12g/L的培养基中,在35-38℃,180-220rpm下培养8-10h;然后以5%-10%接种量转接至组成为:酵母浸膏20-25g/L,大豆蛋白胨5-10g/L,甘油4-6g/L且初始pH6-7的培养基中,在40-41℃,180-220rpm下培养45-50h。发酵培养结束后,8000rpm离心10min,收集上清液即为交替糖蔗糖酶粗酶液。
本发明有益效果:
本发明直接以蔗糖为糖基供体来酶催化合成单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A,RA的转化率可超过90%,产品中单葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比大于37%,单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比之和大于50%。
附图说明
图1以蔗糖为糖基供体,交替糖蔗糖酶催化RA或St转苷,各组分的HPLC面积百分比;图中,实线:×RA■RAG1●RAG2;虚线:×St■StG1●StG2;RA(或St):蔗糖(w/w)=1:1,10mg蔗糖/mL,40℃,20U/g蔗糖。
图2不同底物质量比下,交替糖蔗糖酶催化RA转苷反应24h各组分的HPLC面积百分比;×RA,■RA-glu1,◆RA-glu2。
图3补加蔗糖的情况下,交替糖蔗糖酶催化RA转苷反应,各组分的HPLC面积百分比;×RA,■RAG1,●RAG2;最终RA:蔗糖(w/w)=1:2,32℃,20U/g RA;起始RA:蔗糖=1:0.2,每小时补加蔗糖(mg/mL);点线:1;短划线:2;实线:RA:蔗糖=1:2。
图4补加蔗糖和酶,交替糖蔗糖酶催化RA转苷反应,各组分的HPLC面积百分比×RA,■RA-glu1,◆RA-glu2;RA:蔗糖(w/w)=1:0.3,10mg RA/mL,32℃;虚线:初始10U/gRA,反应1h和2h时分别补加蔗糖4mg/mL酶5U/gRA;蔗糖3mg/mL酶5U/gRA;实线:20U/gRA。
图5以蔗糖为糖基供体,交替糖蔗糖酶催化莱鲍迪苷A转苷,反应24h,产物的HPLC图;RA:蔗糖=1:2(w/w),10mg RA/mL加酶量20U/g RA,反应温度32℃。
具体实施方式
分析计算方法:
(1)莱鲍迪苷A的定量分析依据GB2760-2014或JECFA2016中甜菊糖苷的分析检测方法。
(2)葡萄糖基甜菊糖苷的定性分析:采用液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪定性转苷产物,检测条件如下:ACQUITY UPLC BEH HILIC氨基色谱柱,柱温为30℃,乙腈:水=80:20(2min)-50:50(30min)(v/v)下梯度洗脱,进样量10μL,进样浓度为10g/L,流速为0.8mL/min;质谱条件为碰撞电压为6eV;离子化方式电喷雾电离(ESI),负离子检测模式,分子量范围:200-2000。
(3)葡萄糖基甜菊糖苷的定量分析依据GB2760-2014卫计委增补文件中葡萄糖基甜菊糖苷的分析检测方法。
(4)产物的定量分析计算公式
其中,C0—反应前反应液中RA的浓度(g/L),Ct—t时刻反应液中RA的浓度(g/L),CRAG—反应液中葡糖糖基莱鲍迪苷A的浓度(g/L),MWRA—RA的分子量,MWRAGn—葡糖糖基(接枝数为n)莱鲍迪苷A的分子量。
交替糖蔗糖酶酶活定义:将每分钟水解蔗糖生成1μmol的果糖所需酶量定义为蔗糖磷酸化酶的一个单位的酶活力(U)。
交替糖蔗糖酶酶活测定方法:将待测酶液在45℃下保温30min,取0.4mL加入到3.6mL蔗糖NaAc-HAc缓冲溶液(50mmol/L,pH5.4)中,使蔗糖最终浓度为10%,在40℃预热10min,加入100ul的酶液,反应30min后加入3mL DNS,煮沸7min迅速冷却,加蒸馏水定容至15ml,540nm下测吸光度。
以下实施例中所用交替糖蔗糖酶均为来源于枯草杆菌(Bacillus subtilisWB600)的交替糖蔗糖酶。
实施例一:交替糖蔗糖酶催化斯替夫苷(St)和莱鲍迪苷A(RA)的转苷能力比较
分别将斯替夫苷(St)和莱鲍迪苷A(RA)与等质量比的蔗糖用去离子水配制成40gSt/L、40g RA/L的反应液,在40℃下加入20U/g蔗糖的交替糖蔗糖酶。在40℃的恒温水浴中搅拌反应3h。St的HPLC峰面积百分比为30%,转化率达76%,产品中单葡萄糖基斯替夫苷的HPLC峰面积百分比为36%,质量百分比为42%;单、二葡萄糖基斯替夫苷的HPLC峰面积百分比之和为52%,质量百分比之和为68%。RA的HPLC峰面积百分比为60%,转化率仅达41%,产品中单葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比为32%,质量百分比为35%;单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比之和为36%,质量百分比之和为39%。参见附图1。
因此,40℃下反应3h,以20U/g蔗糖的交替糖蔗糖酶催化斯替夫苷(St)的转苷能力是莱鲍迪苷A(RA)的1.85倍。这说明,利用交替糖蔗糖酶催化莱鲍迪苷A转苷存在一定的技术难度,同时也说明本发明的技术也可以用来制备斯替夫苷的转苷产品,而且转化率更高。
实施例二:单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的制备
将RA与4倍质量比的蔗糖用去离子水配制成80g RA/L的反应液,在35℃下加入20U/g RA的交替糖蔗糖酶。在35℃的恒温水浴中搅拌反应24h,RA的HPLC峰面积百分比为14%,转化率达88%,产品中单葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比为37%,质量百分比为37%;单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比之和为51%,质量百分比之和为51%。参见附图2。
实施例三:单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的制备
将RA与2倍质量比的蔗糖用去离子水配制成100g RA/L的反应液,在40℃下加入60U/g RA的交替糖蔗糖酶。在40℃的恒温水浴中搅拌反应3h,RA的HPLC峰面积百分比为17%,转化率达84%,产品中单葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比为39%,质量百分比为41%;单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比之和为52%,质量百分比之和为57%。
实施例四:单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的制备
将RA与3倍质量比的蔗糖用去离子水配制成50g RA/L的反应液,在35℃下加入20U/g RA的交替糖蔗糖酶。在35℃的恒温水浴中搅拌反应24h,RA的HPLC峰面积百分比为20%,转化率达82%;产品中单葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比为40%,质量百分比为42%;单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比之和为52%,质量百分比之和为56%。参见附图2。
实施例五流加蔗糖的条件下制备单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A
将RA和蔗糖用蒸馏水配制成100RAg/L,RA:蔗糖=1:0.2(w/w)的溶液。在2个100mL具塞锥形瓶中各加入10mL上述溶液,加入20U/g RA的交替糖蔗糖酶。32℃水浴中反应,然后每小时向其中一个锥形瓶中加蔗糖20mg,共加9次,最终RA与蔗糖的质量比1:2。反应24h,RA的HPLC峰面积百分比为23%,转化率达77%,产品中单葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比为39%,质量百分比为41%;单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比之和为50%,质量百分比之和为54%。向另一个锥形瓶中每小时加蔗糖10mg,共加18次。最终RA与蔗糖的质量比1:2。反应24h,RA的HPLC峰面积百分比为21%,转化率78%,产品中单葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比为38%,质量百分比为41%;单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比之和为50%,质量百分比之和为55%。参见附图3。
实施例六流加蔗糖和酶的条件下制备单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A
将RA与0.3倍质量比的蔗糖用去离子水配制成90g RA/L的反应液,在32℃下加入20U/g RA的交替糖蔗糖酶。在32℃的恒温水浴中搅拌反应1h,补加4g/L蔗糖和5U/g酶;再在32℃反应1h后补加3g/L蔗糖和5U/g酶。反应7h,RA的HPLC峰面积百分比为32%,转化率达62%,产品中单葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比为41%,质量百分比为41%;单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比之和为51%,质量百分比之和为52%。参见附图4。此工艺可缩短反应时间。
对照例1:将交替糖蔗糖酶换成来源于重组枯草芽孢杆菌的蔗糖磷酸化酶(250U/mL)。加酶量100U/g RA,反应温度55℃,其他反应条件与实施例六相同。反应24h,经HPLC分析,没有RA的转苷产物生成。
对照例2:将交替糖蔗糖酶换成酵母蔗糖酶(诺维信invertase 200000SU/g)。加酶量20000SU/g RA,反应温度60℃,其他反应条件与实施例六相同。反应24h,经HPLC分析,没有RA的转苷产物生成。
上述实施例中使用的来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WB600)的交替糖蔗糖酶可以按照下述方法制备得到:将枯草芽孢杆菌WB600接种于组成为:蛋白胨8-12g/L,酵母粉4-6g/L,氯化钠8-12g/L的培养基中,在35-38℃,180-220rpm下培养8-10h;然后以5%-10%接种量转接至组成为:酵母浸膏20-25g/L,大豆蛋白胨5-10g/L,甘油4-6g/L且初始pH为6-7的培养基中,在40-41℃,180-220rpm下培养45-50h。发酵结束后,8000rpm离心10min,收集上清液即为交替糖蔗糖酶粗酶液。测得粗酶液中交替糖蔗糖酶的酶活为90U/mL。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种制备单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的方法,其特征在于,以蔗糖为糖基供体,莱鲍迪苷A为受体,以交替糖蔗糖酶催化莱鲍迪苷A的转苷反应,合成单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A。
2.根据权利要求1所述的一种制备单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的方法,其特征在于,将莱鲍迪苷A与蔗糖配制成反应液,加入交替糖蔗糖酶,于20-45℃恒温搅拌反应;待反应体系中单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的百分比之和大于50%或莱鲍迪苷A的转化率高于86%后,停止反应;或者,将莱鲍迪苷A与蔗糖配制成反应液,加入交替糖蔗糖酶,于20-45℃恒温搅拌反应,当莱鲍迪苷A的转化率不再升高时停止反应。
3.根据权利要求2所述的一种制备单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的方法,其特征在于,配制反应液时,所用的溶剂为水。
4.根据权利要求2所述的一种制备单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的方法,其特征在于,配制的反应液中RA的质量浓度为40-100g/L。
5.根据权利要求2或4所述的一种制备单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的方法,其特征在于,RA与蔗糖质量比为1:(0.2-4)。
6.根据权利要求1-5任一所述的一种制备单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的方法,其特征在于,所述交替糖蔗糖酶来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600。
7.根据权利要求1-6任一所述的一种制备单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的方法,其特征在于,交替糖蔗糖酶的加酶量为1-60U/g RA。
8.根据权利要求1-6任一所述的一种制备单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的方法,其特征在于,反应过程中补加底物和/或酶。
9.根据权利要求1-8任一所述方法制备得到的单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A。
10.应用权利要求9所述单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A制备得到的甜味剂。
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CN109097423B (zh) | 2021-05-28 |
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