CN109090243A - 一种食药用真菌风味乳饮料制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食药用真菌风味乳饮料制备方法，属于食品发酵技术领域。本发明直接选用新鲜牛奶为发酵培养基，既保留了牛奶本身的营养价值，又获得了珍贵食药用真菌发酵过程中产生的具有人体保健功能的活性物质，具有极高的药用价值。辅以乳酸菌进行二次发酵，分解乳糖和蛋白质促进人体吸收，调节肠道菌群，抑制有害菌在肠道的生长，提高人体免疫力。运用本方法制得的乳制品色泽均匀，香甜醇厚，口感细腻，有独特食用菌风味的淡淡芳香，且制作工艺简单，成本低廉，适合广泛推广。

Description

一种食药用真菌风味乳饮料制备方法

技术领域

本发明涉及一种食药用真菌风味乳饮料制备方法，尤其是一种利用食药用真菌与乳酸菌混合发酵制备乳制品的方法及其应用，属于食品发酵技术领域。

背景技术

食药用真菌药理价值极高，其发酵过程中产生的活性物质对人体健康有重要调节作用。多糖类物质如灵芝多糖具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖血脂等功效，且易被吸收利用；菌体中的三萜类物质具有抗炎、镇静、抗衰老作用，可以迅速提高免疫力。

随着人们对于食药用真菌营养及药用价值的关注度越来越高，市场上涌现出一批食药用真菌乳制品，如灵芝菌球奶、灵芝牛奶、食用菌复合酸奶饮品等。在制备食药用真菌乳制品时，现有技术大多是将食药用真菌发酵液或菌丝体、食药用真菌子实体提取液添加至牛奶中再进行乳酸发酵，加工工艺复杂，且食药用真菌发酵液在高温等处理中不稳定的活性物质如三萜类易损失，以致食药用真菌的功效不能被完全利用，营养成分流失严重。

因此提供一种制作工艺简单、产品营养价值丰富、风味独特、口感好、同时具有药用价值和酸奶的营养成分食药用真菌乳制品制备方法，克服现有乳制品行业产品单一的不足，对乳制品行业的进一步发展具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种利用食药用真菌与乳酸菌混合发酵制备乳制品的方法，具体包括以下步骤：

(1)挑取食药用真菌菌丝于斜面培养基上培养纯化；

(2)取纯化后的真菌菌丝，接入种子液培养；

(3)取培养后的菌丝培养液接种到发酵液体培养基中，发酵；

(4)在发酵过程中接入乳酸菌，进行二次发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述食药用真菌包括灵芝和牛樟芝。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述的培养基包括PDA斜面培养基。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述种子液包括：麸皮8-12g/L，玉米粉8-12g/L，硫酸镁1.0-1.5g/L，磷酸二氢钾1.5-2.0g/L，葡萄糖15-25g/L，培养条件为25-30℃，110-150rpm，至摇瓶内均匀充满菌丝球。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述的发酵条件是25-30℃，110-150rpm，所述的发酵液体培养基为脱脂牛奶。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中接入乳酸菌菌剂的质量百分比为2％-3％，同时加入终浓度为0-2％的蔗糖或葡萄糖。

在本发明的一种实施方式中，当所用食药用真菌为灵芝时，步骤(4)中接入乳酸菌的时间为84-120h。

在本发明的一种实施方式中，当所用食药用真菌为牛樟芝时，步骤(4)中接入乳酸菌的时间为240-288h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中二次发酵的条件为40-45℃，静置培养10-12h。

本发明的另一个目的是提供一种食药用真菌与乳酸菌混合发酵制备乳制品的方法在制备酸奶中的应用，其中在食用菌与乳酸菌共同发酵阶段静置培养方式，有利于食用菌活性物质的合成，进而提高了活性物质含量。

本发明提供了一种利用食药用真菌与乳酸菌混合发酵制备乳制品的方法。运用本发明提供的方法，当所用食药用真菌为灵芝时，在液体发酵至96h左右接入乳酸菌，所得灵芝酸奶中活性物质含量较高，此时每克菌体含三萜11mg，多糖47.8mg，每毫升发酵液含游离氨基酸2.29mg；当所用食药用真菌为牛樟芝时，在液体发酵至288h左右接入乳酸菌，所得牛樟芝酸奶中活性物质含量较高，且伴有浓烈的酯香，此时每克菌体含有三萜20.02mg，多糖21.5mg，每毫升发酵液含游离氨基酸1.86mg。而且，制得的乳制品色泽均匀，香甜醇厚，口感细腻，有独特食用菌风味的淡淡芳香，且制作工艺简单，成本低廉，可广泛推广。

具体实施方式

(一)培养基

牛奶培养基：150mL新鲜脱脂纯牛奶于105℃高压蒸汽灭菌15分钟。

种子培养基(种子液)：麸皮8-12g，玉米粉8-12g，硫酸镁1.0-1.5g，磷酸二氢钾1.5-2.0g，葡萄糖15-25g，蒸馏水1000mL，混合均匀，每瓶80mL分装于250mL三角瓶，纱布封口，牛皮纸包好，121℃灭菌30分钟。

PDA斜面培养基：将马铃薯洗净去皮，再称取200g切成小块，加水煮烂，用八层纱布过滤，加热，再据实际实验需要加15-20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1L，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，115℃灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。

(二)菌种来源

灵芝(Ganoderma lucidum)斜面，乳酸菌(嗜热链球菌，保加利亚乳杆菌)由江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室保存和提供，牛樟芝(Antrodia camphorata)来源于美国菌种保藏中心，保藏号为ATCC200183。

(三)活性物质含量的测定

1.总三萜类物质含量测定：

1.1标准曲线制备

精密吸取熊果酸溶液0.10mL，0.20mL，0.40mL，0.60mL，0.80mL，1.00mL，1.20mL(该标准系列相当于含熊果酸0.01mg，0.02mg，0.04mg，0.06mg，0.08mg，0.10mg，0.12mg)置具塞10mL比色管中，水浴加热挥去溶剂，加入新配制的5％香草醛-冰乙酸溶液(0.5g香草醛溶于冰醋酸中，稀释至10mL)0.2mL和0.8mL高氯酸溶液，在65℃水浴加热15min，取出后冰浴冷却，再加入5.0mL冰乙酸，摇匀放置15min，在548nm波长处测定OD值，以熊果酸质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2供试品溶液的制备

准确称取冻干后的样品0.5g置于50mL容量瓶中，加入35mL乙酸乙酯溶解，超声震动提取30min，取出放冷至室温，用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀，静置，过滤，弃去初滤液，摇匀，静置，过滤，弃去初滤液，保留续滤液，作为样品提取液备用。

1.3样品含量测定

做三个平行样，根据浓度精密吸取对应样品提取液于具塞10mL比色管中，水浴加热挥去溶剂，加入新配制的5％香草醛－冰乙酸溶液(0.5g香草醛溶于冰醋酸中，稀释至10mL)0.2mL和0.8mL高氯酸溶液，在65℃水浴加热15min，取出冰浴冷却，再加入5.0mL冰乙酸，摇匀放置15min，在548nm波长处测定。

2.游离氨基酸含量测定：

2.1所需溶液配制

a.乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH＝5.5)的配制：精确称取30.3g无水乙酸钠于烧杯中，加入150mL蒸馏水，用移液管移取2.50mL冰醋酸到烧杯中，加热溶解，冷却后转移到250mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。

b.3％茚三酮乙二醇溶液的配制：精确称取3g水合茚三酮，加入50mL乙二醇，低温加热溶解后，转移至100mL容量瓶中，用乙二醇定容至刻度，转移到试剂瓶后置于0℃-5℃冰箱中保存备用(临用时配)。

c.甘氨酸标准储备液：准确称取0.1000g甘氨酸标准品，加蒸馏水溶解定容到100mL容量瓶中并摇匀，转移到玻璃试剂瓶后置于0℃-5℃冰箱中备用，此溶液质量浓度为1000μg/mL。

2.2标准曲线制备

分别吸取上清液2.00mL和0.0μg/mL、10.0μg/mL、15.0μg/mL、25.0μg/mL、30.0μg/mL、50.0μg/mL、75.0μg/mL的甘氨酸系列标准溶液2.0mL置于20mL比色管中，加入乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH＝5.5)5.0mL，充分摇匀后，加2.0mL质量浓度3％的茚三酮乙二醇溶液，摇匀，于沸水浴中加热，颜色变化后计时20min，计时结束后取出试管，冷却至室温，倒入比色皿中，以0.0μg/mL的甘氨酸溶液为参比，在566nm波长处测定吸光度，以甘氨酸浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2.3样品游离氨基酸含量测定

将样品混匀后取1mL于5mL离心管中，按体积比为1:2.5加甲醇，混匀，10000rpm，20min离心，取上清(去除蛋白质)。

做三个平行样，按浓度取不同体积上清液和蒸馏水(总体积2mL)置于20mL比色管中，加入乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH＝5.5)5.0mL，充分摇匀后，加2.0mL质量浓度3％的茚三酮乙二醇溶液，摇匀，于沸水浴中加热，颜色变化后计时20min，计时结束后取出试管，冷却至室温，倒入比色皿中，以0.0μg/mL的甘氨酸溶液为参比，在566nm波长处测定吸光度，计算出样品含量。

3.胞内多糖含量测定：

3.1标准曲线制备

精密称取烘干至恒重的无水葡萄糖0.04g置1000mL容量瓶中，加水适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。

依次吸取葡萄糖溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL、2.0mL，蒸馏水1.8mL、1.6mL、1.4mL、1.2mL、1.0mL、0.8mL、0.6mL、0.4mL、0.2mL、0.0mL，6％苯酚1mL，浓硫酸5mL于比色管中，混匀，冷却后于490nm测OD值，以葡萄糖溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

3.2样品处理

取20mg菌体于5mL离心管中，加入2mL去离子水，沸水浴1h，期间每隔20分钟于振荡器上振荡一次，水浴后再加入2mL去离子水，重复上述步骤。

取所得3mL液体，加入4倍体积95％乙醇4℃过夜醇沉。

3.3样品胞内多糖测定

8000rpm，5min离心后去上清，留沉淀，加入75％乙醇6mL，摇匀后8000rpm，5min离心，去上清，置于烘箱中晾干；

加10mL蒸馏水，8000rpm，5min离心，做三个平行样，取上清1mL，蒸馏水1mL，6％苯酚1mL，浓硫酸5mL于比色管，混匀。490nm测OD值。从标准曲线上读出供试品溶液中多糖的含量，计算，即得。

(四)感官评定实验

感官评定方法：食用菌发酵酸奶由随机选取的8名评价员进行评价，按规定的评分标准进行综合评价。为提高感官评价的可信度，感官鉴别的时间在14：00—16：00时，不能在餐后1h参与鉴别，鉴别的最适温度为15-25℃(常温)，在鉴别时应注意避免混杂外来气味并保持口腔清爽，当有情绪影响时不要进行品评。每个样品设有色泽、香气、滋味和组织状态4个指标，感官分数分别为25分，总数100分，取平均值为最终结果。

实施例1：灵芝菌丝与乳酸菌混合发酵制备乳制品

1.母种的纯化

在超净工作台用接菌棒从母种试管中挑取少量灵芝菌丝于PDA斜面培养基上，置于恒温培养箱中培养直至菌丝长满整个斜面，重复纯化2-3次，置于4℃冰箱保存。

2.种子液的准备

将低温保藏的灵芝斜面在常温下活化，在超净工作台用接种针取0.5cm×0.5cm左右的菌块，接入装液量为80mL种子培养基中，并用接种针将其切碎以使其能均匀分散在种子液中，放入摇床中，30℃，150rpm培养120-144h，直至瓶内均匀充满菌丝球。

3.液体深层发酵培养

将长好的灵芝种子液打散，在超净工作台中以接种体积比为1:7吸取种子液分别接到牛奶培养基中，30℃，150rpm培养96h。

4.乳酸菌接种发酵培养

按3％接入乳酸菌发酵剂，42℃继续发酵10h，取出后放入4℃冷藏。检测所得乳制品中活性物质的含量，并进行感官评定。

实施例2：将灵芝菌丝种子液接到牛奶培养基中培养84h，其余条件与实施例1一致。

实施例3：将灵芝菌丝种子液接到牛奶培养基中培养106h，其余条件与实施例1一致。

实施例4：将灵芝菌丝种子液与液体发酵培养基体积比调整为1：10，其余条件与实施例1一致。

实施例5：将乳酸菌的接入量调整为2％，其余条件与实施例1一致。

实施例6：牛樟芝菌丝与乳酸菌混合发酵制备乳制品

1.母种的纯化

在超净工作台用接菌棒从母种试管中挑取少量牛樟芝菌丝于PDA斜面培养基上，置于恒温培养箱中培养直至菌丝长满整个斜面，重复纯化2-3次，置于4℃冰箱保存。

2.种子液的准备

将低温保藏的牛樟芝斜面在常温下活化，在超净工作台用接种针取0.5cm×0.5cm左右的菌块，接入装液量为80mL种子培养基中，并用接种针将其切碎以使其能均匀分散在种子液中，放入摇床中，28℃，110rpm培养312-336h，直至瓶内均匀充满菌丝球。

3.液体深层发酵培养

将长好的牛樟芝种子液打散，在超净工作台中以接种体积比为1:6吸取种子液分别接到牛奶培养基中，28℃，110rpm培养288h。

4.乳酸菌接种发酵培养

接入乳酸菌发酵剂3％，42℃继续发酵10h，取出后放入4℃冷藏。检测所得乳制品中活性物质的含量，并进行感官评定。

实施例7：将牛樟芝菌丝种子液接到牛奶培养基中培养240h，其余条件与实施例6一致。

实施例8：将牛樟芝菌丝种子液接到牛奶培养基中培养264h，其余条件与实施例6一致。

实施例9：将牛樟芝菌丝种子液与液体发酵培养基体积比调整为1:10，其余条件与实施例6一致。

实施例10：将乳酸菌的接入量调整为2％，其余条件与实施例6一致。

对比例1：在牛奶培养基中接入3％的乳酸菌发酵剂，42℃培养10h，测定发酵液中活性物质。

对比例2：将灵芝菌丝种子液接到牛奶培养基中培养72h，其余条件与实施例1一致。

对比例3：将牛樟芝菌丝种子液接到牛奶培养基中培养96h，其余条件与实施例6一致。

在不同条件下制得的乳制品中活性物质的含量如表1所示。当所用食药用真菌为灵芝时，在液体发酵至96h左右接入乳酸菌，所得灵芝酸奶中活性物质含量较高，此时每克菌体含三萜11mg，多糖47.8mg，每毫升发酵液含游离氨基酸2.29mg。

当所用食药用真菌为牛樟芝时，在液体发酵至288h左右接入乳酸菌，所得牛樟芝酸奶中活性物质含量较高，且伴有浓烈的酯香，此时每克菌体含有三萜20.02mg，多糖21.5mg，每毫升发酵液含游离氨基酸1.86mg。

表1不同条件下所得乳制品中活性物质的含量

表2感官评价标准

表3实施例1中制得的灵芝酸奶感官评定实验结果表

由表2感官评价标准和表3检测数据可得，灵芝酸奶在色泽，香气，滋味和组织状态方面均得到了平均优的评分，说明本品色泽光亮，带有独特灵芝芳香，香甜醇厚，口感细腻，有独特灵芝风味，组织均一一致，无分层，无明显沉淀，且由前一阶段牛奶发酵的活性物质指标测定得本品灵芝多糖，灵芝三萜和游离氨基酸含量丰富，感官评定和营养成分测定都显示，本品较市面普通酸奶具有其突出之处。

表4实施例6中制得的牛樟芝酸奶感官评定实验结果表

由表4可知，牛樟芝酸奶发酵饮品的色泽，香气，滋味和组织状态评分较高，其中香气、滋味的特点更为突出，说明其口感较为独特醇香，富有牛樟芝发酵所带来的酯香，浓厚怡人。同时食用菌生长形成的菌球不仅富含多糖、三萜等活性物质，同时，其菌体的弹滑口感也带来了更丰富的味觉体验，这是目前市售酸奶所不具备的特点。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种食药用真菌风味饮料制备方法，其特征在于，利用食药用真菌与乳酸菌混合发酵制备乳制品，具体包括以下步骤：

(1)挑取食药用真菌菌丝于斜面培养基上培养纯化；

(2)取纯化后的真菌菌丝，接入种子液中培养；

(3)取培养后的菌丝培养液接种到发酵液体培养基中，发酵；

(4)在发酵过程中接入乳酸菌，进行二次发酵。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述食药用真菌包括灵芝和牛樟芝。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的斜面培养基包括PDA斜面培养基。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述种子液包括：麸皮8-12g/L，玉米粉8-12g/L，硫酸镁1.0-1.5g/L，磷酸二氢钾1.5-2.0g/L，葡萄糖15-25g/L，培养条件为25-30℃，110-150rpm，培养至摇瓶中充满菌丝球。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的发酵条件是25-30℃，110-150rpm，所述的发酵液体培养基为脱脂牛奶。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所用的食药用真菌为灵芝时，步骤(4)中接入乳酸菌的时间为发酵第84-120h。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所用的食药用真菌为牛樟芝时，步骤(4)中接入乳酸菌的时间为发酵第240-288h。

8.根据权利要求1或6或7所述的方法，其特征在于，步骤(4)中接入乳酸菌菌剂的质量百分比为2％-3％。

9.根据权利要求1或6或7或8任一所述的方法，其特征在于，步骤(4)中二次发酵的条件为40-45℃，静置培养10-12h。

10.应用权利要求1～9任一所述的方法制备得到的饮料。