CN109082471A - 一种肺腺癌患者预后预测用外周血mRNA标记物及其筛选方法和应用 - Google Patents

一种肺腺癌患者预后预测用外周血mRNA标记物及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于肺腺癌患者预后预测的外周血mRNA标记物及其筛选方法，属于医学分子生物学技术和临床医学技术领域。本发明提供了一种用于肺腺癌患者预后预测的外周血mRNA标记物的筛选方法：(1)比较分析野生型人肺癌细胞系和Nrf2基因敲除型人肺癌细胞系的基因表达谱，得到Nrf2靶基因；(2)利用发现群体数据库分析所述Nrf2靶基因表达量与肺腺癌预后生存率的关系，筛选出发现群体数据库中Nrf2靶基因表达量Wald统计量＞2的基因，得到用于肺腺癌患者预后预测的外周血mRNA标记物。本发明所述筛选方法得到的标记物应用于临床肺腺癌患者预后的预测，具有较好的灵敏度、稳定性和特异性，可推广使用。

Description

一种肺腺癌患者预后预测用外周血mRNA标记物及其筛选方法 和应用
技术领域
本发明属于医学分子生物学技术和临床医学技术领域，具体涉及一种肺腺癌患者预后预测的外周血mRNA标记物及其筛选方法。
背景技术
肺腺癌(lung adenocarcinoma)是肺癌的一种，属于非小细胞癌，是目前临床常见的肺癌类型，也是非吸烟人群中最常见的肺癌类型。随着我国工业化进程加快，雾霾等极端恶劣天气的增多，肺腺癌的发病率逐年增高且呈年轻化趋势，因此，肺腺癌患者的预后受到了越来越多的关注。近年来，医学发展迅速使肺腺癌患者的生存期有所延长，但是个体间预后差异仍较大。虽然目前对于早期肺腺癌患者推荐进行术后化疗，但是并不是所有早期肺腺癌患者都能从术后化疗中获益。相反，部分肺腺癌患者虽然没有转移的临床表现，但可能存在潜在的微转移灶并不断进展，故而需要进行积极的术后治疗。因此，如果能够进行早期的术后预后预测，就可以在预后良好的患者群中降低不必要的化疗风险，同时也能筛选出高危的早期肺腺癌患者进行术后必要的、积极的个体化治疗。
氧化应激是指细胞暴露于高浓度过氧化氢(H2O2)、羟自由基(·OH)或超氧阴离子(O2－·)、氢过氧化物(HOO·)和次氯酸(HOCl)等，即所谓活性氧(reactive oxidativespecies，ROS)而引起的细胞损伤。过量的ROS及其衍生物的产生和积累可破坏细胞内DNA、脂质、蛋白质等的结构和功能，继而引发癌基因、抑癌基因的表达失调，最终导致肿瘤的发生。
机体形成了一套复杂的氧化应激应答系统，当氧化应激原破坏细胞时，机体可启动一系列复杂的信号转导级联反应，使细胞内多种保护基因的转录和保护性蛋白的合成增多，并在应激后一段时间内发挥对细胞的保护作用，以缓解细胞所受的损害。目前研究最为深入和成熟的保护因子为NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor2,Nrf2)。
Nrf2是细胞调节抗氧化应激的重要转录因子。生理状态下Nrf2与胞浆蛋白伴侣分子Keap1(Kelch-like ECH-associated protein1)结合，Nrf2活性处于相对抑制状态。氧化应激原作用下Keap1构象发生变化，导致Nrf2-Keapl解偶联，同时激活Nrf2。活化的Nrf2进入细胞核，与小Maf蛋白等转录因子形成异二聚体，识别抗氧化反应元件(antioxidantresponse element,ARE)，启动下游众多保护性基因的表达，增加细胞对氧化应激的抗性。
受Nrf2调控的下游靶基因数量众多，目前认为受Nrf2信号传导通路调节的靶基因主要包括谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)、NAD(P)H苯醌氧化还原酶-1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶(glutamate-cysteine ligase,GCL)、血红素氧合酶-1(HO-1)、多药耐药蛋白(multi-drug resistanceprotein,Mrp)等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肺腺癌患者预后预测的外周血mRNA标记物及其筛选方法和应用，所述标记物应用于临床肺腺癌患者预后的预测，具有较好的灵敏度、稳定性和特异性，可以推广使用。
本发明提供了一种用于肺腺癌患者预后预测的外周血mRNA标记物的筛选方法，包括如下步骤：
(1)对野生型人肺癌细胞系和Nrf2基因敲除型人肺癌细胞系的基因表达谱比较分析鉴定，得到Nrf2靶基因；
(2)通过统计Nrf2基因敲除型人肺癌细胞系的基因表达量变化趋势，根据差异KEGG通路分析，预测Nrf2靶基因参与了人类癌症的发病机制；
(3)利用单因素Cox比例风险回归分析方法分析所述Nrf2靶基因表达量与肺腺癌预后生存率的关系，筛选出发现群体数据库中Nrf2靶基因表达量Wald统计量＞2的基因，得到用于肺腺癌患者预后预测的外周血mRNA标记物。
优选的，所述步骤(3)肺腺癌预后生存率包括肺腺癌患者无复发生存率和/或肺腺癌患者总生存率。
优选的，所述步骤(3)中Nrf2靶基因表达量与肺腺癌患者无复发生存率的关系采用登记号为GSE8894的GEO数据库进行分析。
优选的，所述步骤(3)中Nrf2靶基因表达量与肺腺癌患者总生存率的关系采用登记号为GSE3141的GEO数据库进行分析。
所述步骤(2)中统计Nrf2基因敲除型人肺癌细胞系的基因表达量变化趋势的方法时设定假阳性率＜0.01且差异表达变化倍数＞1.5。
优选的，所述步骤(3)筛选得到用于肺腺癌患者预后预测的外周血mRNA标记物后，还包括采用独立样本集验证所述外周血mRNA标记物；所述验证方法包括如下步骤：
①计算所述步骤(3)中筛选得到的外周血mRNA标记物中各基因的权重W1～Wi；
②测定所述步骤(3)中筛选得到的外周血mRNA标记物中各基因在个体中的表达量e1～ei；
③将所述步骤①中计算得到的权重值和所述步骤②中测定得到的表达量值代入公式I中，计算风险值；
其中，S为风险值，n为基因数量，Wi代表第i个基因的权重，ei代表第i个基因的表达量，μi和τi分别代表所有入选基因表达量的均数和标准差；
④根据风险值结果进行判断：风险值＞0的个体为外周血mRNA标记物组合阳性，风险值≤0的个体为外周血mRNA标记物组合阴性；
⑤利用Kaplan-Meier生存分析方法和/或单因素Cox风险模型，分别对外周血mRNA标记物组合阳性患者和外周血mRNA标记物组合阴性患者的无复发生存率和/或总生存率进行分析判断，外周血mRNA标记物组合阳性患者的生存率与外周血mRNA标记物组合阴性患者相比显著降低，表明外周血mRNA标记物组合可用于预测肺腺癌的临床预后。
本发明提供了上述方法筛选得到的外周血mRNA标记物组合，包括以下基因：ALDOA、ALYREF、AP1S1、AP2B1、ARNTL2、AVEN、BYSL、C15orf48、C1orf43、CDK5、CENPH、DDX41、DLAT、DPP3、DPY19L1、ERO1L、FOSL1、FOSL2、GARS、GFPT2、GMFB、GNAI3、IPO4、MAPKAP1、MAX、METTL5、MRPS12、NAMPT、NOP16、PFKP、PLAU、PPIF、PSMB5、PSMC6、PSME3、RALA、RBM28、RRM1、RRM2、SDHC、SEH1L、SYNCRIP、TIMM50、TOMM5、UPP1、VEGFA、VTI1B、ABI3BP、ACACB、ANAPC16、C17orf103、ECHDC2、FAM117A、HSD17B14、ITPR2、KIAA0232、METTL7A、MPHOSPH8、PTCH1、RBBP6、RBPMS、RPS6KA5、TTC28、USP3、ZBTB4和ZNF70。
本发明提供了上述外周血mRNA标记物组合在制备用于肺腺癌患者预后预测的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种基于荧光定量PCR法检测肺腺癌患者预后的试剂盒，所述试剂盒包括所述的外周血mRNA标记物组合。
有益效果：
本发明提供了一种用于肺腺癌患者预后预测的外周血mRNA标记物的筛选方法，该方法通过比较分析野生型人肺癌细胞系和Nrf2基因敲除型人肺癌细胞系的基因表达谱，得到并鉴定Nrf2靶基因，然后利用发现群体数据库分析筛选Nrf2靶基因中与肺腺癌患者预后相关性较高的基因，得到用于肺腺癌预后预测的外周血mRNA标记物。
本发明提供了上述筛选方法得到的用于肺腺癌患者预后预测的外周血mRNA标记物组合。该标记物组合的表达情况与肺腺癌患者预后的无复发生存率与总生存率存在显著联系，利用该标记物组合进行肺腺癌患病个体预后的预测，具有较好的灵敏度、稳定性和特异性，可推广使用。
附图说明
图1为野生型(WT)人肺癌细胞系与Nrf2基因敲除型(KD)人肺癌细胞系不同基因表达热图，其中红色代表基因高表达，蓝色代表基因低表达；
图2为肺腺癌细胞A549株中Nrf2介导的40个KEGG通路，其中，P-值代表Fisher精确检验，虚线代表显著性水平α＝0.05；
图3为无复发生存率Kaplan-Meier曲线分析结果，其中，图3-A表示发现群体数据库(韩国)中66-基因标记物阳性患者的无复发生存率与66-基因标记物阴性患者相比显著降低；图3-B，图3-C，图3-D分别表示验证群体数据库(日本、瑞典和加拿大)中66-基因标记物阳性患者的无复发生存率与66-基因标记物阴性患者相比显著降低；黑色曲线代表66-基因标记物阳性患者，灰色曲线代表66-基因标记物阴性患者。通过log rank检验计算出P值，分析阳性和阴性组间存活率的差异，风险评分大于零定义为66-基因标记物阳性；
图4为肺腺癌患者总生存率Kaplan-Meier曲线分析；其中，图4-A表示发现群体数据库(韩国)中66-基因标记物阳性患者的总生存率与66-基因标记物阴性患者相比显著降低；图4-B，图4-C，图4-D分别表示验证群体数据库(日本、瑞典和加拿大)中66-基因标记物阳性患者的总存率与66-基因标记物阴性患者相比显著降低；黑色曲线代表66-基因标记物阳性患者，灰色曲线代表66-基因标记物阴性患者。通过log rank检验计算出P值，分析阳性和阴性组间存活率的差异，风险评分大于零定义为66-基因标记物阳性。
具体实施方式
本发明提供了一种用于肺腺癌患者预后预测的外周血mRNA标记物的筛选方法，包括如下步骤：
(1)对野生型(WT)人肺癌细胞系和Nrf2基因敲除型(KD)人肺癌细胞系的基因表达谱比较分析鉴定，得到Nrf2靶基因；
(2)通过统计Nrf2基因敲除型人肺癌细胞系的基因表达量变化趋势，根据差异KEGG通路分析，预测Nrf2靶基因参与了人类癌症的发病机制；
(3)利用单因素Cox比例风险回归分析方法分析所述Nrf2靶基因表达量与肺腺癌预后生存率的关系，筛选出发现群体数据库中Nrf2靶基因表达量Wald统计量＞2的基因，得到用于肺腺癌患者预后预测的外周血mRNA标记物。
在本发明中，所述步骤(1)中比较分析两种基因表达谱的方法优选为SAM算法。本发明优选设置假阳性率＜0.01且差异表达变化倍数＞1.5。通过比较分析，本发明初步筛选得到Nrf2靶基因(差异表达的基因)。
得到Nrf2靶基因后，本发明利用单因素Cox比例风险回归分析方法分析所述步骤(1)Nrf2靶基因表达量与肺腺癌预后的关系。在本发明中，所述肺腺癌预后优选包括肺腺癌患者无复发生存率和/或肺腺癌患者总生存率。在本发明中，当分析所述Nrf2靶基因表达量与肺腺癌患者无复发生存率的关系时，优选采用登记号为GSE8894的GEO数据库(来自韩国的发现群体数据库)进行分析。当分析所述Nrf2靶基因表达量与肺腺癌患者总生存率的关系时，优选采用登记号为GSE3141的GEO数据库(来自美国的发现群体数据库)进行分析。分析结束后，本发明筛选得到发现群体数据库中Nrf2靶基因表达量Wald统计量＞2的基因，这些基因即为本发明所述用于肺腺癌患者预后预测的外周血mRNA标记物。
在本发明中，所述统计Nrf2基因敲除型人肺癌细胞系的基因表达量变化趋势的方法时设定假阳性率＜0.01且差异表达变化倍数＞1.5。
得到用于肺腺癌患者预后预测的外周血mRNA标记物后，本发明优选利用独立样本集对所述外周血mRNA标记物进行验证；所述验证方法优选包括如下步骤：
①计算筛选得到的外周血mRNA标记物中各基因的权重W1～Wi；
②测定筛选得到的外周血mRNA标记物中各基因在个体中的表达量e1～ei；
③将所述步骤①中计算得到的权重值和所述步骤②中测定得到的表达量值代入公式I中，计算风险值；在所述式I中，S为风险值，n为基因数量，Wi代表第i个基因的权重，ei代表第i个基因的表达量，μi和τi分别代表所有入选基因表达量的均数和标准差；
④根据风险值结果进行判断：风险值＞0的个体为外周血mRNA标记物组合阳性，风险值≤0的个体为外周血mRNA标记物组合阴性；
⑤利用Kaplan-Meier生存分析方法，分别对外周血mRNA标记物组合阳性患者和外周血mRNA标记物组合阴性患者的无复发生存率和/或总生存率进行分析，比较Kaplan-Meier生存分析结果与外周血mRNA标记物阳性、阴性之间的关系；
⑥利用单因素Cox风险模型，分别对外周血mRNA标记物组合阳性患者和外周血mRNA标记物组合阴性患者的无复发生存率和/或总生存率进行分析判断，外周血mRNA标记物组合阳性患者的生存率与外周血mRNA标记物组合阴性患者相比显著降低，表明外周血mRNA标记物组合可用于预测肺腺癌的临床预后。
本发明利用独立样本集对所述外周血mRNA标记物进行验证，确定所述外周血mRNA标记物的表达情况与肺腺癌预后无复发生存率和/或总生存率之间的关系。结果表明：本发明筛选得到的外周血mRNA标记物与肺腺癌预后患者的无复发发生率和/或总生存率之间存在显著联系：外周血mRNA标记物阳性的患者预后无复发生存率显著低于外周血mRNA标记物阴性患者；外周血mRNA标记物阳性的患者预后的总生存率显著低于外周血mRNA标记物阴性患者。
本发明提供了上述筛选方法得到的用于肺腺癌患者预后预测的外周血mRNA标记物组合。所述标记物组合优选包括以下基因：ALDOA、ALYREF、AP1S1、AP2B1、ARNTL2、AVEN、BYSL、C15orf48、C1orf43、CDK5、CENPH、DDX41、DLAT、DPP3、DPY19L1、ERO1L、FOSL1、FOSL2、GARS、GFPT2、GMFB、GNAI3、IPO4、MAPKAP1、MAX、METTL5、MRPS12、NAMPT、NOP16、PFKP、PLAU、PPIF、PSMB5、PSMC6、PSME3、RALA、RBM28、RRM1、RRM2、SDHC、SEH1L、SYNCRIP、TIMM50、TOMM5、UPP1、VEGFA、VTI1B、ABI3BP、ACACB、ANAPC16、C17orf103、ECHDC2、FAM117A、HSD17B14、ITPR2、KIAA0232、METTL7A、MPHOSPH8、PTCH1、RBBP6、RBPMS、RPS6KA5、TTC28、USP3、ZBTB4和ZNF70。
本发明还提供了上述标记物在制备用于肺腺癌患者预后预测的试剂盒中的应用。在本发明中，所述试剂盒中优选包括上述标记物基因、用于检测上述标记物组合的试剂和/或用于检测上述标记物组合表达情况的试剂。在本发明中，所述标记物基因在试剂盒中用作阳性对照，所述各试剂用于对上述标记物组合或上述标记物组合的表达情况进行检测。本申请对具体的试剂类型不作特别限定，本领域常规检测上述标记物基因和/或上述标记物基因表达情况的试剂均可。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种肺腺癌患者预后预测的外周血mRNA标记物及其筛选方法和应用作进一步详细介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
一组可用于肺腺癌患者预后预测的基因标记物的筛选方法：
(1)为了筛选肺腺癌患者预后预测的基因标记物，首先使用SAM算法对野生型(WT)人肺癌细胞系和Nrf2基因敲除型(KD)人肺癌细胞系的基因表达谱进行比较分析。设定假阳性率<0.01且差异表达变化倍数>1.5的分析条件，结果见图1。图1表明：相较于野生型人肺癌细胞系，Nrf2KD细胞系中有2160个基因表达上调，同时1643个基因表达下调。
(2)对差异表达基因进行KEGG通路分析(Fisher精确检验)，结果见图2。图2显示，上述表达失调的Nrf2靶基因主要富集于癌症相关KEGG条目中，如“结肠直肠癌”、“前列腺癌”、“癌症通路”等，这表明Nrf2靶基因参与了人类癌症的发病机制。
(3)利用单因素Cox比例风险回归分析方法对上述所有Nrf2靶基因的表达量与肺腺癌预后的关系进行分析：利用来自韩国的发现群体数据库(GEO数据库登记号：GSE8894)分析Nrf2靶基因的表达量与肺腺癌患者无复发生存率之间的关系，同时利用来自美国的发现群体数据库(GEO数据库登记号：GSE3141)分析Nrf2靶基因的表达量与肺腺癌患者总生存率之间的关系。结果显示，韩国发现群体数据库中Nrf2靶基因表达量的Wald统计量(Cox回归系数与标准误差之比)(ZR)与美国发现群体数据库中Nrf2靶基因表达量的Wald统计量(ZD)具有正相关性。
本实施例筛选得到ZR和ZD值均>2的66个Nrf2靶基因，这66个Nrf2靶基因分别为ALDOA、ALYREF、AP1S1、AP2B1、ARNTL2、AVEN、BYSL、C15orf48、C1orf43、CDK5、CENPH、DDX41、DLAT、DPP3、DPY19L1、ERO1L、FOSL1、FOSL2、GARS、GFPT2、GMFB、GNAI3、IPO4、MAPKAP1、MAX、METTL5、MRPS12、NAMPT、NOP16、PFKP、PLAU、PPIF、PSMB5、PSMC6、PSME3、RALA、RBM28、RRM1、RRM2、SDHC、SEH1L、SYNCRIP、TIMM50、TOMM5、UPP1、VEGFA、VTI1B、ABI3BP、ACACB、ANAPC16、C17orf103、ECHDC2、FAM117A、HSD17B14、ITPR2、KIAA0232、METTL7A、MPHOSPH8、PTCH1、RBBP6、RBPMS、RPS6KA5、TTC28、USP3、ZBTB4和ZNF70。这些基因即为本发明所述用于肺腺癌患者预后预测的外周血mRNA标记物。
实施例2
实施例1所述用于肺腺癌患者预后预测的基因标记物的鉴定方法：
本实施例将实施例1所述66个基因组合定义为“66-基因标记物”，并利用“66-基因标记物”对肺腺癌发现群体数据库中每位患者进行风险评分。其中，“ALDOA、ALYREF、AP1S1、AP2B1、ARNTL2、AVEN、BYSL、C15orf48、C1orf43、CDK5、CENPH、DDX41、DLAT、DPP3、DPY19L1、ERO1L、FOSL1、FOSL2、GARS、GFPT2、GMFB、GNAI3、IPO4、MAPKAP1、MAX、METTL5、MRPS12、NAMPT、NOP16、PFKP、PLAU、PPIF、PSMB5、PSMC6、PSME3、RALA、RBM28、RRM1、RRM2、SDHC、SEH1L、SYNCRIP、TIMM50、TOMM5、UPP1、VEGFA和VTI1B”中每个基因的权重为“1”；“ABI3BP、ACACB、ANAPC16、C17orf103、ECHDC2、FAM117A、HSD17B14、ITPR2、KIAA0232、METTL7A、MPHOSPH8、PTCH1、RBBP6、RBPMS、RPS6KA5、TTC28、USP3、ZBTB4和ZNF70”中每个基因的权重为“-1”。本实施例按以下公式计算风险值：
式中，S为风险值，n为基因数量，Wi代表第i个基因的权重，ei代表第i个基因的表达量，μi和τi分别代表所有入选基因表达量的均数和标准差。高风险值代表差的疾病预后。本实施例将风险值>0的患者定义为66-基因标记物阳性患者。
Kaplan-Meier生存分析结果见图3-A和图4-A。其中，图3-A表明，来自韩国的发现群体数据库中“66-基因标记物”阳性患者的无复发生存率与“66-基因标记物”阴性患者相比显著降低；图4-A表明，来自美国的发现群体数据库中“66-基因标记物”阳性患者的总生存率与“66-基因标记物”阴性患者相比亦显著降低。
单因素Cox比例风险模型分析结果见表1：
表1 “66-基因标记物”阳性与发现群体肺腺癌患者生存率的相关性
表1结果显示，“66-基因标记物”阳性在发现群体无复发生存率中的风险值(HR，3.55；95％可信区间，1.67-7.54；P＝9.8×10-4)和总生存率中的风险值(HR，8.32；95％可信区间，3.33-20.79；P＝5.9×10-6)均较为显著。
实施例3
实施例2所述“66-基因标记物”预测肺腺癌预后在独立样本集中的验证和应用：
为了验证“66-基因标记物”在肺腺癌预后预测中的有效性，本实施例获取了验证群体数据库中“66-基因标记物”的表达数据。
(1)Kaplan-Meier生存曲线分析验证群体数据库中“66-基因标记物”阳性与肺腺癌患者无复发生存率的相关性。
本实施例分别对来自日本、瑞典和加拿大的验证群体数据库中的肺腺癌患者进行Kaplan-Meier生存分析。我们利用式1对每个患者计算风险值，风险值大于0的为阳性患者，小于或等于0的为阴性患者。分析过程使用了R语言的计算平台。我们利用了“survival”包的“survdiff”函数对于以上为每个病人计算的风险值以及无复发生存率进行Kaplan-Meier生存分析。结果分别见图3-B，图3-C，图3-D。经过对上述验证数据库中肺腺癌患者进行以“66-基因标记物”为基础的风险评分，结果发现，“66-基因标记物”阳性患者的无复发生存率显著降低。
本实施例分别对来自日本、瑞典和加拿大的验证群体数据库中的肺腺癌患者进行单因素Cox比例风险模型分析。分析过程使用了R语言的计算平台。我们利用了“survival”包的“coxph”函数对于每个病人的风险值和无复发生存率进行Cox比例风险模型分析。分析结果见表2：
表2 “66-基因标记物”阳性与验证群体肺腺癌患者无复发生存率的相关性
表2结果显示，“66-基因标记物”阳性在验证群体无复发生存率中的风险值(其中，JPN：HR，3.40；95％；可信区间，1.97-5.87；P＝1.1×10-5/SWE：HR，2.18；95％可信区间，0.98-4.82；P＝5.5×10-2/CAN：HR，2.44；95％可信区间，1.25-4.76；P＝8.7×10-3)显著。
(2)Kaplan-Meier生存曲线分析验证群体数据库中“66-基因标记物”阳性与肺腺癌患者总生存率的相关性
本实施例进一步对分别来自日本、瑞典和加拿大的验证群体数据库进行Kaplan-Meier生存分析(即对每个病人的风险值以及总生存率进行Kaplan-Meier生存分析)。结果分别见图4-B，图4-C，图4-D。经过对上述验证数据库中患者进行以“66-基因标记物”为基础的危险评分，本实施例发现“66-基因标记物”阳性患者的总生存率显著降低。
本实施例进一步对分别来自日本、瑞典和加拿大的验证群体数据库进行单因素Cox风险模型分析(即对每个病人的风险值和总生存率进行Cox回归)，结果见表3：
表3 “66-基因标记物”阳性与验证群体肺腺癌患者总生存率的相关性
表3结果显示，“66-基因标记物”阳性在验证群体总生存率中风险比(JPN：HR，4.78；95％可信区间，2.09-10.94；P＝2.2×10-4/SWE：HR，1.84；95％可信区间，1.16-2.91；P＝9.1×10-3/CAN：HR，2.10；95％可信区间，1.20-3.70；P＝1.0×10-2)显著。
(3)多因素Cox比例风险模型分析验证群体数据库中“66-基因标记物”阳性与肺腺癌患者生存率的相关性
肺腺癌患者的预后与几个指标有关，包括“66-基因标记物”阳性、分期、年龄、性别等。本实施例应用多因素Cox比例风险模型对这些指标进行进一步分析(即对每个病人的风险值、相关临床指标以及总生存率进行多元Cox回归)，结果见表4。
表4 “66-基因标记物”阳性与验证群体肺腺癌患者生存率的相关性
表4结果显示，“66-基因标记物”阳性在来自日本、瑞典和加拿大的验证群体中的无复发生存率和总生存率中风险比均较为显著。与传统的肺腺癌相关临床病理学因素相比，“66-基因标记物”是一种独立的预后因子。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于肺腺癌患者预后预测的外周血mRNA标记物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对野生型人肺癌细胞系和Nrf2基因敲除型人肺癌细胞系的基因表达谱比较分析鉴定，得到Nrf2靶基因；
(2)通过统计Nrf2基因敲除型人肺癌细胞系的基因表达量变化趋势，根据差异KEGG通路分析，预测Nrf2靶基因参与了人类癌症的发病机制；
(3)利用单因素Cox比例风险回归分析方法分析所述Nrf2靶基因表达量与肺腺癌预后生存率的关系，筛选出发现群体数据库中Nrf2靶基因表达量Wald统计量＞2的基因，得到用于肺腺癌患者预后预测的外周血mRNA标记物。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)肺腺癌预后生存率包括肺腺癌患者无复发生存率和/或肺腺癌患者总生存率。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)中Nrf2靶基因表达量与肺腺癌患者无复发生存率的关系采用登记号为GSE8894的GEO数据库进行分析。
4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)中Nrf2靶基因表达量与肺腺癌患者总生存率的关系采用登记号为GSE3141的GEO数据库进行分析。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)中统计Nrf2基因敲除型人肺癌细胞系的基因表达量变化趋势的方法时设定假阳性率＜0.01且差异表达变化倍数＞1.5。
6.根据权利要求1～5任一项所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)筛选得到用于肺腺癌患者预后预测的外周血mRNA标记物后，还包括采用独立样本集验证所述外周血mRNA标记物；所述验证方法包括如下步骤：
①计算步骤(3)中筛选得到的外周血mRNA标记物中各基因的权重W1～Wi；
②测定步骤(3)中筛选得到的外周血mRNA标记物中各基因在个体中的表达量e1～ei；
③将所述步骤①中计算得到的权重值和所述步骤②中测定得到的表达量值代入公式I中，计算风险值；
其中，S为风险值，n为基因数量，Wi代表第i个基因的权重，ei代表第i个基因的表达量，μi和τi分别代表所有入选基因表达量的均数和标准差；
④根据风险值结果进行判断：风险值＞0的个体为外周血mRNA标记物组合阳性，风险值≤0的个体为外周血mRNA标记物组合阴性；
⑤利用Kaplan-Meier生存分析方法和/或单因素Cox风险模型，分别对外周血mRNA标记物组合阳性患者和外周血mRNA标记物组合阴性患者的无复发生存率和/或总生存率进行分析判断，外周血mRNA标记物组合阳性患者的生存率与外周血mRNA标记物组合阴性患者相比显著降低，表明外周血mRNA标记物组合可用于预测肺腺癌的临床预后。
7.权利要求1～6任一项所述方法筛选得到的外周血mRNA标记物组合，其特征在于，包括以下基因：ALDOA、ALYREF、AP1S1、AP2B1、ARNTL2、AVEN、BYSL、C15orf48、C1orf43、CDK5、CENPH、DDX41、DLAT、DPP3、DPY19L1、ERO1L、FOSL1、FOSL2、GARS、GFPT2、GMFB、GNAI3、IPO4、MAPKAP1、MAX、METTL5、MRPS12、NAMPT、NOP16、PFKP、PLAU、PPIF、PSMB5、PSMC6、PSME3、RALA、RBM28、RRM1、RRM2、SDHC、SEH1L、SYNCRIP、TIMM50、TOMM5、UPP1、VEGFA、VTI1B、ABI3BP、ACACB、ANAPC16、C17orf103、ECHDC2、FAM117A、HSD17B14、ITPR2、KIAA0232、METTL7A、MPHOSPH8、PTCH1、RBBP6、RBPMS、RPS6KA5、TTC28、USP3、ZBTB4和ZNF70。
8.权利要求7所述外周血mRNA标记物组合在制备用于肺腺癌患者预后预测的试剂盒中的应用。
9.一种基于荧光定量PCR法检测肺腺癌患者预后的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求7所述的外周血mRNA标记物组合。
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