CN109071602B - 靶向α4β7整联蛋白的环肽 - Google Patents

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Abstract

本文描述了α4β7整联蛋白的拮抗剂，并且更具体而言涉及环肽拮抗剂。因此，本文描述了式(I)的化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8是各种取代基；立体中心1*、2*和3*各自独立地选自R和S；n为1、2、3或4，并且当n为2～4时，Z是氨基酸的氨基端；毗邻L的‑C＝O‑是氨基酸的羧基端；并且L连同Z和‑C＝O‑一起是肽。
Figure DDA0001732709290000011

Description

靶向α4β7整联蛋白的环肽
相关申请
本申请要求享有2015年11月11日提交的美国临时申请No.62/254003的优先权，以其全部内容结合于本文中作为参考。
技术领域
本发明涉及α4β7整联蛋白(α4β7integrin)的拮抗剂，并且更具体而言涉及环肽(cyclic peptide)拮抗剂。
背景技术
整联蛋白(integrin)是跨膜受体，是细胞-细胞和细胞-细胞外基质(cell-extracellular matrix)(ECM)相互作用的桥梁。触发时，整联蛋白会触发进入内部的化学通道(信号转导(signal transduction))，如所述ECM的所述化学组成和机械状态。
整联蛋白是专性异质二聚体(obligate heterodimer)，具有两个不同的链：所述α(阿尔法)和β(贝塔)亚单元。
α4β7整联蛋白在淋巴细胞上表达，并通过其与粘膜地址素细胞粘附分子(mucosaladdressin cell adhesion molecule)(MAdCAM)结合而负责T细胞归巢进入肠相关淋巴样组织(gut-associated lymphoid tissue)，MAdCAM存在于粘膜淋巴样器官的高内皮小静脉(high endothelial venules)上。
特异性整联蛋白-配体相互作用的抑制剂已经证明作为用于治疗各种自身免疫性疾病的抗炎药是有效的。例如，对α4β7表现出高结合亲和力的单克隆抗体已经表现出对胃肠道自身炎症/自身免疫疾病如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎的治疗益处。
仍有必要开发出改进的α4β7拮抗剂以预防或治疗炎症性病症和/或自身免疫性疾病。
制备环肽(整肠蛋白(nacellin))的某些方法描述于申请人的PCT公开号WO2010/105363中。
发明内容
在一方面中，提供了式(I)的化合物：
Figure GDA0001732709360000021
其中，
R1是H；低级烷基；芳基；杂芳基；烯基；或杂环；它们全部在一个或多个可取代的位置上被一个或多个合适的取代基可选取代；
R2和R3各自独立地是蛋白源性或非蛋白源性α-氨基酸的氨基酸链，
条件是R2和R3可以彼此共价连接而形成环；
R4和R5各自独立地为H；低级烷基；芳基；杂芳基；烯基；杂环；式-C(O)OH的酸；式-C(O)OR*的酯，其中R*选自烷基和芳基；式-C(O)NR**R***的酰胺，其中R**和R***独立地选自H，烷基和芳基；-CH2C(O)R，其中R选自-OH，低级烷基，芳基，-低级烷基-芳基，或-NRaRb，其中Ra和Rb独立地选自H，低级烷基，芳基或-低级烷基-芳基；或-C(O)Rc，其中Rc选自低级烷基，芳基或-低级烷基-芳基；或-低级烷基-ORd，其中Rd是合适的保护基或OH基；它们全部在一个或多个可取代的位置上被一个或多个合适的取代基可选取代；
条件是R2或R3可以与R1共价连接而形成环状仲胺，和/或共价连接至R4或R5形成环，R4和R5也可以彼此共价连接而形成环；
R6是H，低级烷基，苄基，烯基，低级烷氧基；芳基；杂芳基；杂环；-C(O)R****，其中R****独立地选自烷基，芳基，杂芳基，氨基，氨基烷基，氨基芳基，氨基杂芳基，烷氧基，芳氧基，杂芳氧基；-CH2C(O)R；或-C(O)Rc；它们全部在一个或多个可取代的位置上被一个或多个合适的取代基可选取代，
或与R7或R8一起形成蛋白源性或非蛋白源性氨基酸的环状侧链，其所述N-端是N-R6，其中蛋白源性或非蛋白源性氨基酸能够用合适的取代基取代；
R7和R8独立地选自其N-末端为N-R6的蛋白源性或非蛋白源性α氨基酸的所述氨基酸侧链，或可以与R6形成环状侧链；
立体中心1*、2*和3*各自独立地选自R和S；
n为1、2、3或4，并且当n为2～4时，每个R7和每个R8彼此独立；和
其中Z是氨基酸的氨基端；毗邻L的-C＝O-是氨基酸的羧基端；并且L连同Z和-C＝O-一起是具有以下式的肽：
Xy–Xz–X1–X2–X3
其中Xy和Xz各自独立地为蛋白源性或非蛋白源性的氨基酸；
X1是亮氨酸或叔丁基-Ala；
X2是Asp；和
X3是列于表1B的X3栏之下的任何氨基酸。
在一方面中，提供了一种包含本文所述的化合物以及药用载体的药物组合物。所述药物组合物可以经过配制而用于口服递送，局部递送和肠胃外递送中的任何一种。
在一方面中，提供了一种治疗患者中的炎症或自身免疫性疾病的方法，包括向所述患者给药治疗有效量的本文所述的化合物。优选所述炎症或自身免疫性疾病是胃肠道疾病。
在一方面中，提供了一种用于治疗与α4β7整联蛋白的生物学功能相关的患者中病症的方法，所述方法包括向所述患者给药治疗有效量的本文所述的化合物。
在一方面中，提供了一种治疗患者中的疾病或病症的方法，包括向所述患者给药治疗有效量的本文所述的化合物，其中所述疾病或病症是病毒或逆转录病毒的局部或全身性感染。
在一方面中，提供了一种治疗患者中的疾病或病症的方法，包括向所述患者给药治疗有效量的本文所述的化合物，其中所述肝炎A、B或C，肝性脑病，非酒精性脂肪肝炎，肝硬化，静脉曲张出血，血色病，威尔逊病，酪氨酸血症，α-1-抗胰蛋白酶缺乏症，糖原贮积病，肝细胞癌，肝癌，原发性胆管炎，原发硬化性胆管炎，原发性胆管硬化症，胆道疾病，自身免疫性肝炎或移植物抗宿主病。
附图说明
本发明的优选实施方式的这些和其它特征将在以下参考附图和表格的详细描述中变得更加显而易见，其中：
图1显示了本申请的代表性化合物，即来自以下类别，18元环，21元环，21元环(非规范的(non-canonical)，即具有δ氨基酸)，22元环和24元环。
图2显示了代表性的18元环化合物以及在某些位置进行的改变，具有与这些改变相关的相应α4β7整联蛋白ELISA IC50结合值。
图3显示了代表性的21元环化合物以及在某些位置进行的改变，具有与这些改变相关的相应α4β7整联蛋白ELISA IC50结合值。
图4显示了具有代表性的21元环(非规范的，即具有δ氨基酸)化合物以及在某些位置上进行的改变，具有与这些改变相关的相应α4β7整联蛋白ELISA IC50结合值。
图5显示了代表性的22元环化合物以及在某些位置上进行的改变，具有与这些改变相关的相应α4β7整联蛋白ELISA IC50结合值。
图6显示了单剂量的各种化合物之后T淋巴细胞运输研究(trafficking study)(从外周血到肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node))的结果。
图7显示了测试制品(ET1792)在首次用于实验的小鼠(
Figure GDA0001732709360000041
mice)中经一次和两次口服剂量的所述药代动力学曲线。
图8显示了单次口服给药后测试制品(ET1792)的所述药代动力学曲线。
图9显示了ET2451在已经接受所述测试化合物作为单一口服或静脉内剂量的首次用于实验的小鼠肝脏中的暴露。
图10显示了在小鼠中开始硫酸葡聚糖钠(dextran sulfate sodium)治疗后第5天和第8天对于不同治疗组的疾病活性指数评分(disease activity index score)。
图11显示了取自暴露于DSS和用各种测试化合物治疗的小鼠的所述结肠的离体评价的数据。
图12显示了小鼠中DSS暴露和测试nacellin治疗后所述结肠损伤的进一步细节。
图13显示了从暴露于DSS刺激物并用各种测试nacellin(整肠蛋白)或对照处理3天的小鼠取得的外周淋巴结，肠系膜淋巴结和外周血中T淋巴细胞含量的FACS分析的结果。
表1显示了展示α4β7整联蛋白亲和力、选择性和/或活性的化合物；和特别是关于这些化合物：(A)所述连接基部分的结构；(B)所述肽部分的所述结构；和(C)所述亲和力、选择性和活性值。
为了帮助阅读所述表格，要注意到以下内容：
表1A：
如果R2是H并且R3是CH3，则带有R2和R3的碳原子具有S-构型。
如果R2是CH3并且R3是H，则带有R2和R3的碳原子具有R-构型。
如果R2是H并且R3是CH2-S-Ph，则带有R2和R3的碳原子具有S-构型。
如果R4是H且R5是C(O)-NH-叔丁基，则带有R4和R5的碳原子具有S-构型。
如果R4是C(O)-NH-叔丁基并且R5是H，则带有R4和R5的碳原子具有R-构型。
如果R1和R2都是Pro-，则R1和R2取代基共价键连并形成Pro的所述吡咯烷环。
表1B：
如果R6和R7均为Pro，则所述R6和R7取代基共价键连并形成Pro的所述吡咯烷环。
如果R6和R8均为dPro，则所述R6和R8取代基共价键连并形成dPro的所述吡咯烷环。
如果R6和R7都是[(4S)-氟-Pro]，则所述R6和R7取代基共价键连并形成[(4S)-氟-Pro]的所述吡咯烷环。
如果R7是Nva并且R8是H，则带有R7和R8的碳原子具有S-构型。
如果R6和R7均为Hyp，则所述R6和R7取代基共价键连并形成Hyp的所述吡咯烷环。
如果Xz栏下没有条目，则不存在所述残基。
表1C：
如果任何所述栏下不存在条目，则没有收集数据。
表2显示了展示出较低α4β7整联蛋白亲和力、选择性和/或活性的化合物；和特别是关于这些化合物：(A)连接基部分的结构；(B)肽部分的结构；和(C)亲和力、选择性和活性值。
为了帮助阅读所述表格，要注意以下内容：
表2A：
如果R2是H并且R3是CH3，则带有R2和R3的碳原子具有S-构型。
如果R2是CH3并且R3是H，则带有R2和R3的碳原子具有R-构型。
如果R4是H且R5是C(O)-NH-叔丁基，则带有R4和R5的碳原子具有S-构型。
如果R4是C(O)-NH-叔丁基并且R5是H，则带有R4和R5的碳原子具有R-构型。
如果R1和R2都是Pro-，则所述R1和R2取代基共价键连并形成Pro的所述吡咯烷环。
表2B：
如果R6和R7均为Pro，则R6和R7取代基共价键连并形成Pro的所述吡咯烷环。
如果R6和R8均为dPro，则R6和R8取代基共价键连并形成dPro的所述吡咯烷环。
如果Xz栏下没有条目，则不存在所述残基。
表2C：
如果任何所述栏下不存在条目，则没有收集数据。
表S1是将本文所述化合物与所述方法和材料中概述的所述合成方案关联的对应表。
具体实施方式
在以下描述中，阐述了许多具体细节而提供对本发明的透彻理解。然而，应该理解的是，本发明可以在没有这些具体细节的情况下进行实施。
在一方面中，提供了式(I)的化合物：
Figure GDA0001732709360000071
其中，
R1是H；低级烷基；芳基；杂芳基；烯基；或杂环；它们全部在一个或多个可取代的位置上被一个或多个合适的取代基可选取代；
R2和R3各自独立地是蛋白源性或非蛋白源性α-氨基酸的氨基酸链，
条件是R2和R3可以彼此共价连接而形成环；
R4和R5各自独立地为H；低级烷基；芳基；杂芳基；烯基；杂环；式-C(O)OH的酸；式-C(O)OR*的酯，其中R*选自烷基和芳基；式-C(O)NR**R***的酰胺，其中R**和R***独立地选自H，烷基和芳基；-CH2C(O)R，其中R选自-OH，低级烷基，芳基，-低级烷基-芳基，或-NRaRb，其中Ra和Rb独立地选自H，低级烷基，芳基或-低级烷基-芳基；或-C(O)Rc，其中Rc选自低级烷基，芳基或-低级烷基-芳基；或-低级烷基-ORd，其中Rd是合适的保护基或OH基；它们全部在一个或多个可取代的位置上被一个或多个合适的取代基可选取代；
条件是R2或R3可以与R1共价连接而形成环状仲胺，和/或共价连接R4或R5形成环，R4和R5也可以彼此共价连接而形成环；
R6是H，低级烷基，苄基，烯基，低级烷氧基；芳基；杂芳基；杂环；-C(O)R****，其中R****独立地选自烷基，芳基，杂芳基，氨基，氨基烷基，氨基芳基，氨基杂芳基，烷氧基，芳氧基，杂芳氧基；-CH2C(O)R；或-C(O)Rc；它们全部在一个或多个可取代的位置上被一个或多个合适的取代基可选取代，
或与R7或R8一起形成蛋白源性或非蛋白源性氨基酸的环状侧链，其所述N-端是N-R6，其中蛋白源性或非蛋白源性氨基酸能够用合适的取代基取代；
R7和R8独立地选自其N-末端为N-R6的蛋白源性或非蛋白源性α氨基酸的所述氨基酸侧链，或可以与R6形成环状侧链；
立体中心1*、2*和3*各自独立地选自R和S；
n为1、2、3或4，并且当n为2～4时，每个R7和每个R8彼此独立；和
其中Z是氨基酸的氨基端；毗邻L的-C＝O-是氨基酸的羧基端；并且L连同Z和-C＝O-一起是具有以下式的肽：
Xy–Xz–X1–X2–X3
其中Xy和Xz各自独立地为蛋白源性或非蛋白源性的氨基酸；
X1是亮氨酸或叔丁基-Ala；
X2是Asp；和
X3是列于表1B的X3栏之下的任何氨基酸。
表1A、1B和1C中所示的所述化合物表现出对α4β7整联蛋白的拮抗活性，并且对α4β1整联蛋白具有选择性。本领域技术人员将会预期，关于不同化合物在表1A和1B中概述的取代基R1～R8和氨基酸Xy、Xz、X1、X2和X3能够以任何方式进行组合，并将会很可能导致产生将会表现出α4β7整联蛋白活性和选择性的化合物。
正如本文所用，所述术语“氨基酸”是指含有胺基团、羧酸基团和可变侧链的分子。氨基酸是指不仅包括蛋白中常见的所述20种氨基酸，而且包括本领域技术人员已知的非标准氨基酸和非天然氨基酸衍生物，因此包括，但不限于，α、β和γ氨基酸。肽是至少两个氨基酸的聚合物并可以包括标准的、非标准的和非天然的氨基酸。肽是两个或更多个氨基酸的聚合物。
本文中使用了以下缩写：
Figure GDA0001732709360000091
Figure GDA0001732709360000101
Figure GDA0001732709360000111
Figure GDA0001732709360000121
在本发明的上下文中使用的所述术语“合适的取代基”是指独立地包括H；羟基；氰基；烷基，如低级烷基，如甲基，乙基，丙基，正丁基，叔丁基，己基等；烷氧基如低级烷氧基，如甲氧基，乙氧基等；芳氧基，如苯氧基等；乙烯基；烯基，如己烯基等；炔基；甲酰基；卤代烷基，如包括CF3、CCl3等的低级卤代烷基；卤化物；芳基，如苯基和萘基；杂芳基，如噻吩基(thienyl)和呋喃基等；酰胺如C(O)NRaRb，其中Ra和Rb独立地选自低级烷基，芳基或苄基等；酰基如C(O)-C6H5等；酯如-C(O)OCH3等；醚和硫醚，如O-Bn等；硫代烷氧基；膦基；和-NRaRb，其中Ra和Rb独立地选自低级烷基，芳基或苄基等。应该理解的是，在本发明的上下文中使用的合适取代基是指不干扰通过本发明的方法形成所需产物的取代基。
正如在本发明的上下文中使用的，单独或与另一个取代基组合使用的所述术语“低级烷基”是指含有一至六个碳的非环状的直链或支链烷基取代基，并包括，例如，甲基，乙基，1-甲基乙基，1-甲基丙基，2-甲基丙基等。所述术语的类似应用应该理解针对关于碳原子数目的“低级烷氧基”，“低级硫代烷基”，“低级烯基”等。例如，正如本文所用的“低级烷氧基”包括甲氧基，乙氧基，叔丁氧基。
所述术语“烷基”涵盖低级烷基，并还包括具有多于六个碳原子的烷基，如，例如，具有七至十个碳原子的非环状直链或支链烷基取代基。
本文所用的所述术语“芳基”，无论是单独使用还是与其他取代基组合使用，都是指芳族单环体系或芳族多环体系。例如，所述术语“芳基”包括苯基或萘基环，并还可以包括更大的芳族多环体系，如荧光(例如，蒽)或放射标记及其衍生物。
正如本文所用，所述术语“杂芳基”，无论单独或与另一取代基组合，都意指含有1～4个选自氮，氧和硫的杂原子并形成芳族体系的5、6或7元不饱和杂环。所述术语“杂芳基”还包括包含含有1～4个选自氮，氧和硫的杂原子的5、6或7元不饱和杂环的多环芳族体系。
正如本文所用，所述术语“环烷基”，无论单独或与另一取代基组合，意指包括，例如，但不限于，环丙基，环丁基，环戊基，环己基和环庚基的环烷基取代基。
正如本文所用的所述术语“环烷基-烷基-”是指环烷基直接与其相连的烷基；并且包括，但不限于，环丙基甲基，环丁基甲基，环戊基甲基，1-环戊基乙基，2-环戊基乙基，环己基甲基，1-环己基乙基和2-环己基乙基。对于如本文所使用的芳基-烷基-，芳基-低级烷基-(例如，苄基)，-低级烷基-烯基(例如，烯丙基)，杂芳基-烷基-等，应该理解所述“烷基”或“低级烷基”术语的类似使用。例如，所述术语“芳基-烷基-”是指芳基与其键合的烷基。芳基-烷基的实例包括，但不限于，苄基(苯甲基)，1-苯乙基，2-苯乙基和苯丙基。
正如本文所用，所述术语“杂环”，单独或与另一基团组合，是指通过从含有一至四个选自氮、氧和硫的杂原子的三至七元饱和或不饱和(包括芳族)环状化合物中除去氢而衍生的单价基团。这种杂环的实例包括，但不限于，氮丙啶(aziridine)，环氧化物，氮杂环丁烷，吡咯烷，四氢呋喃，噻唑烷，吡咯，噻吩，乙内酰脲(hydantoin)，二氮杂环庚烷(diazepine)，咪唑，异噁唑，噻唑，四唑，哌啶，哌嗪，高哌啶，高哌嗪，1,4-二噁烷，4-吗啉，4-硫代吗啉，吡啶，吡啶-N-氧化物或嘧啶等。
正如本文所用，所述术语“烯基”，单独或与另一基团组合，意在表示含有两个或更多个碳原子的不饱和非环状直链基团，其中至少两个彼此通过双键键连。这种基团的实例包括，但不限于，乙烯基(ethenyl)(乙烯基(vinyl))，1-丙烯基，2-丙烯基和1-丁烯基。
本文中使用的所述术语“炔基”是指含有两个或更多个碳原子的不饱和非环状直链基团，其中至少两个碳原子通过三键相互键连。这种基团的实例包括，但不限于，乙炔基，1-丙炔基，2-丙炔基和1-丁炔基。
正如本文所用，所述术语“烷氧基”，单独或与另一基团组合，意指其中烷基如上所定义的含有1个或多个碳原子的基团-O-(C1-n)烷基，并且包括，例如，甲氧基，乙氧基，丙氧基，1-甲基乙氧基，丁氧基和1,1-二甲基乙氧基。当n为1～6时，如上所述的所述术语“低级烷氧基”是适用的，而所述术语“烷氧基”包括“低级烷氧基”以及其中n大于6的烷氧基(例如，n＝7～10)。本文单独或与另一基团组合使用的所述术语“芳氧基”是指-O-芳基，其中所述芳基如上所述定义。
保护基或保护性基团是引入分子中以在随后的化学反应中获得化学选择性的取代基。本领域中已知有许多保护基团，并且技术人员将会理解将会引入并能够结合本文所述方法使用的保护基团种类。在“基于保护基的肽合成(protecting group based peptidesynthesis)”中，通常为固相肽合成，通过逐步将氨基酸部分添加至建造肽链而制备所需的肽。在固相合成中两种最广泛使用的方案会使用叔丁氧基羰基(Boc)或9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)作为氨基保护基。氨基保护基团通常会在合成过程期间保护氨基免于发生非所需的反应并随后能够除去而显露出所述胺。在文献Greene，T.W.et al.，Protective Groups inOrganic Synthesis，第3版，JohnWiley&Sons(1999)中公开了常用的氨基保护基团。氨基保护基团包括酰基如甲酰基，乙酰基，丙酰基，新戊酰基(pivaloyl)，叔丁基乙酰基，2-氯乙酰基，2-溴乙酰基，三氟乙酰基，三氯乙酰基，邻硝基苯氧基乙酰基，α-氯丁酰基，苯甲酰基，4-氯苯甲酰基，4-溴苯甲酰基，4-硝基苯甲酰基等；磺酰基如苯磺酰基，对甲苯磺酰基等；烷氧基-或芳氧基-羰基基团(其形成具有保护胺的聚氨酯)如苄氧基羰基(Cbz)，对氯苄氧基羰基，对甲氧基苄氧基羰基，对硝基苄氧基羰基，2-硝基苄氧基羰基，对溴苄氧基羰基，3,4-二甲氧基苄氧基羰基，3,5-二甲氧基苄氧基羰基，2,4-二甲氧基苄氧羰基，4-甲氧基苄氧基羰基，2-硝基-4,5-二甲氧苄氧羰基，3,4,5-三甲氧基苄氧基羰基，1-(对联苯基)-1-甲基乙氧基羰基，α-，α-二甲基-3,5-二甲氧基苄氧基羰基，二苯甲基氧基羰基(benzhydryloxycarbonyl)，叔丁氧基羰基(Boc)，二异丙基甲氧基羰基，异丙氧基羰基，乙氧基羰基，甲氧基羰基，烯丙氧基羰基(Alloc)，2,2,2-三氯乙氧基羰基，2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基(Teoc)，苯氧基羰基，4-硝基苯氧基羰基，芴基-9-甲氧基羰基(Fmoc)，环戊氧基羰基，金刚烷氧基羰基，环己氧基羰基，苯基硫代羰基等；芳烷基如苄基，三苯甲基，苄氧基甲基等；和甲硅烷基如三甲基甲硅烷基等。胺保护基基团还包括环状氨基保护基如苯二甲酰基和二硫代琥珀酰亚胺基，其将氨基氮引入杂环中。通常氨基保护基基团包括甲酰基，乙酰基，苯甲酰基，新戊酰基，叔丁基乙酰基，苯磺酰基，Alloc，Teoc，苄基，Fmoc，Boc和Cbz。选择和使用合适的氨基保护基(用于手边合成任务)是在普通技术人员的技能范围内的。
在一些实施方式中，R1是H。
在一些实施方式中，R2或R3与R1共价连接而形成具有NR1作为N-端的脯氨酸。
在一些实施方式中，R2和R3不都是H。
在一些实施方式中，R2和R3各自独立地选自由蛋白源性或非蛋白源性的α-氨基酸的氨基酸链组成的组中。
在一些实施方式中，R2和R3分别是H和CH3，反之亦然。
在一些实施方式中，R2或R3是-CH2-S-RS，其中Rs选自低级烷基；低级氨基烷基；芳基；杂芳基；烯基；或杂环；它们全部在一个或多个可取代的位置上被一个或多个合适的取代基可选取代；优选Rs是苯基或被低级烷基，卤素取代的苯基；或低级氨基烷基。
在一些实施方式中，R4和R5不都是H。
在一些实施方式中，R**和R***不都是H。
在一些实施方式中，R4和R5各自独立地为H或C(O)-NHRt，其中Rt为H或低级烷基。优选所述Rt是叔丁基或H。
在一些实施方式中，R6是H。
在一些实施方式中，R6和R8或R9形成环，导致产生具有N-R6作为其N-端的脯氨酸残基。
在一些实施方式中，n为1。
在一些实施方式中，Z与L和-C＝O一起是SEQ ID NO.1-380中任一种。
在一些实施方式中，X1是Leu。
在一些实施方式中，X2是Asp。
在一些实施方式中，X3是Thr。
在一些实施方式中，X3是Val。
在一些实施方式中，X3是Ile。
在一些实施方式中，Xy和Xz各自独立地为蛋白源性或非蛋白质性α-氨基酸。
在一些实施方式中，Xz是蛋白源性或非蛋白源性β-氨基酸。
在一些实施方式中，Xz是β-高Lys或甲基β-高Lys。
在一些实施方式中，Xy和Xz每一个是伯氨基酸。
在一些实施方式中，Xy和Xz各自分别是表1B的Xy栏和Xz栏中列出的任何氨基酸。
在各种实施方式中，所述化合物是化合物1-397中的任何一种。
在某些实施方式中，提供了本文所述化合物的药用盐。正如本文所用的所述术语“药用盐(pharmaceutically acceptable salt)”表示本发明的所述化合物的水或油溶性或可分散性的盐或两性离子形式，其适合治疗疾病而没有不当毒性、刺激和过敏反应；这与合理的收益/风险比相称，并对于其预期用途是有效的。所述盐能够在所述化合物的最终分离和纯化期间制备，或单独通过用合适的酸处理氨基而制备。代表性的酸加成盐包括乙酸盐，己二酸盐，藻酸盐，柠檬酸盐，天冬氨酸盐，苯甲酸盐，苯磺酸盐，硫酸氢盐，丁酸盐，樟脑酸盐(camphorate)，樟脑磺酸盐(camphorsulfonate)，二葡糖酸盐，甘油磷酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，甲酸盐，富马酸盐，盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，2-羟乙磺酸盐(羟乙基磺酸盐(isethionate))，乳酸盐，马来酸盐，均三甲苯磺酸盐(mesitylenesulfonate)，甲磺酸盐，萘磺酸盐，烟酸盐，2-萘磺酸盐，草酸盐，双羟萘酸盐(pamoate)，果胶酸盐(pectinate)，过硫酸盐，3-苯基丙酸盐，苦味酸盐(picrate)，特戊酸盐(pivalate)，丙酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，三氯乙酸盐，三氟乙酸盐，磷酸盐，谷氨酸盐，碳酸氢盐，对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。而且，本发明的所述化合物中的氨基能够用甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸盐；癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物；以及苄基和苯乙基溴化物进行季铵化。能够用于形成治疗可接受的加成盐的酸的实例包括无机酸如盐酸，氢溴酸，硫酸和磷酸，以及有机酸如草酸，马来酸，琥珀酸和柠檬酸。在某些实施方式中，本文所述的任何肽化合物都是盐形式，例如，乙酸盐。
在一方面中，提供了包含本文所述的化合物连同药用载体一起的药物组合物。所述药物组合物可以配制用于口服递送，局部递送和肠胃外递送中的任何一种。
正如本文所用，“药用载体(pharmaceutically acceptable carrier”)”是指生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药用载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，及其组合。在许多情况下，优选在所述组合物中包含等渗剂，例如，糖，多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。药用载体可以进一步包含少量辅助物质，如润湿剂或乳化剂，防腐剂或缓冲剂，其会增加药理学试剂的保质期或有效性。
在一方面中，提供了一种治疗患者中的炎症或自身免疫性疾病的方法，包括向所述患者给药治疗有效量的本文中描述的所述化合物。优选所述炎症或自身免疫性疾病是胃肠道疾病。
在一方面中，提供了一种用于治疗与α4β7整联蛋白的生物学功能相关的患者中病症的方法，所述方法包括向所述患者给药治疗有效量的本文中描述的所述化合物。
在一些实施方式中，所述病症或疾病是炎症性肠病(IBD)，溃疡性结肠炎，克罗恩氏病，腹腔疾病(Celiac disease)(非热性血管炎(nontropical Sprue))，与血清阴性关节病(seronegative arthropathies)相关的肠病，显微镜性结肠炎(microscopic colitis)，胶原性结肠炎，嗜酸细胞性胃肠炎(eosinophilic gastroenteritis)，放射疗法，化学疗法，直肠结肠切除术(proctocolectomy)和回肠吻合术(ileoanal anastomosis)后产生的囊袋炎(pouchitis)，胃肠癌，胰腺炎，胰岛素依赖性糖尿病，乳腺炎，胆囊炎(cholecystitis)，胆管炎(cholangitis)，胆管周围炎(pericholangitis)，慢性支气管炎，慢性鼻窦炎，哮喘，原发硬化性胆管炎，胃肠道中人免疫缺陷病毒(HIV)感染，嗜酸性粒细胞性哮喘(eosinophilic asthma)，嗜酸性粒细胞性食管炎(eosinophilic esophagitis)，胃炎，结肠炎，显微镜性结肠炎，移植物抗宿主病，与放射或化疗有关的结肠炎，与先天免疫性疾病如白细胞粘附缺陷-1相关的结肠炎，慢性肉芽肿病(chronic granulomatousdisease)，糖原贮积病1b型，Hermansky-Pudlak综合征，Chediak-Higashi综合征和Wiskott-Aldrich综合征，或直肠结肠切除术和回肠吻合术之后导致的囊袋炎和各种形式的胃肠癌、骨质疏松症、关节炎、多发性硬化症、慢性疼痛、体重增加和抑郁症。在另一个实施方式中，所述病症是胰腺炎，胰岛素依赖性糖尿病，乳腺炎，胆囊炎，胆管炎，胆管周围炎，慢性支气管炎，慢性鼻窦炎，哮喘或移植物抗宿主病。
在优选的实施方式中，所述病症是炎症性肠病，如溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。
在一方面中，提供了一种治疗患者中的疾病或病症的方法，包括向所述患者给药治疗有效量的本文描述的所述化合物，其中所述疾病或病症是病毒或逆转录病毒的局部或全身性感染。
在一些实施方式中，所述病毒或逆转录病毒是艾柯病毒(echovirus)1和8，艾柯病毒9/巴蒂株(Barty Strain)，人乳头瘤病毒，汉坦病毒(hantaviruses)，轮状病毒(rotaviruses)，腺病毒，口蹄疫病毒，柯萨奇病毒(coxsackievirus)A9，人类帕瑞克病毒(human parechovirus)1或人免疫缺陷病毒1型。
在一方面中，提供了一种治疗患者中的疾病或病症的方法，包括向所述患者给药治疗有效量的本文中描述的所述化合物，其中肝炎A、B或C，肝性脑病，非酒精性脂肪肝炎，肝硬化(cirrhosis)，静脉曲张出血(variceal bleeding)，血色病，威尔逊病，酪氨酸血症，α-1-抗胰蛋白酶缺乏症，糖原贮积病，肝细胞癌，肝癌，原发性胆管炎，原发硬化性胆管炎，原发性胆管硬化症，胆道疾病，自身免疫性肝炎或移植物抗宿主病。
在一些实施方式中，所述化合物会抑制α4β7整联蛋白与MAdCAM的结合。优选所述化合物选择性地抑制α4β7整联蛋白与MAdCAM的结合。
在任何实施方式中，所述患者优选是人。
正如本文所用，所述术语“疾病”，“失调”和“病症”可以互换使用。
正如本文所用，“抑制”，“治疗”，“处理”和“缓解”可以互换使用，并且是指，例如，症状停滞，存活延长，症状部分或全部缓解，以及部分或完全根除受试者，例如，哺乳动物中的病症，疾病或失调。
正如本文所用，“预防”或“防治”包括(i)预防或抑制受试者，例如，哺乳动物中发生的疾病、损伤或病症，具体而言，当这种受试者易患所述病症但尚未被诊断出患有此病时；或(ii)降低所述受试者中将会发生疾病、损伤或病症的可能性。
正如本文所用，“治疗有效量(therapeutically effective amount)”是指在剂量上和特定时间段内实现所需治疗效果所需的有效用量。药理学试剂的治疗有效量可以根据诸如所述个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及药理学试剂在所述个体中引起所需的反应的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中药理学试剂的任何毒性或有害作用超过治疗有益效果的量。
在一些实施方式中，所述化合物通过选自由口服，静脉内，腹膜内，皮内，皮下，肌内，鞘内，吸入，汽化，雾化，舌下，口腔，肠胃外，直肠，阴道和局部组成的组中的给药形式进行给药。
在一些实施方式中，所述化合物以初始剂量给药，然后给药一次或多次后续剂量，并且任何两次剂量之间的最小间隔小于1天，并且其中每个剂量都包含有效量的所述化合物。
在一些实施方式中，所述化合物的有效量是足以实现选自由以下条目组成的组中的以下至少之一的所述用量：a)α4β7整联蛋白分子上MAdCAM结合位点的约50％或更高的饱和；b)细胞表面上α4β7整联蛋白表达约50％或更高的抑制；和c)α4β7分子上MAdCAM结合位点的约50％或更高的饱和和所述细胞表面上α4β7整联蛋白表达的约50％或更高的抑制，其中i)所述饱和维持与每天不超过两次的剂量频率一致的一段时间；ii)所述抑制维持与每天不超过两次的剂量频率一致的一段时间；或iii)所述饱和和所述抑制各维持与每天不超过两次的剂量频率一致的一段时间。
在一些实施方式中，所述化合物以选自由以下组成的组中的间隔进行给药：全天(around the clock)，每小时，每四小时，每天一次，每天两次，每天三次，每天四次，每隔一天，每周，每两周和每月。
以下实施例进一步举例说明本发明的优点。本文中提出的所述实例及其具体细节仅仅是为了举例说明之目的而提出，而不应该解释为对本发明的所述权利要求的限制。
实施例
方法和材料
合成
适于制备本文中描述的所述环肽的方法通常能够见于本申请人的PCT公开号WO2010/105363和在同一天提交的标题为“Fragment Synthesis of Cyclic Peptides”(代理人案卷号No.55813832-6PCT)并要求享有2015年11月11日提交的美国临时申请No.62/254003共同优先权的专利申请。
更具体而言，以下方案用于合成如表S1中所示的每种化合物。
方案A：通用整肠蛋白合成
1.树脂的制备：将Fmoc氨基酸(1.1当量，相对于树脂)溶于CH2Cl2(10mL/g树脂)中。如果所述氨基酸不能完全溶解，则缓慢滴加DMF，直到搅拌/超声处理后均匀的混合物持续存在。使所述2-氯三苯甲基树脂在CH2Cl2中溶胀(5mL/g的树脂)15分钟。然后排干CH2Cl2并将Fmoc氨基酸溶液加入到含有2-Cl Trt树脂的所述容器中。加入DIPEA(2当量，相对于氨基酸)并搅拌所述容器5分钟。然后加入另外2当量DIPEA，并将所述容器再搅拌60分钟。然后用甲醇(1mL/g的树脂)处理所述树脂而对任何剩余的反应性2-Cl Trt基团封端。将所述溶液混合15分钟，排干，然后用CH2Cl2(×3)，DMF(×3)，CH2Cl2(×2)和MeOH(×3)冲洗。然后将所述树脂真空干燥并称重而确定Fmoc氨基酸的估计负载量。
2.通过手工或自动合成制备直链肽序列：手动或使用自动化肽合成仪通过标准Fmoc固相肽化学合成完全受保护的树脂结合肽。所有N-Fmoc氨基酸都被使用。
a.Fmoc脱保护：将所述树脂用20％的哌啶NMP溶液处理两次分别为5分钟和10分钟，每次添加后进行连续DMF和NMP洗涤。
b.Fmoc氨基酸偶联：所述树脂用3当量Fmoc氨基酸，3当量HATU和6当量DIPEA的NMP溶液处理60分钟。对于困难的偶联，使用3当量Fmoc氨基酸，3当量HATU和6当量DIPEA的NMP溶液进行第二处理40分钟。
3.保留保护基团的通用切裂法：一旦合成了所需的直链序列，所述树脂用1)1:3的HFIP:CH2Cl2或2)5％TFA的CH2Cl2溶液处理两次，每次30分钟，以提供从所述固体载体上的切裂。然后除去所述溶剂，接着用冷却的叔丁基甲基醚(或乙醚/己烷)研磨两次，而获得所需产物。然后通过反相LCMS分析所述纯度。
方案B：制备N-烷基化的Fmoc氨基酸构件(building block)
1.树脂制备：参见方案A，步骤1
2.Fmoc脱保护：参见方案A，步骤2a
3.Nosyl保护：将所述脱保护的树脂在CH2Cl2(5mL/mmol的树脂)和DIPEA(6.5当量)中搅拌。在30分钟内缓慢逐滴加入硝基苯磺酰氯(Nosyl chloride)(4.0当量)的溶液，而避免快速放热反应。所述添加完成后，在室温下继续搅拌3小时。过滤所述获得的硝基苯磺酰基(nosyl)保护的树脂，并用CH2Cl2、MeOH、CH2Cl2和THF洗涤。
4.N-甲基化：向所述树脂在THF(10mL/mmol的树脂)中的悬浮液中加入三苯基膦(5当量)在THF(2M)和MeOH(10当量)中的溶液。所述搅拌的悬浮液在冰浴中冷却。通过加料漏斗滴加DIAD(5当量)在THF(1M)中的溶液。所述添加完成后，除去所述冰浴，并将所述反应在室温下再搅拌90分钟。过滤所述树脂，用THF(×4)，CH2Cl2(×3)和THF(×2)洗涤。
5.Nosyl-脱保护：向所述树脂在NMP(10mL/mmol的树脂)中的悬浮液中加入2-巯基乙醇(10.1当量)和DBU(5.0当量)。所述溶液变成深绿色。五分钟后，过滤所述树脂，用DMF洗涤至冲洗液无色。所述过程重复第二次，然后用CH2Cl2最后一次洗涤所述树脂。
6.Fmoc保护：向树脂在CH2Cl2中的悬浮液(7mL/mmol的树脂)中加入Fmoc-Cl(4当量)在CH2Cl2(7mL)和DIPEA(6.1当量)中的溶液。将所述悬浮液在室温下搅拌4小时，然后过滤并用CH2Cl2(×2)，MeOH(×2)，CH2Cl2(×2)和Et2O(×2)洗涤。
7.从树脂上切裂：参见方案A，步骤3
方案C：还原性胺化
1.Fmoc Weinreb酰胺形成：将在CH2Cl2(6.5mL)中的Fmoc氨基酸(1mmol)，N,O-二甲基羟胺·HCl(1.2当量)和HCTU(1.2当量)的混合物冷却至0℃。然后将DIPEA(3当量)缓慢加入到所述搅拌的混合物中。除去所述冷却浴并将所述反应在室温下搅拌16小时。加入10％HCl(4mL)溶液，导致形成沉淀，通过过滤除去所述沉淀。所述滤液用10％HCl(3×4mL)和盐水(2×4mL)洗涤。然后将所述有机相用Na2SO4干燥。减压除去所述溶剂，而获得粗FmocWeinreb酰胺，其无需纯化即用于下一步反应。
2.Fmoc氨基醛形成：将氢化铝锂粉末(3当量)置于干燥烧瓶中。加入THF(Sigma-Aldrich，250ppm BHT，ACS试剂>99.0％，6.5mL)，并将所获得的浆液在搅拌下冷却至-78℃。向所述浆液中加入所述Fmoc Weinreb酰胺的THF(10mL)溶液。将所述反应容器转移到冰/水浴中，并保持于0℃下1小时。在0℃向所述反应中滴加丙酮(1.5mL)，然后加入H2O(0.25mL)，并随后将所述反应在室温下再搅拌1小时。通过硅藻土(Celite)过滤所述混合物，用EtOAc(10mL)和MeOH(10mL)洗涤，并浓缩所述滤液。将所述粗物质溶于CHCl3(6.5mL)中并用盐水(2×3mL)洗涤，然后将所述有机相用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，而获得所述Fmoc氨基醛。
3.树脂上还原性胺化：将所述树脂上的直链肽置于固相肽合成反应容器中并用DMF(22mL/g的树脂)稀释。加入所述Fmoc醛(4.0当量)并将所述反应摇动过夜。然后排干所述溶液，所述树脂用CH2Cl2(×3)和DMF(×3)洗涤。然后用MeOH/CH2Cl2(22mL/g的树脂，1:3比例)的混合物稀释所述树脂，并随后加入NaBH4(7当量)。保持所述混合物摇动4小时，然后排干所述溶液，所述树脂用CH2Cl2(×3)和DMF(×3)洗涤。
方案D：基于片段的大环化
在2-dram小瓶(two-dram vial)中，将0.1mmol所述直链肽和DEPBT(1.5当量)溶于5mL新蒸THF(0.02M)中。然后加入DIPEA(3当量)，并将所述反应混合物在室温下搅拌过夜(16小时)。然后将四烷基碳酸铵树脂(6当量)加入到所述反应混合物中并再搅拌24小时。然后通过固相萃取容器过滤所述反应并用CH2Cl2(2mL)冲洗。将所述滤液和冲洗液合并，减压除去所述溶剂。
方案E：基于氮丙啶醛的大环化(Aziridine aldehyde-based macrocyclization)
将所述直链肽溶于TFE中(如果遇到溶解度问题，则使用TFE:CH2Cl2的50:50混合物进行所述环化)。然后0.6当量(S)-氮丙啶-2-甲醛二聚体((S)-aziridine-2-carboxaldehyde dimer)(根据文献方案制备：J.Am.Chem.Soc.2006,128(46)，14772-14773和Nat.Protoc.2010,5(11)，1813-1822)作为TFE原液(0.2M)加入，得到0.1M的最终反应混合物浓度。然后加入叔丁基异氰化物(1.2当量)并将所述反应混合物搅拌4小时。通过LC-MS沿着该路线(along the way)分析进展。
方案F：大环化后酰基氮丙啶的亲核开环
a.)硫代乙酸/硫代苯甲酸：将硫代酸(4当量)加入到所述粗反应混合物中。通过LC-MS监测反应进程，并通常在1～2小时后完成。
或可替代地，b.)硫代苯酚：将苯硫酚(4当量)和DIPEA(4当量)加入到粗环化混合物中。通过LC-MS监测反应进程，并且通常在1～2小时后完成。减压除去所述溶剂并在真空下干燥。粗物质或用Et2O/己烷或者TBME研磨，或可替代地用H2O稀释，冷冻并且冻干。
方案G：大环化后的通用Suzuki偶联
将含碘代-Phe大环化合物(0.1mmol)，Na2CO3(2当量)，取代硼酸(1.1当量)和4mL水:乙腈(1:1比率)合并于微波小瓶中。通过N2流使所述混合物脱气10分钟。在N2下，加入基于硅的Pd-催化剂(Siliacat-DPPPd非均相催化剂，0.05当量)。将所述反应小瓶密封，并在150℃下放入所述微波炉中10分钟。通过LCMS监测反应进程。一旦完成，所述反应通过硅藻土塞子过滤并减压除去所述溶剂。
方案H：大环化后的通用乌尔曼(Ulmann)偶联
在惰性气氛下，将所述肽大环化合物(0.018mmol)置于含有2mL无水CH2Cl2的2-dram小瓶中。然后将Cu(Oac)2(1当量)，苯硼酸(2当量)和
Figure GDA0001732709360000231
(烘箱干燥)分子筛加入所述小瓶中，然后加入DIPEA(4当量)。将所述小瓶的内容物在室温下搅拌过夜。通过LCMS评价所述反应进程。一旦确认反应完成，将所述混合物通过硅藻土塞子过滤并减压除去所述溶剂。
方案I：通用整体脱保护和切裂
通过将所述肽溶解于2mL由TFA:H2O:TIS(95:2.5:2.5)组成的切裂混合物中长达2小时而实现所述侧链保护基团的脱保护。随后，在减压下蒸发所述切裂混合物，并将所述肽从冷乙醚/己烷(或叔丁基甲基醚)中沉淀两次。
方案J：还原性不稳定保护基的通用切裂
a.)Pd/C和甲酸脱苄基化：所述苄基保护的大环化合物(0.35mmol)溶于含有10％甲酸、50wt％的Pd/C(1mg)的MeOH(8mL)中。并加热至55℃。一旦确认反应完成，将所述混合物通过硅藻土塞子过滤，用MeOH洗涤并在减压下除去所述溶剂。
或可替代地，b.)兰尼(Raney)镍脱硫/脱苄：将兰尼镍浆液(1～2mL)直接加入到所述环化反应混合物中并剧烈搅拌过夜。然后将所述小瓶离心，并使用移液管将所述液体转移到配衡小瓶(tared vial)中。将MeOH加入到含兰尼镍的小瓶中。然后将所述小瓶超声处理，涡旋并离心。再一次，将所述液体转移到配衡小瓶中。用EtOAc重复这个过程，然后用MeOH重复最后一次。然后在减压下除去所述合并的洗涤液并将残余物真空干燥。
方案K：大环化后侧链酰胺化
将所述大环化合物(0.021mmol)溶于1mL CH3CN中。然后加入K2CO3(5当量)和酰氯(2当量)，并将所述反应混合物在室温下搅拌过夜。早晨通过LC-MS检查反应进程。一旦完成，通过减压除去所述溶剂。
方案L：荧光染料附着
将所述大环化合物(4μmol)溶于DMSO(200μL)中。然后加入DIPEA(5当量)。在单独的小瓶中，将5mg作为所述NHS酯的荧光染料溶解于200μL DMSO中。然后将所述大环化合物溶液加入到所述荧光标记的所述溶液中。将所述反应混合物搅拌过夜。早晨通过LC-MS检查反应进程，然后通过冻干去除所述溶剂。
方案M：纯化方法
使用30g RediSep C18金柱，使用反相快速柱色谱法纯化所有大环化合物。所述梯度由流速为35mL/min的洗脱剂A(0.1％甲酸，在双蒸馏水中)和B(0.1％甲酸，在HPLC级乙腈中)构成。
整联蛋白α4β7-MAdCAM-1竞争分析实验
用每孔100ml溶液(1ug/ml重组整联蛋白α4β7(R&D Systems,5397-A3-050)，在碳酸盐缓冲液中(50mM,pH 9.6))涂覆96孔Microlon 200板(Greiner,655001)。在4℃下孵育孔板过夜。移开溶液并且每孔添加250ul封闭缓冲液(50mM Tris,150mM NaCl,1mM MnCl2,1％牛血清白蛋白(BSA),0,05％Tween)。然后在室温下孵育孔板1小时。孔板用洗涤缓冲液(50mM Tris,100mM NaCl,1mM MnCl2,0,05％Tween)冲洗三次。通过从化合物系列稀释板转移向每个孔添加在测试缓冲液中稀释的50ul化合物。向每个孔添加50ul重组MAdCAM–FC(R&D systems,6056-MC-050)，在测试缓冲液(50mM Tris,150mM NaCl,1mM MnCl2,0,1％BSA,0,05％Tween)中浓度为1mg/ml。在室温下在摇动下孵育孔板2hr以达到结合平衡。然后，孔板用洗涤缓冲液冲洗三次，并且向每孔添加100ul抗-人IgGFc特异性辣根过氧化酶(HRP)(Abcam,Ab97225)(在测试缓冲液中1:2000稀释)。在搅动下将孔板在室温下孵育1hr。然后将孔板洗涤3次，并且然后向每孔添加100ul 1,3’,5,5’-四甲基联苯胺(1,3’,5,5’-tetramethylbenxidie)(TMB)。通过添加50ul 1M H2SO2在2分钟孵育之后停止反应，并且在450nM下读取吸光度。
整联蛋白α4β1-VCAM-1竞争分析实验
用每孔100ml溶液(0.5ug/ml重组整联蛋白α4β1(R&D Systems,5397-A3-050)，在碳酸盐缓冲液中(50mM,pH 9.6))涂覆96孔Microlon 200板(Greiner,655001)。在4℃下孵育孔板过夜。移开溶液并且每孔添加250ul封闭缓冲液(50mM Tris,150mM NaCl,1mMMnCl2,1％牛血清白蛋白(BSA),0,05％Tween)。然后在室温下孵育孔板1小时。孔板用洗涤缓冲液(50mM Tris,100mM NaCl,1mM MnCl2,0,05％Tween)冲洗三次。通过从化合物系列稀释板转移向每个孔添加在测试缓冲液中稀释的50ul化合物。向每个孔添加50ul重组VCAM–FC(R&D systems,862-VC-100)，在测试缓冲液(50mM Tris,150mM NaCl,1mM MnCl2,0,1％BSA,0,05％Tween)中浓度为1mg/ml。在室温下在摇动下孵育孔板2hr以达到结合平衡。然后，孔板用洗涤缓冲液冲洗三次，并且向每孔添加100ul抗-人IgG Fc特异性HRP(Abcam,Ab97225)(在测试缓冲液中1:2000稀释)。在搅动下将孔板在室温下孵育1hr。然后将孔板洗涤3次，并且然后向每孔添加100ul1,3’,5,5’-TMB。通过添加50ul 1M H2SO2在2分钟孵育之后停止反应，并且在450nM下读取吸光度。
RPMI8866细胞粘附竞争分析实验
在补充有10％胎牛血清(FBS)(Wisent,081-105)和1％青霉素-链霉素的RPMI1640培养基(Wisent,350-000-CL)中培养RPMI8866人细胞(Sigma#95041316)，并且用100ml/孔的重组人MAdCAM-1Fc Chimera(R&D Systems,6056-MC-050)溶液(0.25mg/ml，在涂覆缓冲液中(50mM碳酸钠,pH 9.6))涂覆MaxiSorp板(Nunc,442404)。孔板在4℃下孵育过夜并且用150ul每孔洗涤缓冲液(0.05％Tween 20，在磷酸盐缓冲盐水中(PBS))洗涤两次，用250ul每孔封闭缓冲液(1％脱脂奶粉(non-fat dry milk)，在PBS中)封闭，并且在室温下孵育1hr。将RPMI8866细胞以10百万细胞/ml重悬浮于包含5mM钙黄绿素(calcein)的PBS中，并且中50ml管中在37℃下孵育30min。添加PBS以填充管，将细胞旋下并且重悬浮于RPMI1640培养基中至2百万/ml。通过系列稀释将化合物稀释于结合缓冲液中(1.5mM CaCl2,0.5mM MnCl2,50mM Tris-HCl,pH 7.5)至终浓度50ul每孔(在2x浓度下)。孔板用300ul PBS洗涤一次，将50ul化合物和50ul细胞(100,000细胞)转移至每个孔并且在37℃,5％CO2下在黑暗中孵育孔板45min以允许细胞粘附。通过倒置并在纸巾上吸干(blotting)将孔板排空并且用PBS手动洗涤2次。然后将100ul PBS添加至每孔。使用FITC 96底部读数，在BiotekNeo仪器上读取平板。为了计算剂量响应(dose response)，从每个测试孔减去不含细胞的对照孔的荧光值。
缓冲液
涂层缓冲液(50mM碳酸盐)
将420mg碳酸氢钠溶于100mL水中(Soln 1)。将270mb碳酸钠溶于50mL水中(Soln2)。将Soln 2加入到Soln 1中，使pH为9.6
清洗缓冲液
0.05％吐温20的PBS溶液
封闭缓冲液
1％脱脂干奶(Nonfat Dry Milk)的PBS溶液
结合缓冲液
1.5mM CaCl2
0.5mM MnCl2
50mM Tris-HCl，用HCl将pH调节至7.5
血浆蛋白结合测定
使用平衡透析(HTDialysis)方法，采用了从CD-1小鼠或Sprague-Dawley大鼠收集的50％血浆并与K2EDTA一起孵育。在3次重复中以1μM浓度评价测试制品。使用LC/MS/MS评价5小时孵育时间，血浆和缓冲液标准。百分回收率计算为(C缓冲液+C血浆)/[平均值]C初始，[平均值]C初始从透析之前的所述测试样品一式三份进行测定。未结合化合物的百分比计算为C缓冲液/C血浆。
水溶性分析测试
通过在pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水中使用1、0.5或0.2mM(最大)测试化合物测定水溶性。将溶液在室温下孵育4小时并以600rpm搅拌并一式三份运行。在6000rpm下离心15分钟，并使用HPLC-UV(光电二极管阵列检测器在220nm和300nm波长之间采集)测定溶液浓度。
细胞色素P450抑制分析测试
使用人类肝微粒体(microsome)(以0.25mg/mL，除了CYP1A2，其中使用0.5mg/mL的浓度)评价测试化合物对细胞色素P450(“CYP”)的四种亚型：CYP2D6，CYP3A4，CYP2C9和CYP1A2的活性的所述IC50(一式两份；浓度范围0.25nM～15μM)。使用以下底物：右美沙芬(dextromethorphan)(15μM，CYP2D6)，睾酮(testosterone)(50μM，CYP3A4)，双氯芬酸(diclofenac)(10μM，CYP2C9)和非那西丁(phenacetin)(100μM，CYP1A2)。对照抑制剂为奎尼丁(quinidine)(0.03nM～1.5μM，CYP2D6)，酮康唑(ketoconazole)(0.08nM～5μM，CYP3A4)，咪康唑(miconazole)(0.25nM～15μM，CYP2C9)和α-萘酚酮(naphoflavone)(0.03nM～1.5μM，CYP1A2)。孵育时间为10～20分钟，所评价的代谢物为右啡烷(dextrorphan)(CYP2D6)，6-β-OH-睾酮(6-beta-OH-testosterone)(CYP3A4)，4'-OH-双氯芬酸(4’-OH-diclofenac)(CYP2C9)和乙酰氨基酚(acetaminophen)(CYP1A2)。内标为拉贝洛尔(labetalol)(CYP2D6)，氯雷他定(loratidine)(CYP3A4)，卡马西平(carbamazepine)(CYP2C9)和美托洛尔(metoprolol)(CYP1A2)。使用标准LC/MS/MS方案进行分析。
体内T淋巴细胞运输分析
动物护理委员会。所雇用的动物护理机构由加拿大动物护理委员会(CanadianCouncil on Animal Care)(CCAC)授权。这项研究得到了认证的动物护理委员会的批准，并符合管理动物研究使用的CACC标准和规定。
动物。用于本研究的雌性C57Bl/6小鼠(Charles River，St-Constant，Qc)在递送(delivery)时体重为16～19g。到达所述动物设施后，所有动物都进行一般性健康评价。在研究开始之前允许7～14天的适应期。
安置环境。动物安置于标准化的环境条件下。将所述小鼠安置于自动通风笼中，每笼2～3只。每个笼子都配备了手动配水系统。标准认证的商业啮齿动物饮食随意提供。自来水在任何时候都随意提供。据认为，饮食和水中没有已知的污染物会干扰所述研究的目的。每个笼子都被确定为相应的组，表明所述笼子中安置的动物的处理和身份。来自不同处理组的小鼠没有混合。
动物房间维持于21.5±1℃的受控温度和40±10％的相对湿度。受控照明系统对于所述动物保证每天12小时光照，12小时黑暗。保持每小时8～10次换气的足够通风。
DSS的给药。通过以2％～3％加入其饮用水中而向C57B1/6小鼠给药葡聚糖硫酸钠(DSS)。小鼠在5天内随意接触DSS处理过的水。在第5天测量体重和疾病活性指数(diseaseactivity index)(“DAI”)，以便在给药之前以两个均匀组分配DSS-处理的动物。基于每种具体症状的严重程度对与结肠炎相关的特定症状进行评分：1-便血(阴性血液隐匿(hemoccult)，阳性血液隐匿，粪便中可见的血迹，直肠出血)；2-大便干稠(stoolconsistency)(正常，软但仍然成形，非常软，腹泻)；3-姿势和毛皮(正常；皱毛(ruffledfur)；皱褶毛结合轻微驼背姿势(hunched posture)和轻微脱水；皱毛结合驼背姿势，脱水和行走改变；濒死(动物达到此点前必须安乐死)。所述整体DAI评分是三个参数的总和(最高评分为9)。DAI评价仅在第5天进行(在给药之前)。
所述测试制品和载体的口服剂量。在第6天，根据通过管饲法(gavage)给药溶液的程序，在早晨通过口服途径给药所述测试制品，作为单次缓慢推注(single slow bolus)(经过约5秒)：所述动物被牢固地限制。将22G的带有球形尖端的胃饲针(bulb-tippedgastric gavage needle)通过口腔的侧面并朝向食道推进。所述测试制品和载体以10mL/kg口服给药。给药量根据每只动物的体重单独调整以达到所述目标剂量。
静脉剂量给药所述测试制品和载体。在第6天，根据通过静脉内给药溶液的给药程序，在早晨经由所述尾静脉以单次缓慢推注(single slow bolus injection)(经过约5秒)施用所述测试制品，DATK32抗体，和载体：给药前动物受到控制并将其尾部温热。使用30G的针以5mL/kg的剂量给药量(dosing volume)通过中间尾静脉注射所述测试制品，或载体。剂量给药量根据每只动物的体重分别调整以达到DATK32对照抗体的目标剂量。
样品的收集。在第6天，在测试制品或载体剂量给药后5小时，根据CCAC出版的“实验动物护理和使用指南(Guide to the Care and Use of Experimental Animals)”，在全身麻醉下通过心脏穿刺使动物安乐死。将血液转移到含有EDTA的Sarstedt管中。收集肠系膜和外周(腹股沟，附件和臂部)淋巴结，并将其在冰上转移到含有冷PBS的相应管中。将淋巴结保持于冰上，直到组织制备。
细胞群体标记。通过心脏穿刺取血并收集于EDTA涂覆的管上。还收集了肠系膜淋巴结(Mensenteric lymph nodes)(MLN)和外周淋巴结(peripheral lymph nodes)(PLN)。使用密度梯度(淋巴细胞)分离出来自所述组织的单核细胞，并用荧光抗体对其进行染色。首先将所述细胞(5×104)与BD小鼠FcBlock(FcγIII/II受体)孵育15min，然后用特异性抗体孵育30min。洗涤后，使用BD固定溶液(Fix Solution)固定细胞。
使用的特异性抗体：
抗体 公司 目录号
CD3 FITC BD Biosciences 555274
CD4 APC BD Biosciences 553051
CD11a PE BD Biosciences 553121
CD45 PE BD Biosciences 553081
α4β7 PE eBiosciences 12-5887
CD34 PE BD Biosciences 551387
然后使用FACS-Calibur细胞计数器分析不同亚群的T淋巴细胞的百分比。
啮齿动物体内的药代动力学评价
测试化合物的口服生物利用度如下进行：评价小鼠中接受一次或两次口服剂量后的血浆暴露并且在一些情况下将所述血浆暴露与单次静脉内剂量的相同化合物后的血浆暴露进行比较。
关于实验设计的更多细节如下：
Figure GDA0001732709360000291
Figure GDA0001732709360000301
*剂量给药将隔8小时进行
在所有情况下，测试化合物的制剂为用于口服剂量给药的30％Labrasol的PBS溶液(v/v)和用于静脉内给药的25％PEG-400的PBS溶液(v/v)。
外周血采集进行如下：
组ID 血液采集时间(h) 体积/动物/时间点
1&2* 0.0833，0.5，1，2，3&5 ～0.6mL
*对于第2组，样品采集将在所述第二剂量之后进行。
在某些情况下，收集进行最长达24小时。还要注意的是，在一些研究中，肝脏和结肠也是从伴随具有外周血的小鼠和基于末梢(terminal)(和系列(serial))进行收集。
其他研究细节包括：
动物：在给药之前，使来自Charles River Labs的雄性CD-1小鼠(20～25g)适应最少5天。在给药当天记录体重。
食物限制：口服(p.o.)给药的动物禁食过夜并在剂量给药后喂食～2小时。
临床观察：在剂量给药和每个样品收集时观察动物。记录任何异常。
剂量给药：含所述测试化合物的制剂以口服给药(用一次性喂食针(disposablefeeding needle)强饲(gavage))。
样品采集：通过心脏穿刺在O2/CO2麻醉下采集末梢血液和组织样品。将会切除所述结肠样品(0.5cm段(section)，盲肠远端2.5cm)，用冰冷PBS冲洗，吸干(blotted)并称重(如适用)。所述肝脏将被吸干(blotted)并称重。血浆、肝脏和结肠样品将在-80摄氏度下冷冻保存直至生物分析。
样品处理/储存：将所有血液样品在湿冰上转移到K2EDTA管中，并在5min(4℃下3200×g，5min)内离心而获得血浆。样品在-80℃冷冻保存直至生物分析。
样品保留：分析血浆样品，并将任何剩余样品在-80℃冷冻保存直至研究完成。剩余的样品被丢弃。
生物分析方法条件(qualification)和样品分析：
基质：小鼠血浆
仪器：配备安捷伦LC系统的AB Sciex API 4000Q-TRAP MS/MS系统(带有二元泵，溶剂脱气机，恒温柱室，CTC自动进样器和安装于所述柱和质谱仪入口之间的转向阀)。
方法条件(method qualification)：
使用单峰的(singlet)非零校准标准(non-zero calibration standard)(STD)确定所述定量动态范围。所述STD将由空白基质样品(无IS)，零样品(含IS)和至少6个覆盖预期范围并包括较低定量水平(LLOQ)的非零STD构成。
系统适用性样品(system suitability sample)(包含分析物和IS的纯净溶液)的三次注入囊括(bracketing)所述批次。
方法接受标准：
所述校准曲线中必须包括至少75％的非零STD，所有反向计算浓度在与标称浓度的±20％偏差内(±25％，对于较低定量水平，LLOQ)。
所述校准曲线的相关系数(r)必须大于或等于0.99。
所述系统适用性样品的运行前和运行后注射之间的所述面积比变化处于±25％以内。
>所述最高校准标准1倍的样品将被稀释并连同相应的稀释质量控制标准一起重新分析测试。
样品分析批次：
系统适用性样品的三次注入囊括所述批次
按升序排列的所述STD囊括了所述研究样品和剂量给药溶液(dosingsolution)
1.研究样品
2.作为3个独立稀释液稀释到空白基质(小鼠血浆)中的所述剂量给药溶液
采用ET02451-01(化合物编号No.340)和ET02452-01(化合物编号No.341)在DSS模 型(治疗性)中进行8天效能研究
研究设计
Figure GDA0001732709360000321
所测试的化合物的描述
名称：载体Labrasol/PBS
体积：8.0mL
溶液：Labrasol(30％)/PBS(70％)
储存：4℃
名称：ET02451(化合物编号No.340)
体积：3.7mL
溶液：8mg/mL在Labrasol(30％)/PBS(70％)中
储存：4℃
名称：ET02452(化合物编号No.341)
体积：3.45mL
溶液：8mg/mL在Labrasol(30％)/PBS(70％)中
储存：4℃
名称：ET02452(化合物编号No.341)
体积：3.40mL
溶液：13mg/mL在PEG400(40％)/PBS(60％)中
储存：4℃
名称：DATK32抗体(eBiosciences#14-5887-85，批号#4282190)
体积：5mL
溶液：浓缩步骤后由0.5mg/mL浓缩至2.5mg/mL
储存：4℃
名称：载体PEG/PBS
体积：8.0mL
溶液：PEG400(40％)/PBS(60％)
储存：4℃
动物护理委员会。所雇用的动物护理机构由加拿大动物护理委员会(CanadianCouncil on Animal Care)(CCAC)授权。这项研究得到了认证的动物护理委员会的批准，并符合CACC管理动物研究使用的标准和规定。
动物。用于本研究的雌性C57Bl/6小鼠(Charles River，St-Constant，Qc)在递送(delivery)时体重为16～19g。到达所述动物设施后，所有动物都进行一般性健康评价。在研究开始之前允许7～14天的适应期。
安置环境。动物安置于标准化的环境条件下。将所述小鼠安置于自动通风笼中，每笼2～3只。每个笼子都配备了手动配水系统。标准认证的商业啮齿动物饮食随意提供。自来水在任何时候都随意提供。据认为，饮食和水中没有已知的污染物会干扰所述研究的目的。每个笼子都被确定为相应的组，表明所述笼子中安置的动物的处理和身份。来自不同处理组的小鼠没有混合。
动物房间维持于21.5±1℃的受控温度和40±10％的相对湿度。受控照明系统对于所述动物保证每天12小时光照，12小时黑暗。保持每小时8～10次换气的足够通风。
测试制品和载体的口服剂量。从第5天到第8天，按照通过强饲法(gavage)给药溶液的程序，通过口服途径(p.o.)以单次缓慢推注(约5秒内)给药整肠蛋白(nacellin)和载体：所述动物被牢固控制。将22G球形尖端胃强饲针(bulb-tipped gastric gavageneedle)通过口腔的一侧并朝食道推进。所述测试制品和载体以5mL/kg口服剂量给药。剂量给药体积根据每只动物的体重分别调整以达到ET02451和ET02452的目标剂量(40mg/kg)。
所述测试制品和所述载体的腹膜内给药。在第5天，DATK32抗体仅在第5天通过i.p.途径作为单次缓慢推注(约5秒内)给药。制备于PEG400(40％)/PBS(60％)中的ET02452和所述i.p.载体(PEG400(40％)/PBS(60％))从第5天给药至第8天。根据以下程序进行腹膜内给药：手动控制所述小鼠并保持头部和身体向下倾斜。所述针(27G)的针尖穿过皮肤并刚好穿过所述腹壁。所述注射器柱塞在给药所述溶液之前进行短暂拉回而确保所述注射器未被插入任何腹腔器官中(在这种情况下，流体将被拉回到所述注射器中)。根据每只动物的体重各自调整给药剂量以达到DATK32抗体(15mg/kg)和ET02452(65mg/kg)的目标剂量。
炎症评分。一旦小鼠被安乐死，收集所述结肠并测量其长度。还要测量病变长度。根据水肿和溃疡的严重程度对结肠炎症评分。
疾病活性指数(DAI)评价。在第5天测量体重和DAI以便在剂量给药之前将DSS处理的动物分配于两个均匀的组中。根据每种具体症状的严重程度对与UC有关的特定症状进行评分：1-便血(阴性血液隐匿(hemoccult)，阳性血液隐匿，粪便中可见的血迹，直肠出血)；2-大便干稠(正常，软但仍然成形，非常软，腹泻)；3-姿势和毛皮(正常；皱毛；皱褶毛结合轻微驼背姿势和轻微脱水；皱毛结合驼背姿势，脱水和行走改变；濒死(动物达到此点前必须安乐死)。所述整体DAI评分是三个参数的总和(最高评分为9)。体重测量和DAI评价也在第8天进行而评价所述治疗的效果。
样品的收集。在第8天，在ET02451-01，ET02452-01和载体剂量给药后5小时，根据CCAC出版的“实验动物护理和使用指南(Guide to the Care and Use of ExperimentalAnimals)”，在全身麻醉下通过心脏穿刺使动物安乐死。将血液转移到含有EDTA的Sarstedt管中。收集肠系膜和外周(腹股沟，附件和臂部)淋巴结，并将其在冰上转移到含有冷PBS的相应管中。将淋巴结保持于冰上，直到组织制备。
细胞群体标记。通过心脏穿刺取血并收集于EDTA涂覆的管上。还收集了肠系膜淋巴结(MLN)和外周淋巴结(PLN)。使用密度梯度(淋巴细胞)分离出来自所述组织中的单核细胞，并用荧光抗体对其进行染色。首先将所述细胞(5×104)与BD小鼠FcBlock(FcγIII/II受体)孵育15min，然后用特异性抗体孵育30min。洗涤后，使用BD固定溶液(Fix Solution)固定细胞。然后使用FACSCalibur细胞计数器分析不同亚群的T淋巴细胞的百分比。所采用的抗体与以上对于单剂量PD研究列出的相同。
结果与讨论
根据上述方法合成化合物。使用NMR表征了一系列化合物(a selection ofcompounds)(并未显示所有数据)。以下为选择化合物提供了NMR数据子集。
化合物编号No.9
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000351
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000361
化合物编号No.10
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000362
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000371
化合物编号No.11
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000372
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000381
化合物编号No.12
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000382
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000391
化合物编号No.14
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000392
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000401
化合物编号No.15
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000402
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000411
化合物编号No.34
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000412
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000421
化合物编号No.40
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000422
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000431
化合物编号No.41
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000432
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000441
化合物编号No.42
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000442
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000451
化合物编号No.43
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000452
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000461
化合物编号No.45
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000462
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000471
化合物编号No.47
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000472
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000481
化合物编号No.50
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000482
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000491
化合物编号No.100
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000492
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000501
化合物编号No.101
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000502
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000511
化合物编号No.103
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000512
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000521
化合物编号No.104
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000522
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000531
化合物编号No.106
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000532
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000541
化合物编号No.107
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000542
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000551
化合物编号No.108
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000552
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000561
化合物编号No.109
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000562
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000571
化合物编号No.110
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000572
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000581
化合物编号No.111
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000582
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000591
化合物编号No.112
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000592
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000601
化合物编号No.123
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000602
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000611
化合物编号No.126
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000612
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000621
化合物编号No.127
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000622
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000631
化合物编号No.128
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000632
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000641
化合物编号No.129
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000642
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000651
化合物编号No.229
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000652
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000661
化合物编号No.230
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000662
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000671
化合物编号No.266
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000672
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000681
化合物编号No.269
1H NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000682
1H-1H TOCSY NMR@25℃
Figure GDA0001732709360000691
血浆蛋白结合测定
血浆蛋白螯合整肠蛋白(nacellin)相对较低。在大鼠血浆中，游离分数(％未结合)介于9.5％～76.9％(平均值42.6％)的范围内，而在小鼠血浆中，游离分数介于15.7％～79.9％(平均值47.8％)的范围内。所述小分子阳性对照普萘洛尔(propranolol)的血浆蛋白结合在小鼠血浆中处于～21％(游离分数)的正常范围内和在大鼠血浆中处于～15％(游离分数)的正常范围内。所评价的化合物包括：
ET01792(化合物5)
ET00762(化合物5的类似物，其中所述苯丙氨酸残基已被色氨酸残基取代)
ET01813(化合物12)
ET01827(化合物15)
Figure GDA0001732709360000692
Figure GDA0001732709360000701
Figure GDA0001732709360000702
水溶性测定
如下表所示，整联蛋白α-4-β-7抑制性整肠蛋白(nacellin)的水溶性相对较高，平均溶解度为715μM。一式三份测量了15种不同化合物的溶解度范围为183μM至大于1000μM。注意，基于所述假定的水溶性，评价的所述最大浓度对于不同的测试制品是不同的。所评价的化合物包括：
UM0131995-05(化合物No.4)
UM0132366-01(化合物No.87)
UM0132368-01(化合物No.88)
UM0132369-01(化合物No.89)
UM0132370-01(化合物No.52)
UM0132371-01(化合物No.90)
UM0132374-01(化合物No.65)
UM0132375-02(化合物No.42)
UM0132376-01(化合物No.92)
UM0132377-01(化合物No.92的类似物，其中赖氨酸残基被鸟氨酸残基取代)
UM0134839-01(化合物编号455的类似物，其中苯丙氨酸和β高Lys残基已被酪氨酸残基取代)
UM0134690-01(化合物No.358)
UM0134830-01(化合物No.159的类似物，其中酪氨酸和丙氨酸残基已相对于序列内的位置进行了交换)
UM0134677-01(化合物No.158)
UM0134700-01(化合物No.62)
Figure GDA0001732709360000711
细胞色素P450抑制作用分析测试
使用人肝微粒体(human liver microsome)评价了各种整肠蛋白(nacellin)对四种细胞色素P450同种型的抑制活性。所评价的四种同种型是：CYP2D5，CYP3A4，CYP2C9和CYP1A2。如下所示，对于在该实验中评价的七种整肠蛋白(nacellin)，85％的所述分析测试结果表明IC50>15μM(高于检测极限)。然而，对于少数化合物记录了IC50<10μM，而在一种情况下，<1μM。对这些化合物进行结构分析，以便了解有助于这种轻微(mild)CYP450-抑制活性的官能团。所评价的化合物包括：
ET01792(化合物No.5)
ET00762-02(化合物No.5的类似物，其中苯丙氨酸残基已被色氨酸残基取代)
ET01813(化合物No.12)
ET00328-01(化合物No.4的类似物，其中酪氨酸、亮氨酸、天冬氨酸和苏氨酸残基已被苏氨酸、甲基亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸残基取代)
ET01827(化合物No.15)
ET01842-01(化合物No.413)
Figure GDA0001732709360000721
体内T淋巴细胞运输分析
在DSS处理的小鼠的体内药代动力学研究中证明了多种整联蛋白α-4-β-7抑制性nacellin减少整联蛋白α-4-β-7表达的T淋巴细胞的运输(trafficking)的能力。如图6所示，这项研究在5天暴露于其饮用水中的葡聚糖硫酸酯的小鼠中进行。在第6天，给药单剂量测试制品，并5～6小时后，收集外周血、肠系膜淋巴结和其他组织并进行评价。
如所示，所述鼠抗-α-4-β-7单克隆抗体(DATK32；25mg/kg)会显著降低整联蛋白α4b7+ T淋巴细胞对肠系膜淋巴结(“MLN”)的归巢，但不影响外周血中CD11a+ T淋巴细胞的所述计数。关于nacellin，在100mg/kg下，所述高口服生物利用度的nacellin，ET1792(化合物5)，而非低口服生物利用度的nacellin，ET2154(化合物105)，在口服剂量给药后会引起向所述MLN的归巢显著降低。当ET2154的所述剂量增加到200mg/kg时，它引起向所述MLN的归巢显著而强烈衰减。这些结果表明，口服生物利用度(和所述伴随的全身暴露)通过整联蛋白α-4-β-7-MAdCAM减弱T淋巴细胞的运输的重要性有利于来自肠相关淋巴组织中的高内皮小静脉的外渗事件(extravasation event)。在任何情况下，测试的nacellin都不会使外周血中CD11a+ T细胞的含量发生显著变化(同样，对于任何nacellin，外周血中的CD34和CD45 T淋巴细胞含量没有变化；数据未显示)。
啮齿动物体内药代动力学评价
我们评价了口服剂量后多种整联蛋白α-4-β-7抑制性nacellin的药代动力学曲线，并且在一些情况下，评价了首次用于实验的小鼠(
Figure GDA0001732709360000733
mice)的静脉内剂量。
正如下面的图7所示，在48mg/kg下一次和两次口服剂量的ET1792(化合物No.5)给予首次用于实验的小鼠产生了显著的吸收和全身暴露。第一次剂量给药后的暴露量(AUC-0-tlast)为1475h*ng/mL，而在第二次剂量给药后，暴露量为2,188h*ng/mL。所述第一次剂量给药后记录的最大血浆浓度接近1,600ng/mL。
参考图8，在口服给药ET1792(40mg/kg)的第二研究中，记录了类似的曲线，暴露量(AUC0-tlast)为589h*ng/mL。所述双相吸收和延迟的Tmax可能指示肠细胞的初始跨细胞灌注，随后是更长时间的跨细胞灌注。
在ET1813(化合物No.12)的随后研究中，单剂量通过口服强饲法(40mg/kg)和静脉注射(5mg/kg)给药。尽管有近2小时的显著终末半衰期，但所述化合物的吸收小于ET1792，所计算的口服生物利用度为～1％。
i.v.剂量给药的PK参数汇总
Figure GDA0001732709360000731
p.o.剂量给药的PK参数汇总
Figure GDA0001732709360000732
在首次用于实验的小鼠中对ET2451(化合物No.340)进行另一组药代动力学研究。在该研究中，在单次口服剂量(40mg/kg)和单次静脉内剂量(5mg/kg)后都测定血浆、结肠和肝脏中的化合物暴露。正如图9和以下表中所示，据发现，ET2451在血浆中的口服生物利用度约为11％，在结肠中约为100％。另外值得注意的是，消除半衰期(elimination half-life)的差异：在血浆中所述半衰期在口服给药后为约30分钟，而在结肠中所述半衰期大于21小时。我们还评价了所述肝脏中的生物利用度(下图)，与血浆中测得的相似(～8％)，但口服剂量给药后～8小时的半衰期显著更长。从这项研究和其他研究中可以清楚地看到，清除ET2451和其他nacellins的主要途径是通过肝胆清除(hepatobiliary clearance)。
Figure GDA0001732709360000741
n/a表示不适用。
ET02451的肝脏PK参致的汇总
Figure GDA0001732709360000742
C0 i.v.剂量给药后外推至时间零的浓度
tmax 观察到最大浓度时的时间
Cmax 最大观察浓度
表观t1/2 表观最终半衰期
AUC0-tlast 从时间0至所述最后可测定浓度的时间的所述浓度vs.时间曲线之下的面积
AUC0-inf 从时间0至所无限的所述浓度vs.时间曲线之下的面积
CL 系统性清除
MRT0-inf 从时间0至所述最后可测定浓度的时间的平均停留时间
Vm 分配的稳态体积
F 口服生物利用度*(剂量i.v.*AUCp.o.)/(剂量p.o.*AUCi.v.)*100
DSS模型中的8天疗效研究(治疗性)
我们在溃疡性结肠炎的DSS实验模型中评价了两种独特nacellin的效能：ET2451(化合物No.340)和ET2452(化合物No.341)。如上所示，ET2451在口服剂量给药后显示出从所述肠道和系统性暴露的显著吸收，而ET2452是低口服生物利用度实体(low oralbioavailability entity)。两种测试化合物在3天的疗程内均通过b.i.d.给药于小鼠—在最初5天暴露于其饮用水中的DSS(2％～3％)之后。将所述nacellins的疗效和药代动力学效应与所述小鼠抗整联蛋白α-4-β-7mAb，DATK32进行比较。ET2452既通过口服给药又经由i.p.注射给药另一组。该实验设计的目的是证明，尽管口服给药时可能无效，但它采用i.p.剂量给药会产生了实质性的效果。
在第5天和第8天，基于三种特定症状的严重性单独地评价了疾病活性指数(“DAI”)评分：便血，粪便干稠性和一般健康评价(姿势，皮毛和脱水)。如图10中所示，DAI评分在DSS+载体对照组中从第5天至第8天显著增加。口服给药ET02451-01和i.p.给药DATK32分别导致15％和19％的减少，但只有所述ET02451-01诱发的效应证明具有统计学显著性。ET02452-01的口服给药对DAI没有任何有益效果。相比之下，与DSS+载体对照组相比(p<0.05)，腹膜内ET02452-01治疗却导致了DAI评分在第8天显著降低，降低了46％。事实上，ET02452-01i.p.治疗从第5天至第8天阻止了所述对照载体治疗组中观察到的UC症状的严重度增加。
溃疡性结肠炎随着小鼠结肠长度的减少与肠道炎症改变相关(附录IV中的原始数据)。DSS+载体对照组显示出平均结肠长度为4.3±0.3cm，而病灶(lesion)长度为1.7±0.3cm，对应于40％的病变/结肠长度(图11)。治疗对结肠长度没有任何影响(图11)。然而，通过达到12％的病变/结肠长度值(p<0.05)，ET02451-01显著降低了该组的病变长度(p<0.05)，导致所述病变/结肠长度比显著改善。口服和i.p.给药ET02452-01，与对照载体处理组相比，导致病斑长度分别减少53％和20％，但是这些减少不是统计学显著性的(图11B)。除此之外，DATK32在第5天通过i.p.给药，与对照载体处理组相比，导致了45％的减少(不是统计学显著性的)。
无论治疗是否在单独的实验中进行比较，学生t-检验(Student t-test)将用于每个测试制品治疗组与对照载体治疗组的统计学比较。在这种情况下，通过单独的学生t-检验，由口服ET02452-01和i.p.DATK32的统计学显著性效应将会在病变长度和病变/结肠长度上获得。
通过将每只小鼠的宏观评分(macroscopic score)×病变/结肠长度比率相乘而计算结肠炎症的最终评分。参照图12，该参数的所述测量结果显示了与对照载体处理组相比，通过所述口服给药ET02451-01(77％)和ET02452-01(76％)的病变炎症显著减少。腹膜内给药ET02452-01和DATK32导致分别减少39％和53％，但是这种效果在统计学上不显著。
细胞群
在测试的所述三种组织中载体小鼠和化合物处理小鼠中的CD3+CD4+CD11a+T细胞群的百分比之间没有统计学差异(参见图13)。在所有组织中，CD34+细胞的群体在载体和nacellin处理小鼠中是相同的。然而，在接受所述抗α4β7抗体(DATK32)的小鼠中却观察到CD34+细胞显著增加(p<0.01)。对于所述CD3+CD4+α4β7+细胞群，在血液中，在外周淋巴结中均未观察到差异。然而，在接受ET02452(化合物No.341)i.p.和或ET02451(化合物No.340)p.o.的小鼠的肠系膜淋巴结中却观察到该群的显著降低。腹膜内给药DATK32也显著降低了CD3+CD4+α4β7+T淋巴细胞的百分比。
值得注意的是，超过600种大环化合物(macrocycle)表现出活性低于表1A、1B和1C中总结的那些化合物的活性。表2A，2B和2C中总结了具有更少或几乎没有活性的所述大环化合物的选择。
虽然本文已经描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员应该理解的是，在不脱离本发明的精神或所附权利要求的范围的情况下对其可以制作出变体。本文所公开的所有文件，包括以下参考文献列表中的文件，均结合于本文中作为参考。
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Claims (25)

1.一种式(I)的化合物：
Figure FDA0003716171980000011
其中，
R1是H；低级烷基；芳基；杂芳基；烯基；或杂环；它们全部在一个或多个可取代的位置上被一个或多个取代基可选取代，所述取代基选自由以下各项组成的组：羟基、氰基、烷基、烷氧基、乙烯基、烯基、炔基、甲酰基、卤代烷基、卤化物、芳基、杂芳基、酰胺、酰基、酯、醚、硫醚、硫代烷氧基、膦基、以及–NRaRb，其中Ra和Rb独立地选自C1-6烷基、芳基或苄基；
R2和R3各自独立地是蛋白源性或非蛋白源性α-氨基酸的氨基酸链，条件是R2和R3可以彼此共价连接以形成环；
R4和R5各自独立地为H或C(O)-NHRt，其中Rt是叔丁基；
R6是H；低级烷基；苄基；烯基；低级烷氧基；芳基；杂芳基；杂环；-C(O)R****，其中R****独立地选自烷基、芳基、杂芳基、氨基、氨基烷基、氨基芳基、氨基杂芳基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基；-CH2C(O)R；或-C(O)Rc；它们全部在一个或多个可取代的位置上被一个或多个取代基可选取代，所述取代基选自由以下各项组成的组：羟基、氰基、烷基、烷氧基、乙烯基、烯基、炔基、甲酰基、卤代烷基、卤化物、芳基、杂芳基、酰胺、酰基、酯、醚、硫醚、硫代烷氧基、膦基、以及–NRaRb，其中Ra和Rb独立地选自C1-6烷基、芳基或苄基，
或与R7或R8一起形成其N-末端是N-R6的蛋白源性或非蛋白源性氨基酸的环状侧链，其中所述蛋白源性或非蛋白源性氨基酸能够被取代基取代，所述取代基选自由以下各项组成的组：羟基、氰基、烷基、烷氧基、乙烯基、烯基、炔基、甲酰基、卤代烷基、卤化物、芳基、杂芳基、酰胺、酰基、酯、醚、硫醚、硫代烷氧基、膦基、以及–NRaRb，其中Ra和Rb独立地选自C1-6烷基、芳基或苄基；
R7和R8独立地选自其N-末端为N-R6的蛋白源性或非蛋白源性α-氨基酸的氨基酸侧链，或可以与R6形成环状侧链；
立体中心1*、2*和3*各自独立地选自R和S；
n为1；以及
其中Z是氨基酸的氨基端；毗邻L的-C＝O-是氨基酸的羧基端；并且L连同Z和-C＝O-一起是具有下式的肽：
Xy-Xz-X1-X2-X3
其中
X1是亮氨酸或叔丁基-Ala；
X2是Asp；以及
X3选自由Thr、Thr(OBn)、Thr(OEt)、Thr(OMe)、Pen、MeThr、别Thr、Abu、Val、Ile和别Ile组成的组；以及
Xy和Xz选自由以下各项组成的组：
Figure FDA0003716171980000021
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2.根据权利要求1所述的化合物，其中R1是H。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中R2或R3共价连接至R1以形成具有NR1作为N-端的脯氨酸。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的化合物，其中R2和R3不都是H。
5.根据权利要求1或2所述的化合物，其中R2和R3各自独立地选自由蛋白源性或非蛋白源性α-氨基酸的氨基酸链组成的组中。
6.根据权利要求1或2所述的化合物，其中R2和R3分别为H和CH3，反之亦然。
7.根据权利要求1或2所述的化合物，其中R2或R3是-CH2-S-RS，其中Rs选自低级烷基；低级氨基烷基；芳基；杂芳基；烯基；或杂环；它们全部在一个或多个可取代的位置上被一个或多个取代基可选取代，所述取代基选自由以下各项组成的组：羟基、氰基、烷基、烷氧基、乙烯基、烯基、炔基、甲酰基、卤代烷基、卤化物、芳基、杂芳基、酰胺、酰基、酯、醚、硫醚、硫代烷氧基、膦基、以及–NRaRb，其中Ra和Rb独立地选自C1-6烷基、芳基或苄基。
8.根据权利要求7所述的化合物，其中Rs是苯基或被低级烷基、卤素取代的苯基；或低级氨基烷基。
9.根据权利要求1～3中任一项所述的化合物，其中R6是H。
10.根据权利要求1～3中任一项所述的化合物，其中R6与R8或R9形成环，导致产生具有N-R6作为其N-端的脯氨酸残基。
11.根据权利要求1～3中任一项所述的化合物，其中X1是Leu。
12.根据权利要求1～3中任一项所述的化合物，其中X3是Thr。
13.根据权利要求1～3中任一项所述的化合物，其中X3是Val。
14.根据权利要求1～3中任一项所述的化合物，其中X3是Ile。
15.根据权利要求1所述的化合物，选自由以下各项组成的组：
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16.一种药物组合物，包含权利要求1～15中任一项所述的化合物，以及药用载体。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，配制成用于口服递送。
18.根据权利要求16所述的药物组合物，配制成用于局部递送。
19.根据权利要求16所述的药物组合物，配制成用于肠胃外递送。
20.根据权利要求1-15中任一项所述的化合物在制备用于治疗患者的病症或疾病的药物中的用途，其中所述病症或疾病是炎症性肠病、腹腔疾病、显微镜结肠炎、胶原性结肠炎、嗜酸细胞性胃肠炎、直肠结肠切除术和回肠吻合术后产生的囊袋炎、胃肠道中人免疫缺陷病毒感染和移植物抗宿主病。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述病症或疾病是炎症性肠病。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述炎症性肠病是溃疡性结肠炎。
23.根据权利要求21所述的用途，其中所述炎症性肠病是克罗恩氏病。
24.根据权利要求20所述的用途，其中所述腹腔疾病是非热性血管炎。
25.根据权利要求20-24中任一项所述的用途，其中所述患者是人。
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