CN109071529B

CN109071529B - 作为jak激酶抑制剂的嘧啶化合物

Info

Publication number: CN109071529B
Application number: CN201780026437.4A
Authority: CN
Inventors: 瑞安·赫德森; J·科扎克; 梅莉萨·弗勒里; 保罗·R·法特里; 安妮-玛丽·博索莱伊; D·D·波德什托; 黄小军
Original assignee: Theravance Biopharma R&D IP LLC
Current assignee: Theravance Biopharma R&D IP LLC
Priority date: 2016-04-28
Filing date: 2017-04-27
Publication date: 2021-08-06
Anticipated expiration: 2037-04-27
Also published as: MX2018013191A; US10028960B2; US20170312280A1; PT3433253T; ZA201807179B; JP2019514903A; KR102244257B1; US20200046709A1; TWI726094B; AU2017258186A1; ES2779880T3; CL2018003060A1; BR112018072168A2; CN109071529A; US10485803B2; TW201739747A; KR20190002591A; DK3433253T3; EP3433253A1; SG11201809342YA

Abstract

本发明提供式(I)化合物，

Description

作为JAK激酶抑制剂的嘧啶化合物

技术领域

本发明涉及可用作JAK激酶抑制剂的嘧啶化合物。本发明还涉及包含所述化合物的医药组合物、使用所述化合物治疗炎症性疾病的方法和可用于制备所述化合物的方法和中间体。

背景技术

溃疡性结肠炎是结肠的慢性炎症性疾病。所述疾病以直肠和大肠的粘膜层炎症和溃疡为特征。常见症状包括腹泻、血便和腹痛。临床病程是间歇性的，其以交替的恶化期和缓解期为特点。发达国家的发病率似乎大于发展中国家。估计主要工业化国家中有120万人罹患溃疡性结肠炎且预计数量会随人口增长而增加。患有溃疡性结肠炎的患者具有增加的罹患结肠直肠癌的风险。(例如丹尼西(Danese)等人，新英格兰医学杂志(N Engl J Med),2011,365,1713-1725)。

尽管存在各种促进和维持患者的溃疡性结肠炎(UC)的缓解的治疗选择，但没有一种是理想的。柳氮磺吡啶(Sulfasalazine)相关性治疗在轻度UC中通常有效，但其在中度到重度疾病中不够有效。通常使用皮质类固醇来提供患有中度到重度UC的患者的缓解的快速诱导。然而，由于类固醇与较长期不良作用(例如骨质疏松症和骨折、感染、白内障、伤口愈合减慢和肾上腺激素产生的抑制)相关，因此不赞成长期使用所述类固醇来维持缓解。全身免疫抑制剂(例如硫唑嘌呤、环孢素和甲氨蝶呤)在中度到重度UC患者中起效较慢且效能中等，但延长使用由于长期全身免疫抑制的结果(例如感染和淋巴瘤的风险增加)可能会成问题。抗TNFα抗体(例如英利昔单抗(infliximab)和阿达木单抗(adalimumab))尽管昂贵且需要皮下或静脉内投与，但其在约60％到70％的患有中度到重度疾病的UC患者中较为有效。然而，高达三分之一的患者无法充分响应，而另外三分之一的初始响应者在几周内形成耐受性(艾利克斯(Allez)等人，克罗恩病和结肠炎杂志(J Crohn's Colitis),2010,4,355-366；鲁特格尔特斯(Rutgeerts)等人，新英格兰医学杂志,2005,353,2462-2476)。最近批准的UC疗法维多珠单抗(vedolizumab)(抗整联蛋白α₄β₇抗体)在中度到重度UC患者中是有效的，但其非经肠途径是次最佳的，且通过这个机制的长期免疫抑制的结果有待确定。尽管存在治疗选择，但约10％到20％的UC患者在诊断10年内仍需要结肠切除术(塔尔戈夫尼克(Targownik)等人，美国胃肠病学杂志(Am J Gastroenterol),2012,107,1228-1235)。显而易见，医学上急需促进和维持中度到重度UC的缓解且不存在由慢性全身免疫抑制引起的安全性问题的有效疗法。

尽管潜于溃疡性结肠炎下面的机制尚未被完全了解，但认为在遗传上易受影响的个体中环境因素会诱发免疫系统对肠道微生物区的不适当(过量)反应，从而导致结肠炎症、组织损坏和所述疾病的相关症状特征。

尽管尚不清楚UC的确切发病机制，但已明了促炎性细胞因子在免疫反应中起关键作用(斯特罗布(Strober)等人，加拿大胃肠肝病杂志(Gastroenterol),2011,140,1756-1767)。在UC中最常升高的许多促炎性细胞因子(例如IL-4、IL-6、IL-13、IL-15、IL-23、IL-24、IFNγ和瘦素)依赖于JAK酪氨酸激酶家族(即，JAK1、JAK2、JAK3和Tyk2)进行信号转导。细胞因子与JAK依赖性细胞因子受体的结合诱导受体二聚化，此导致JAK激酶上的酪氨酸残基磷酸化，从而实现JAK活化。磷酸化的JAK继而结合并磷酸化各种STAT蛋白，所述STAT蛋白在细胞核中二聚化、内化并直接调节基因转录，较其它效应尤其导致与炎症性疾病相关的下游效应。JAK通常与配对为同二聚体或异二聚体的细胞因子受体相关。特定细胞因子与特定JAK配对相关。

异位性皮肤炎(AD)是常见的慢性炎症性皮肤病，其仅在美国就影响了估计1400万人。据估计AD在发达国家影响10％到20％的儿童和1％到3％的成年人(鲍(Bao)等人，Janus激酶-信号转导子和转录活化子(JAK-STAT),2013,2,e24137)且盛行率日益增加。依赖JAK-STAT路径的促炎性细胞因子(具体来说IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-13、IFNγ和TSLP)的升高与AD相关(鲍等人，梁(Leung)等人，临床研究杂志(The Journal of ClinicalInvestigation),2004,113,651-657)。另外，已显示，IL-31(通过JAK配对进行信号传导的另一细胞因子)的上调在与AD的慢性状态相关的瘙痒中具有作用(孙克利(Sunkoly)等人，变态反应与临床免疫学杂志(Journal of Allergy and Clinical Immunology),2006,117,411-417)。

抑制JAK酶家族可抑制许多关键促炎性细胞因子的信号传导。因此，JAK抑制剂可能可用于治疗溃疡性结肠炎和其它胃肠炎症性疾病(例如克罗恩病(Crohn's disease)和免疫检查点抑制剂诱发的结肠炎)、异位性皮肤炎和其它炎症性皮肤病、变态反应性鼻炎、哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)。然而，由于JAK/STAT路径对免疫系统的调节作用，全身暴露于JAK抑制剂可能具有不利的全身性免疫抑制效应。因此，可能需要提供在作用位点具有作用而无显著全身作用的新颖JAK抑制剂。具体来说，为治疗胃肠炎症性疾病(例如溃疡性结肠炎)，可能需要提供可经口投与且在胃肠道中实现治疗相关暴露并具有最少全身暴露的新颖JAK抑制剂。还可能需要提供用于治疗异位性皮肤炎的新颖JAK抑制剂，所述新颖JAK抑制剂可以最少的全身暴露局部投与。

发明内容

在一个方面中，本发明提供具有作为JAK激酶抑制剂活性的新颖化合物。

因此，本发明提供式(I)化合物：

其中

R¹选自：

(a)-S(O)₂R⁴，其中R⁴选自：

C_1-4烷基，其中C_1-4烷基任选地经-CN、-OC_1-3烷基或C_3-6环烷基取代，

杂环基，其含有4到6个包括一个氮原子的环原子，

其中任一杂环基任选地经-CN取代，

C_3-6环烷基，

吡啶基，其中吡啶基任选地经氟取代，和

苯基；

(b)C_1-4烷基，其中C_1-4烷基任选地经-CN、

或

吡啶基取代，其中吡啶基任选地经-CN取代；和

(c)-C(O)R⁵，其中R⁵选自：

C_1-4烷基，其中C_1-4烷基任选地经C_3-6环烷基或经一或两个氟取代，

-OC_1-4烷基，

C_3-6环烷基，和

吗啉基；

R²是氢或甲基；

R³是C_1-3烷基；且

n为1或2；

或其医药上可接受的盐或立体异构体。

如下文所用，片语“式(I)化合物”意指式(I)化合物或其医药上可接受的盐；即，除非另有指示，否则这个片语意指呈游离碱形式或呈医药上可接受的盐形式的式(I)化合物。

本发明还提供包含本发明化合物和医药上可接受的载剂的医药组合物。

在另一方面中，本发明提供呈结晶游离碱形式的特定式(I)化合物。已发现结晶1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈具有在约235℃到约245℃的范围内、通常在约237℃与约242℃之间的熔融温度，且在室温下暴露于在约5％与约90％之间的相对湿度的范围时展现小于约0.4％的重量变化。

本发明还提供治疗哺乳动物的胃肠炎症性疾病、特定来说溃疡性结肠炎的方法，所述方法包含向哺乳动物投与本发明的化合物或医药组合物。

在另一方法方面中，本发明提供治疗哺乳动物的皮肤炎症性疾病或病症、特定来说异位性皮肤炎的方法，所述方法包含向哺乳动物的皮肤施加本发明的化合物或医药组合物。

在单独且不同的方面中，本发明还提供本文所述的合成工艺和中间体，其可用于制备本发明的化合物。

本发明还提供用于医学疗法中的如本文所述的本发明化合物，以及本发明化合物的用途，其用于制造用以治疗哺乳动物的胃肠炎症性疾病的调配物或药剂。本发明进一步提供本发明化合物的用途，其用于制造用以治疗皮肤炎症性疾病的调配物或药剂。

附图说明

通过参照附图来说明本发明的各个方面。

图1显示结晶型I 1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈[在下文称形式I]的粉末x射线衍射(PXRD)图案。

图2显示结晶型I的差示扫描量热(DSC)温度记录图。

图3显示结晶型I的热重分析(TGA)图形。

图4显示在约25℃的温度下观察到的结晶型I的动态水分吸附(DMS)等温线。

图5显示结晶型II 1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈[在下文称形式II]的粉末X射线衍射(PXRD)图案。

图6显示结晶型II的差示扫描量热(DSC)温度记录图。

图7显示结晶型II的热重分析(TGA)图形。

图8显示在约25℃的温度下观察到的结晶型II的动态水分吸附(DMS)等温线。

具体实施方式

在其它方面中，本发明提供式(I)的JAK激酶抑制剂、其医药上可接受的盐和制备其的中间体。下列取代基和值打算提供本发明的各个方面的代表性实例。这些代表性值打算进一步定义所述方面且并不打算排除其它值或限制本发明的范围。

在本发明的一个方面中，R¹选自(a)-S(O)₂R⁴，其中R⁴选自C_1-4烷基，其中C_1-4烷基任选地经-CN、-OC_1-3烷基或C_3-6环烷基取代；杂环基，其含有4到6个包括一个氮原子的环原子，其中任一杂环基任选地经-CN取代；C_3-6环烷基；吡啶基，其中吡啶基任选地经氟取代；和苯基；(b)C_1-4烷基，其中C_1-4烷基任选地经-CN、

或吡啶基取代，其中吡啶基任选地经-CN取代；和(c)C(O)R⁵，其中R⁵选自C_1-4烷基，其中C_1-4烷基任选地经C_3-6环烷基或经一或两个氟取代；-OC_1-4烷基；C_3-6环烷基；和吗啉基。

在另一方面中，R¹是-S(O)₂R⁴，其中R⁴选自C_1-4烷基，其中C_1-4烷基任选地经-CN、-OC_1-3烷基或C_3-6环烷基取代；杂环基，其含有4到6个包括一个氮原子的环原子，其中任一杂环基任选地经-CN取代；C_3-6环烷基；吡啶基，其中吡啶基任选地经氟取代；和苯基。

在另一方面中，R¹是-S(O)₂R⁴，其中R⁴选自C_1-2烷基，其中C_1-2烷基任选地经-CN、-OCH₃或环丙基取代；氮杂环丁基，其中氮杂环丁基任选地经-CN取代；吡咯烷基；环丙基；吡啶基，其中吡啶基任选地经氟取代；和苯基。

在另一方面中，R¹是-S(O)₂R⁴，其中R⁴是甲基、乙基、氮杂环丁基、吡咯烷基、环丙基、吡啶基或苯基，其中乙基任选地经甲氧基取代，氮杂环丁基任选地经-CN取代，且吡啶基任选地经氟取代。

在一个方面中，R¹是C_1-4烷基，其中C_1-4烷基任选地经-CN、

或吡啶基取代，其中吡啶基任选地经-CN取代。

在另一方面中，R¹是C_1-2烷基，其中C_1-2烷基任选地经-CN、

或吡啶基取代，其中吡啶基任选地经-CN取代。

在一个方面中，R¹是-C(O)R⁵，其中R⁵选自C_1-4烷基，其中C_1-4烷基任选地经C_3-6环烷基或经一或两个氟取代；-OC_1-4烷基；C_3-6环烷基；和吗啉基。

在另一方面中，R¹是-C(O)R⁵，其中R⁵选自C_1-2烷基，其中C_1-2烷基任选地经环丙基或经一或两个氟取代；-OC_1-4烷基；C_3-6环烷基；和吗啉基。

在另一方面中，R¹是-C(O)R⁵，其中R⁵是-CHF₂、-CH₂-环丙基、-OCH₃、-O-异丁基、环丁基、环戊基或吗啉基。

在一个方面中，R²是氢或甲基。在特定方面中，R²是甲基。

在一个方面中，R³是C_1-3烷基。

在另一方面中，R³是甲基。

在一个方面中，n是1或2。在另一方面中，n是2。

在某一方面中，本发明提供式(II)化合物：

其中变量R⁴如本文所定义。

在一个方面中，本发明提供以下实例1-9和表1-3的化合物。

在另一方面中，本发明提供选自以下的化合物：

1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-8-氮杂二环[3.2.1]辛-8-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈，

1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈，

(3-((6-甲氧基-2-(甲基((1R,3s,5S)-9-(甲基磺酰基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇，

(3-((6-甲氧基-2-(((1R,3s,5S)-9-((2-甲氧基乙基)磺酰基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)(甲基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇，

3-((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-8-氮杂二环[3.2.1]辛-8-基)丙腈，

5-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)甲基)吡啶甲腈，

5-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)甲基)烟碱甲腈，

(1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬烷-9-甲酸异丁基酯，

2,2-二氟-1-((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)乙-1-酮，

(3-((2-(((1R,3s,5S)-9-(氮杂环丁-1-基磺酰基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇，

1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈，

(3-((2-(((1R,3s,5S)-9-((5-氟吡啶-3-基)磺酰基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇，

(3-((6-甲氧基-2-(((1R,3s,5S)-9-(苯基磺酰基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇，

(3-((2-(((1R,3s,5S)-9-(乙基磺酰基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇，

(3-((2-(((1R,3s,5S)-9-((环丙基甲基)磺酰基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇，

(3-((6-甲氧基-2-(((1R,3s,5S)-9-(吡啶-3-基磺酰基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇，

3-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)-磺酰基)丙腈，

(3-((6-甲氧基-2-(甲基((1R,3s,5S)-9-(吡咯烷-1-基磺酰基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇，

(3-((2-(((1R,3s,5S)-9-(环丙基磺酰基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)(甲基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇，

(3-((6-甲氧基-2-(甲基((1R,3s,5S)-9-(吡啶-3-基磺酰基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇，

(3-((6-甲氧基-2-(甲基((1R,3s,5S)-9-(苯基磺酰基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇，

(3-((2-(((1R,3s,5S)-9-(氮杂环丁-1-基磺酰基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)(甲基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇，

(3-((2-(((1R,3s,5S)-9-((环丙基甲基)磺酰基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)(甲基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇，

(3-((2-(((1R,3s,5S)-9-((5-氟吡啶-3-基)磺酰基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)(甲基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇，

4-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)甲基)吡啶甲腈，

(3-((6-甲氧基-2-(((1R,3s,5S)-9-(吡啶-3-基甲基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇，

3-((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)丙腈，

1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)甲基)环丙烷-1-甲腈，

(3-((6-甲氧基-2-(甲基((1R,3s,5S)-9-(吡啶-4-基甲基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇，

4-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)甲基)吡啶甲腈，

2,2-二氟-1-((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)乙-1-酮，

(1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬烷-9-甲酸甲酯，

((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基-嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)(吗啉基)甲酮，

2-环丙基-1-((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)乙-1-酮，

环戊基((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)甲酮，和

环丁基((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)甲酮，

和其医药上可接受的盐。

化学结构在本文中是根据如在ChemDraw软件(珀金埃尔默公司(PerkinElmer,Inc.)，马萨诸塞州剑桥(Cambridge,MA))中执行的IUPAC约定来命名。例如，实例2的化合物：

命名为1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈。(1R,3s,5S)符号描述嘧啶基氨基相对于9-氮杂二环[3.3.1]壬烷基团的外型定向，且此同样适于含有8-氮杂二环[3.2.1]基团(即变量n＝1)的化合物。所有本发明化合物都呈外型定向。

此外，式(I)化合物的吡唑基部分以互变异构体形式存在。例如，实例2的化合物可等效地表示为：

根据IUPAC约定，这些表示使得吡唑基部分的原子的编号不同。上文表示命名为1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((3-(羟基甲基)-1H-吡唑-5-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈，其中下划线标识出名称与第一表示不同的地方。将了解尽管结构是以特定形式显示或命名，但本发明还包括其互变异构体。

本发明的化合物含有一或多个手性中心，且因此所述化合物(和其中间体)可以下列形式存在：外消旋混合物；纯净立体异构体(即，对映异构体或非对映异构体)；富集立体异构体的混合物等。除非另有指示，否则本文所显示或命名的在手性中心处没有经定义立体化学的手性化合物打算包括在未定义的立体中心处的任何或所有可能的立体异构体变化形式。特定立体异构体的绘示或命名意味着所指示立体中心具有指定的立体化学，且应了解除非另有指示，否则还可存在少量的其它立体异构体，条件是所绘示或命名化合物的效用不因另一立体异构体的存在而消除。

式(I)化合物还含有若干碱性基团(例如氨基)，且因此所述化合物可以游离碱或以各种盐形式存在，例如单质子化盐形式、二质子化盐形式、三质子化盐形式或其混合物。除非另有指示，否则所有所述形式都包括在本发明的范围内。

本发明还包括同位素标记的式(I)化合物，即，原子经具有相同原子序数但原子质量与在自然界中占主导的原子质量不同的原子替代或富集的式(I)化合物。可纳入式(I)化合物中的同位素的实例包括(但不限于)²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、¹⁸O、³⁵S和¹⁸F。特别关注富集氚或碳-14的式(I)化合物，所述化合物可用于(例如)组织分布研究中。还特别关注尤其在代谢位点处富集氘的式(I)化合物，预计所述化合物具有更大的代谢稳定性。另外特别关注富集正电子发射同位素(例如¹¹C、¹⁸F、¹⁵O和¹³N)的式(I)化合物，所述化合物可用于(例如)正电子发射断层摄影(PET)研究中。

定义

当描述包括本发明的各个方面和实施例的本发明时，除非另有指示，否则下列术语具有以下含义。

术语“烷基”意指可为直链或具支链或其组合的单价饱和烃基。除非另有定义，否则所述烷基通常含有1到10个碳原子。代表性烷基包括(例如)甲基(Me)、乙基(Et)、正丙基(n-Pr)或(nPr)、异丙基(i-Pr)或(iPr)、正丁基(n-Bu)或(nBu)、仲丁基、异丁基、叔丁基(t-Bu)或(tBu)、正戊基、正己基、2,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2-乙基丁基、2,2-二甲基戊基、2-丙基戊基等。

当特定数量的碳原子打算用于特定术语时，碳原子数在所述术语前显示。例如，术语“C_1-3烷基”意指具有1到3个碳原子的烷基，其中碳原子呈任一化学上可接受的构形，包括直链或具支链构形。

术语“烷氧基”意指单价基团-O-烷基，其中烷基如上文所定义。代表性烷氧基包括(例如)甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等。

术语“环烷基”意指可为单环或多环的单价饱和碳环基团。除非另有定义，否则所述环烷基通常含有3到10个碳原子。代表性环烷基包括(例如)环丙基(cPr)、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、金刚烷基等。

术语“杂环基”、“杂环(heterocycle、heterocyclic或heterocyclic ring)”意指具有3到10个总环原子的单价饱和或部分不饱和环状非芳香族基团，其中所述环含有2到9个碳环原子和1到4个选自氮、氧和硫的环杂原子。杂环基可为单环或多环(即，稠合或桥接的)。代表性杂环基包括(例如)吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、咪唑啶基、吗啉基、硫吗啉基、吲哚啉-3-基、2-咪唑啉基、四氢吡喃基、1,2,3,4-四氢异喹啉-2-基、奎宁环基、7-氮杂降莰烷基、降托烷基(nortropanyl)等，其中附接点在任一可用碳或氮环原子处。如果情况使得杂环基的附接点明显，那么所述基团可替代地称作非化合价物质，即吡咯烷、哌啶、哌嗪、咪唑、四氢吡喃等。

术语“治疗有效量”意指在投与需要治疗的患者时足以实现治疗的量。

如本文所用术语“治疗”意指患者(例如哺乳动物(特定来说人类))的疾病、病症或医学病况(例如胃肠炎症性疾病)的治疗，其包括下列各项中的一或多者：

(a)预防疾病、病症或医学病况发生，即，预防疾病或医学病况的复发或预防性治疗易患疾病或医学病况的患者；

(b)改善疾病、病症或医学病况，即，消除患者的疾病、病症或医学病况或使其消退，包括抵消其它治疗剂的作用；

(c)抑制疾病、病症或医学病况，即，减慢或阻止患者的疾病、病症或医学病况的发展；或

(d)减轻患者的疾病、病症或医学病况的症状。

术语“医药上可接受的盐”意指为投与患者或哺乳动物(例如人类)可接受的盐(例如，对于给定剂量方案具有可接受的哺乳动物安全性的盐)。医药上可接受的代表性盐包括下列的盐：乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、乙二磺酸(edisylic)、延胡索酸、龙胆酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖醛酸、马来酸、苹果酸、苦杏仁酸、甲磺酸、半乳糖二酸、萘磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2,6-二磺酸、烟碱酸、硝酸、乳清酸、帕莫酸(pamoic)、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸和羟萘甲酸等。

术语“其盐”意指在酸的氢被阳离子(例如金属阳离子或有机阳离子等)替代时形成的化合物。例如，阳离子可为式(I)化合物的质子化形式，即一或多个氨基被酸质子化的形式。通常，盐是医药上可接受的盐，但此并非不打算投与患者的中间体化合物的盐所必需。

术语“氨基保护基团”意指适于防止在氨基氮处发生不需要反应的保护基团。代表性氨基保护基团包括(但不限于)甲酰基；酰基，例如烷酰基，例如乙酰基和三氟乙酰基；烷氧基羰基，例如叔丁氧基羰基(Boc)；芳基甲氧基羰基，例如苄基氧基羰基(Cbz)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)；芳基甲基，例如苄基(Bn)、三苯甲基(Tr)和1,1-二-(4’-甲氧基苯基)甲基；硅基，例如三甲基硅基(TMS)、三异丙基硅基(TIPS)、叔丁基二甲基硅基(TBS或TBDMS)、[2-(三甲基硅基)-乙氧基]甲基(SEM)等。多种保护基团和其引入和去除描述于T.W.格林(T.W.Greene)和P.G.M.伍斯(P.G.M.Wuts)，有机合成中的保护基团(Protecting Groupsin Organic Synthesis)，第三版，威利(Wiley)，纽约(New York)中。

一般合成程序

本发明化合物和其中间体可使用市售或常规制备的起始材料和试剂根据下列一般方法和程序来制备。除非另有指示，否则下列方案中所用的取代基和变量(例如R¹、R²、R³、R⁴等)具有与本文别处所定义的定义相同的含义。另外，除非另有指示，否则可使用具有酸性或碱性原子或官能基的化合物或可以盐形式产生(在一些情形下，在特定反应中使用盐将需要在进行反应之前使用常规程序将盐转化成非盐形式，例如游离碱)。

尽管下列程序中可显示或描述本发明的特定实施例，但所属领域技术人员将认识到本发明的其它实施例或方面还可使用所述程序或通过使用所属领域技术人员已知的其它方法、试剂和起始材料来制备。特定来说，将了解本发明的化合物可通过多种工艺途径来制备，其中以不同顺序合并反应物以在产生最终产物的途径中提供不同的中间体。

制备本发明的最终化合物的一般方法利用如方案1中所图解说明的关键中间体1。变量R¹、R²、R⁴、R⁵和n如式(I)中所定义，R^A代表任选经取代的C_1-4烷基，且L是离去基团。所述方案显示变量R³是甲基的化合物。R³是C_2-3烷基的化合物可以类似方式来制备。

方案1

R¹如在选择(a)中定义为-S(O)₂R⁴的磺酰胺化合物通常是通过使中间体1与介于约1当量与约1.1当量之间的形式Cl-S(O)₂R⁴的磺酰氯在约0℃的温度下在过量碱存在下接触来制备。所述反应通常进行约1小时到约24小时或直到所述反应基本上完成为止。

为制备其中R¹是如在选择(b)中所定义的任选经取代的烷基的化合物，烷基化反应通常使用卤基离去基团L，主要是氯或溴。所述反应通常是通过使中间体1与过量的试剂L-R^A在惰性稀释剂中在过量碱存在下接触来进行。所述反应通常是在约20℃与约60℃之间的温度下进行约10小时到约24小时或直到所述反应基本上完成为止。

或者，可使用迈克尔加成反应(Michael addition reaction)来制备其中R¹是氰基乙基的化合物。例如，如下文实例中所述，为制备其中R¹是-(CH₂)₂CN的化合物，使中间体1与约1当量与约1.5当量之间的丙烯腈在过量碱(例如二异丙基乙胺或重氮二环十一烯)存在下接触。所述反应通常在室温下进行约3小时到约24小时或直到所述反应基本上完成为止。

其中R¹定义为-C(O)R⁵的化合物可使用形式Cl-C(O)R⁵的羰酰氯(具体来说当R⁵定义为-OC_1-4烷基时为氯甲酸酯)来制备。通常，使中间体1与约1当量的羰酰氯在约0℃的温度下在过量碱存在下接触。所述反应通常进行约1小时到约3小时或直到所述反应基本上完成为止。

或者，其中R¹定义为-C(O)R⁵的化合物可通过使中间体1与适度过量的羧酸试剂HO-C(O)-R⁵在典型酰胺偶合条件下接触来制备。所述反应通常是在过量碱存在下利用活化剂(例如六氟磷酸N,N,N',N'-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲鎓(HATU))来进行。所述反应通常在室温下进行约3小时到约24小时或直到所述反应基本上完成为止。

方案2中图解说明制备其中变量R³是甲基的中间体1的实例性反应。

方案2

在步骤1的芳香族取代反应中，使三氯嘧啶2与过量的氨基-吡唑-甲醇中间体3在碱存在下反应以提供中间体4。然后使Boc保护的氨基-氮杂-二环中间体5与中间体4反应以提供中间体6。例如，在过量碱(例如二异丙基乙胺)存在下将中间体4与介于约1与约1.5当量之间的氮杂-二环中间体5合并。所述反应通常在介于约85℃与约120℃之间的升高温度下进行约6小时到约12小时或直到所述反应基本上完成为止。中间体6与甲醇钠的反应提供中间体7。所述反应通常在密封管中在介于约85℃与约120℃之间的升高温度下进行约4小时到约10小时或直到所述反应基本上完成为止。在最后步骤中，可通过利用酸(通常盐酸)的标准处理去除Boc基团以提供中间体1。

或者，中间体1可通过方案3中所图解说明的步骤序列来制备。

方案3

其中R^B是氢或硅基氧保护基团，例如三异丙基硅基(TIPS)或叔丁基二甲基硅基(TBS)。将Boc保护的氨基-氮杂-二环基团5与二氯-甲氧基嘧啶中间体8合并以形成中间体9。所述反应通常是在升高的温度下在碱存在下进行。然后使中间体9与氨基-吡唑中间体3'在标准布赫瓦尔德条件(Buchwald condition)下反应以提供中间体7。例如，将中间体9与介于约1当量与约1.5当量之间的吡唑中间体3'在碱(例如碳酸铯或碳酸钾)和钯催化剂存在下合并。所述反应通常在介于约80℃与约110℃之间的升高温度下进行约8小时到约24小时或直到所述反应基本上完成为止。在最后步骤中，如在方案2中去除Boc保护基团。当R^B是硅基保护基团时，可同时去除硅基和Boc基团。

因此，在方法方面中，本发明提供制备式(I)化合物或其医药上可接受的盐的方法，所述方法包含：

使式(III)化合物：

与

(i)Cl-S(O)₂R⁴，

(ii)式L-R^A的化合物，其中L是离去基团且R^A是C_1-4烷基，其中C_1-4烷基任选地经-CN、

或吡啶基取代，其中吡啶基任选地经-CN取代；

(iii)Cl-C(O)R⁵，或

(iv)HO-C(O)R⁵

其中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和n如上文所定义，和

任选地形成医药上可接受的盐反应

以提供式(I)化合物或其医药上可接受的盐。

在单独且不同的方面中，本发明提供其中变量取上述值中的任一者的式(III)化合物和其中R²和R³各自为甲基且n为1或2的式(III)化合物。

在另一方法方面中，本发明提供制备式1化合物的方法

其中R²和n如上文所定义，所述方法包含：

(a)使式9化合物：

与式3化合物：

其中R^B是氢或硅基氧保护基团反应，以形成式7化合物：

(b)自式7化合物去除一或多个保护基团以提供式1化合物。

结晶型

在另一方面中，本发明提供呈结晶游离碱形式I和形式II的1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈(参见实例2和10-13)。

在一个方面中，结晶游离碱形式I的特征在于较其它峰在8.89±0.20、12.99±0.20、13.44±0.20和20.16±0.20的2θ值处具有显著衍射峰的粉末X射线衍射(PXRD)图案。形式I的特征可进一步在于在选自10.64±0.20、10.99±0.20、15.02±0.20、15.74±0.20、16.47±0.20、20.93±0.20、22.22±0.20和26.25±0.20的2θ值处具有两个或更多个额外衍射峰(包括三个或更多个和四个或多个额外衍射峰)的PXRD图案。在另一方面中，形式I的特征在于在8.89±0.20、10.64±0.20、10.99±0.20、12.99±0.20、13.44±0.20、15.02±0.20、15.74±0.20、16.47±0.20、20.16±0.20、20.93±0.20、22.22±0.20和26.25±0.20的2θ值处具有衍射峰的PXRD图案。

如在粉末X射线衍射领域所熟知，PXRD图案的峰位置较相对峰高对实验细节(例如试样制备和仪器几何学的细节)相对更不敏感。因此，在一个方面中，结晶型I的特征在于其中峰位置基本上符合图1中所显示的那些的粉末X射线衍射图案。

在另一方面中，结晶型I的特征在于其在暴露于高温时的性能。如图2中所展示，以10℃/分钟的加热速率记录的差示扫描量热(DSC)迹线展现在约235℃到约245℃范围内(包括介于约237℃与约242℃之间)的吸热热流峰，所述峰鉴别为熔融物转变。图3的热重分析(TGA)迹线展现对应于熔融后分解的重量损失的起始。

已证实结晶型I具有可逆吸附/解吸附性质以及格外小的吸湿性倾向。形式I展示在5％到90％相对湿度的湿度范围内的增重小于约0.4％。在两个吸附和解吸附循环中未观察到滞后。形式I视为非吸湿性。

另外，已证实结晶型I可稳定地微粉化。在未微粉化的材料的粉末X射线衍射图案与微粉化后的形式I的材料的图案之间无法观察到差异。

结晶游离碱形式II的特征在于图5的PXRD图案且进一步在于其在暴露于高温时的性能。如图6中所展示，以10℃/分钟的加热速率记录的差示扫描量热(DSC)迹线展现在约205℃到约240℃范围内的吸热热流宽峰，其连同图7的热重分析(TGA)迹线一起可解释为归并的熔融转变和分解。形式II是略具吸湿性的固体，其展示在两个吸附和解吸附循环之间小的滞后。形式II展示在5％到90％相对湿度的湿度范围内的增重为约1.2％。

如实例11和12中所描述，形式I可通过以下方式来制备：将化合物溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)或二甲基甲酰胺(DMF)中并以约1:1.5到1:1.75丙酮:水的比率添加丙酮和水作为反溶剂。将所得反应混合物搅拌约4小时到约24小时，过滤，用丙酮和水的混合物(例如丙酮和水的1:1.4混合物)洗涤，并干燥以提供结晶型I。用于制备结晶型II的工艺描述于实例13中。

在另一方面中，本发明提供制备结晶型I的方法，所述方法包含：(a)将1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈溶解于选自N-甲基吡咯烷酮和二甲基甲酰胺的稀释剂中以形成反应混合物；(b)向反应混合物中添加丙酮和水；和(c)自反应混合物分离结晶型I。

医药组合物

本发明的化合物和其医药上可接受的盐通常以医药组合物或调配物的形式使用。所述医药组合物可通过任一可接受的投与途径投与患者，包括(但不限于)经口、局部(包括经皮)、经直肠、经鼻、吸入和非经肠投与模式。

因此，在本发明的组合物方面中的一者中，本发明涉及包含医药上可接受的载剂或赋形剂和式(I)化合物的医药组合物，其中如上文所定义，“式(I)化合物”意指式(I)化合物或其医药上可接受的盐。任选地，所述医药组合物可含有其它治疗剂和/或调配剂(如果需要)。在论述组合物和其用途时，“本发明的化合物”在本文中还可称作“活性剂”。如本文所用术语“本发明的化合物”打算包括由式(I)涵盖的所有化合物以及以式(II)体现的物质和其医药上可接受的盐。

本发明的医药组合物通常含有治疗有效量的本发明化合物。然而，所属领域技术人员将认识到，医药组合物可含有大于治疗有效量(即整体组合物)或小于治疗有效量(即为了多次投与以实现治疗有效量而设计的个别单位剂量)。

通常，所述医药组合物将含有约0.1重量％到约95重量％的活性剂；包括约5重量％到约70重量％的活性剂。

在本发明的医药组合物中可使用任一常规载剂或赋形剂。特定载剂或赋形剂或载剂或赋形剂的组合的选择将取决于用于治疗特定患者的投与模式或医学病况或疾病状态的类型。就此来说，适用于特定投与模式的医药组合物的制备完全在医药领域技术人员的范围内。另外，用于本发明医药组合物中的载剂或赋形剂可自市面购得。以进一步说明的方式，常规调配技术描述于雷明顿(Remington)：药物科学与实践(The Science andPractice of Pharmacy)，第20版，利平科特威廉姆斯和怀特公司(Lippincott Williams&White)，马里兰州巴尔的摩(Baltimore,Maryland)(2000)；和H.C.安塞尔(H.C.Ansel)等人，医药剂型和药物递送系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems)，第7版，利平科特威廉姆斯和怀特公司，马里兰州巴尔的摩(1999)中。

可用作医药上可接受的载剂的材料的代表性实例包括(但不限于)下列物质：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素，例如微晶纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，例如可可油和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等张盐水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和医药组合物中所使用的其它无毒相容性物质。

医药组合物通常是通过将活性剂与医药上可接受的载剂和一或多种可选成分彻底充分混合或掺和来制备。然后可使用常规程序和设备将所得均匀掺和的混合物成形或加载到片剂、胶囊、丸剂等中。

本发明的医药组合物优选地以单位剂型来包装。术语“单位剂型”是指适合向患者投药的物理离散单位，即，每一单位含有经计算以单独或与一或多个其它单位组合产生所需治疗效应的预定量的活性剂。例如，所述单位剂型可为胶囊、片剂、丸剂等，或适于非经肠投与的单位包装。

在一个实施例中，本发明的医药组合物适于经口投与。适用于经口投与的医药组合物可呈以下形式：胶囊、片剂、丸剂、糖锭、扁囊剂、糖衣锭、粉剂、颗粒剂；或于水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或水包油或油包水液体乳液；或酏剂或糖浆等；其各自含有预定量的本发明化合物作为活性成分。

当打算以固体剂型(即，以胶囊、片剂、丸剂等的形式)经口投与时，本发明的医药组合物通常将包含活性剂和一或多种医药上可接受的载剂。任选地，所述固体剂型可包含：填充剂或增量剂，例如淀粉、微晶纤维素、乳糖、二磷酸钙、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；粘合剂，例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯树胶；保湿剂，例如甘油；崩解剂，例如交联羧甲基纤维素钠、琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和/或碳酸钠；缓溶剂，例如石蜡；吸收促进剂，例如季铵化合物；润湿剂，例如鲸蜡醇和/或甘油单硬脂酸酯；吸收剂，例如高岭土和/或膨润土；润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠和/或其混合物；着色剂；和缓冲剂。

释放剂、润湿剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂还可存在于本发明的医药组合物中。医药上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、氢氯酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸、山梨醇、酒石酸、磷酸等。用于片剂、胶囊、丸剂等的包衣剂包括用于肠溶包衣的那些，例如乙酸邻苯二甲酸纤维素、聚乙酸邻苯二甲酸乙烯酯、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物、乙酸偏苯三酸纤维素、羧甲基乙基纤维素、乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素等。

还可使用(例如)各种比例的羟丙基甲基纤维素或其它聚合物基质、脂质体和/或微球体来调配本发明的医药组合物以提供活性剂的减缓或控制释放。另外，本发明的医药组合物可任选地含有遮光剂且可经调配以使得其任选地以延迟方式仅(或优先)在胃肠道的某一部分中释放活性剂。可用包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。如果适当，活性剂还可呈具有上述赋形剂中的一或多者的微囊封形式。

适于经口投与的液体剂型包括(举例说明)医药上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。液体剂型通常包含活性剂和惰性稀释剂，例如水或其它溶剂；增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄基酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(例如棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、油酸、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和去水山梨醇的脂肪酸酯和其混合物。或者，可通过(例如)喷雾干燥将某些液体调配物转化成粉末，所述粉末用于通过常规程序来制备固体剂型。

除活性成分以外，悬浮液还可含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和去水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶和其混合物。

本发明化合物还可非经肠投与(例如通过静脉内、皮下、肌内或腹膜内注射)。对于非经肠投与，通常将活性剂与适于非经肠投与的媒剂混合，所述媒剂包括(例如)无菌水溶液、盐水、低分子量醇(例如丙二醇)、聚乙二醇、植物油、明胶、脂肪酸酯(例如油酸乙酯)等。非经肠调配物还可含有一或多种抗氧化剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂或分散剂。这些调配物可通过使用无菌可注射介质、灭菌剂、过滤、辐照或加热来使其无菌。

或者，本发明的医药组合物经调配以通过吸入投与。适于通过吸入投与的医药组合物通常将呈气溶胶或粉末的形式。所述组合物通常使用诸如计量吸入器、干粉吸入器、雾化器或类似递送装置等熟知递送装置来投与。

当通过使用加压容器吸入来投与时，本发明的医药组合物通常将包含活性成分和适宜推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适宜气体。另外，医药组合物可呈包含本发明化合物的胶囊或筒柱(由例如明胶制得)和适用于粉末吸入器的粉末的形式。适宜粉末基质包括(例如)乳糖或淀粉。

本发明的化合物还可经调配以作为软膏剂或乳霜局部投与到皮肤。软膏剂调配物是具有通常澄清的油性或多脂材料的基质的半固体制剂。适用于软膏剂调配物中的油性材料包括石蜡(石油凝胶)、蜂蜡、可可脂、牛油树油脂和鲸蜡醇。软膏剂可任选地另外包括软化剂和渗透促进剂(如果需要)。

可将乳霜调配物制备为包含油相和水相(通常包括纯化水)的乳液。乳霜调配物的组分可包括：油基质，例如凡士林、矿物油、植物和动物油和甘油三酯；乳霜基质，例如羊毛脂醇、硬脂酸和鲸蜡硬脂醇；凝胶基质，例如聚乙烯醇；溶剂，例如丙二醇和聚乙二醇；乳化剂，例如聚山梨醇酯、硬脂酸酯，例如硬脂酸甘油基酯、羟基硬脂酸辛基酯、聚烃氧硬脂酸酯、PEG硬脂酰基醚、棕榈酸异丙基酯和去水山梨醇单硬脂酸酯；稳定剂，例如多糖和亚硫酸钠；软化剂(即增湿剂)，例如中链甘油三酯、肉豆蔻酸异丙基酯和聚二甲基硅氧烷；硬化剂，例如鲸蜡醇和硬脂醇；抗微生物剂，例如对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、苯氧乙醇、山梨酸、重氮烷基脲和丁基化羟基茴香醚；渗透促进剂，例如N-甲基吡咯烷酮、丙二醇、聚乙二醇单月桂酸酯等；和螯合剂，例如依地酸二钠。

下列非限制性实例说明本发明的代表性医药组合物。

片剂口服固体剂型

以4:5:1:1的比率将本发明的化合物或其医药上可接受的盐与微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和交联羧甲基纤维素钠干式掺和并将其压缩成片剂，以提供例如5mg、20mg或40mg活性剂/片剂的单位剂量。

胶囊口服固体剂型

通过湿式粒化以4:5:1:1的比率将本发明的化合物或其医药上可接受的盐与微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和交联羧甲基纤维素钠合并，并将其加载到明胶或羟丙基甲基纤维素胶囊中，以提供例如5mg、20mg或40mg活性剂/胶囊的单位剂量。

液体调配物

通过向水和抗坏血酸的混合物添加本发明的化合物形成包含本发明化合物(0.1％)、水(98.9％)和抗坏血酸(1.0％)的液体调配物。

肠溶包衣口服剂型

将本发明的化合物溶解于含有聚乙烯吡咯烷酮的水溶液中并以1:5w/w活性剂:珠粒的比率喷涂到微晶纤维素或糖珠粒上，且然后施加包含丙烯酸共聚物(例如以商标名Eudragit-

和Eudragit-

购得的丙烯酸共聚物的组合)或乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素的肠溶包衣的约5％增重。将肠溶包衣珠粒加载到明胶或羟丙基甲基纤维素胶囊中以提供例如30mg活性剂/胶囊的单位剂量。

肠溶包衣口服剂型

将包含Eudragit-

和Eudragit-

的组合或乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素的肠溶包衣施加到上述片剂口服剂型或胶囊口服剂型。

用于局部投与的软膏剂调配物

将本发明的化合物与石蜡、C₈-C₁₀甘油三酯、羟基硬脂酸辛基酯和N-甲基吡咯烷酮以一定比率合并以提供含有0.05重量％到5重量％活性剂的组合物。

用于局部投与的软膏剂调配物

将本发明的化合物与白石蜡、丙二醇、甘油单酯和甘油二酯、石蜡、丁基化羟基甲苯和依地酸钙二钠以一定比率合并以提供含有0.05重量％到5重量％活性剂的组合物。

用于局部投与的软膏剂调配物

将本发明的化合物与矿物油、石蜡、碳酸亚丙酯、白石蜡和白蜡合并以提供含有0.05重量％到5重量％活性剂的组合物。

用于局部投与的乳霜调配物

将矿物油与本发明的化合物、丙二醇、棕榈酸异丙基酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡醇、去水山梨醇单硬脂酸酯、聚烃氧40硬脂酸酯、山梨酸、对羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯合并以形成油相，通过剪切掺和将所述油相与纯化水合并以提供含有0.05重量％到5重量％活性剂的组合物。

用于局部投与的乳霜调配物

包含本发明化合物、苄醇、鲸蜡醇、无水柠檬酸、甘油单酯和甘油二酯、油醇、丙二醇、鲸蜡硬脂基硫酸钠、氢氧化钠、硬脂醇、甘油三酯和水的乳霜调配物含有0.05重量％到5重量％活性剂。

用于局部投与的乳霜调配物

包含本发明的化合物、鲸蜡硬脂醇、肉豆蔻酸异丙基酯、丙二醇、聚西托醇1000、聚二甲基硅氧烷360、柠檬酸、柠檬酸钠和纯化水以及作为防腐剂的咪脲(imidurea)、对羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯的乳霜调配物含有0.05重量％到5重量％活性剂。

效用

已显示本发明的化合物为JAK酶家族(JAK1、JAK2、JAK3和TYK2)的有效抑制剂。抑制JAK酶家族可抑制许多关键促炎性细胞因子的信号传导。因此，预计本发明的JAK抑制剂可用于治疗炎症性疾病，例如溃疡性结肠炎和其它胃肠炎症性疾病，例如克罗恩病和免疫检查点抑制剂诱发的结肠炎。还预计本发明JAK抑制剂可用于治疗异位性皮肤炎和其它炎症性和瘙痒性皮肤病且可用于治疗呼吸病况，例如变态反应性鼻炎、哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)。

胃肠炎症性疾病

除提供JAK酶的有效抑制以外，本发明的化合物已经设计以较差地被吸收以最小化全身暴露。在插套管的大鼠中测试的所选化合物显示低的口服生物利用度。另外，所述化合物经设计以在作用位点(例如在结肠中)发挥其作用。如下文分析6和7中所描述，实例2的化合物在经口投与时在大鼠中展现小于约5％的口服生物利用度和大于约250的结肠暴露对血浆暴露的比率。

噁唑酮诱发的结肠炎是与人类溃疡性结肠炎具有组织学相似性的实验模型。如下文所描述，较本发明的其它化合物，实例2的化合物展示在小鼠的噁唑酮诱发的结肠炎模型中具有活性。此外，在探测全身功能活性的小鼠免疫抑制模型中测试时，所述化合物在噁唑酮模型中展示效能所需的相同剂量下展示最小的免疫抑制作用。因此，所述化合物在临床前模型中展示抗结肠炎活性而不展现全身作用。

预计高的结肠对血浆比率将提供稳健的管腔驱动型抗炎性活性而没有相关的全身驱动型不良作用。预计所述化合物可用于各种胃肠炎症性适应症，其包括(但不限于)溃疡性结肠炎(直肠乙状结肠炎、全结肠炎、溃疡性直肠炎和左侧结肠炎)、克罗恩病、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、贝赛特氏病(Behcet’s disease)、乳糜泻、免疫检查点抑制剂诱发的结肠炎、回肠炎、嗜酸性细胞性食管炎、移植物抗宿主病相关性结肠炎和传染性结肠炎。溃疡性结肠炎(条顿(Reimund)等人，临床免疫学杂志(J Clin Immunology),1996,16,144-150)、克罗恩病(沃伊沃德(Woywodt)等人，欧洲胃肠病学和肝脏病学杂志(Eur JGastroenterology Hepatology),1999,11,267-276)、胶原性结肠炎(库马瓦特(Kumawat)等人，细胞与分子免疫学杂志(Mol Immunology),2013,55,355-364)、淋巴细胞性结肠炎(库马瓦特等人，2013)、嗜酸性细胞性食管炎(温兰德(Weinbrand)-古奇伯格(Goichberg)等人，癌症免疫研究(Immunol Res),2013,56,249-260)、移植物抗宿主病相关性结肠炎(科尔(Coghill)等人，血液(Blood),2001,117,3268-3276)、感染性结肠炎(施塔尔马赫(Stallmach)等人，国际结肠直肠疾病杂志(Int J Colorectal Dis),2004,19,308-315)、贝赛特氏病(周(Zhou)等人，自身免疫性评论(Autoimmun Rev),2012,11,699-704)、乳糜泻(德尼托(de Nitto)等人，世界胃肠病学杂志(World J Gastroenterol),2009,15,4609-4614)、免疫检查点抑制剂诱发的结肠炎(例如CTLA-4抑制剂诱发的结肠炎；(矢野(Yano)等人，翻译医学杂志(J Translation Med),2014,12,191)、PD-1或PD-L1抑制剂诱发的结肠炎)和回肠炎(山本(Yamamoto)等人，消化与肝病(Dig Liver Dis),2008,40,253-259)的特征在于某些促炎性细胞因子水平升高。由于许多促炎性细胞因子通过JAK活化进行信号传导，因此本申请案中所述的化合物可能够减轻炎症并提供症状缓解。

特定来说，预计本发明的化合物可用于诱导和维持溃疡性结肠炎的缓解，且可用于治疗克罗恩病、免疫检查点抑制剂诱发的结肠炎和移植物抗宿主病中的胃肠不良作用。

因此，在一个方面中，本发明提供治疗哺乳动物(例如人类)的胃肠炎症性疾病的方法，所述方法包含向哺乳动物投与本发明化合物或包含医药上可接受的载剂和本发明化合物的医药组合物。

本发明进一步提供治疗哺乳动物的溃疡性结肠炎的方法，所述方法包含向哺乳动物投与本发明化合物或包含医药上可接受的载剂和本发明化合物的医药组合物。

当用于治疗溃疡性结肠炎时，本发明的化合物通常将以单一日剂量或每天多个剂量来经口投与，但可使用其它投与形式。每一剂量所投与活性剂的量或每天投与的总量通常将由医师根据包括以下的相关情况来确定：欲治疗的病况、所选投与途径、实际投与的化合物和其相对活性、个别患者的年龄、重量和反应、患者症状的严重程度等。

预计对于平均70kg的人类来说适于治疗溃疡性结肠炎和其它胃肠炎症性病症的剂量在约1mg/天到约400mg/天活性剂的范围内，包括约5mg/天到约300mg/天和约20mg/天到约70mg/天的活性剂。

组合疗法

本发明的化合物还可与一或多种通过相同机制或通过不同机制起作用的药剂组合使用以实现胃肠炎症性病症的治疗。可用于组合疗法的药剂类别包括(但不限于)氨基水杨酸酯、类固醇、全身免疫抑制剂、抗TNFα抗体、抗VLA-4抗体、抗整联蛋白α₄β₇抗体、抗细菌剂和抗腹泻药物。

可与本发明JAK抑制剂化合物组合使用的氨基水杨酸酯包括(但不限于)美沙拉明(mesalamine)、奥沙拉嗪(osalazine)和柳氮磺吡啶。类固醇的实例包括(但不限于)普赖松(prednisone)、普赖苏浓(prednisolone)、氢化可体松(hydrocortisone)、布地奈德(budesonide)、倍氯米松(beclomethasone)和氟替卡松(fluticasone)。可用于治疗炎症性病症的全身免疫抑制剂包括(但不限于)环孢素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、6-巯嘌呤和他克莫司(tacrolimus)。此外，在组合疗法中可使用抗TNFα抗体，其包括(但不限于)英利昔单抗、阿达木单抗、戈利木单抗(golimumab)和赛妥珠单抗(certolizumab)。通过其它机制起作用的有用化合物包括抗VLA-4抗体(例如那他珠单抗(natalizumab))、抗整联蛋白α₄β₇抗体(例如维多珠单抗)、抗细菌剂(例如利福昔明(rifaximin))和抗腹泻药物(例如洛哌丁胺(loperamide))。(莫扎法里(Mozaffari)等人，生物疗法专家评论(ExpertOpin.Biol.Ther.)2014,14,583-600；丹尼西，肠与肝(Gut),2012,61,918-932；兰(Lam)等人，免疫疗法(Immunotherapy),2014,6,963-971)。

因此，在另一方面中，本发明提供用于治疗胃肠炎症性病症的治疗组合，所述组合包含本发明的化合物和一或多种可用于治疗胃肠炎症性病症的其它治疗剂。例如，本发明提供包含本发明的化合物和一或多种选自以下的药剂的组合：氨基水杨酸酯、类固醇、全身免疫抑制剂、抗TNFα抗体、抗VLA-4抗体、抗整联蛋白α₄β₇抗体、抗细菌剂和抗腹泻药物。在包括第二药剂时，其以治疗有效量存在，即以在与本发明化合物共投与时产生治疗有益效应的任一量存在。

因此，本发明还提供包含本发明化合物和一或多种可用于治疗胃肠炎症性病症的其它治疗剂的医药组合物。

此外，在方法方面中，本发明提供治疗胃肠炎症性病症的方法，所述方法包含向哺乳动物投与本发明的化合物和一或多种可用于治疗胃肠炎症性病症的其它治疗剂。

在组合疗法中使用时，所述药剂可调配于如上文所揭示的单一医药组合物中，或所述药剂可以通过相同或不同的投与途径同时或在分开时间投与的分开组合物提供。在分开投与时，所述药剂的投与在时间上应足够接近以提供所需治疗效应。所述组合物可分开包装或可一起包装为试剂盒。试剂盒中的两种或更多种治疗剂可通过相同投与途径或通过不同投与途径来投与。

炎症性皮肤病

例如，异位性皮肤炎与依赖JAK-STAT路径的促炎性细胞因子(特定来说，IL-4、IL-5、IL-10、IL-13和IFNγ)的升高相关。由于本发明的化合物在所有四种JAK酶下都展现有效抑制，因此预计其会有效地抑制异位性皮肤炎和其它炎症性皮肤病的促炎性细胞因子特征。特定来说，在分析4、2和5中分别描述的细胞分析中，实例2中所揭示的化合物1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈对于IL-4、IL-13和IFNγ的抑制展现50nM或更小的IC₅₀值。所述化合物在小鼠的TPA诱发的刺激性接触性皮肤炎模型中还展现剂量依赖性和浓度依赖性效应。此外，实例2的化合物的模型乳霜和软膏剂调配物已展示真皮水平在小鼠中持续至少2天且在小型猪中持续至少7天且未检测到血浆暴露。

预计在不存在显著全身水平下持续性真皮水平的JAK抑制剂将在皮肤中引起有效局部抗炎性和抗瘙痒活性而无全身驱动的不良作用。预计所述化合物有益于多种真皮炎症性或瘙痒病况，所述病况包括(但不限于)异位性皮肤炎、斑秃、白斑病、皮肤T细胞淋巴瘤、结节性痒疹、扁平苔藓、原发性局灶性皮肤类淀粉变性、大疱性类天疱疮、移植物抗宿主病的皮肤表现、类天疱疮、盘状狼疮、环状肉芽肿、慢性单纯性苔藓、外阴/阴囊/肛周瘙痒症、硬化性苔藓、疱疹后神经痛痒、扁平毛发苔藓和秃发性毛囊炎。特定而言，异位性皮肤炎(鲍等人，Janus激酶-信号转导子和转录活化子，2013,2,e24137)、斑秃(星(Xing)等人，自然-医学(Nat Med.)2014,20,1043-1049)、白斑病(克雷格罗威(Craiglow)等人，美国医学会杂志·皮肤病学(JAMA Dermatol.)2015,151,1110-1112)、皮肤T细胞淋巴瘤(耐克跑克(Netchiporouk)等人，细胞周期(Cell Cycle).2014；13,3331-3335)、结节性痒疹(孙考利(Sonkoly)等人，变态反应与临床免疫学杂志(J Allergy Clin Immunol.)2006,117,411-417)、扁平苔藓(韦尔斯-库比亚克(Welz-Kubiak)等人，免疫学研究杂志(J Immunol Res.)2015,ID:854747)、原发性局灶性皮肤类淀粉变性(田中(Tanaka)等人，英国皮肤病学杂志(Br J Dermatol.)2009,161,1217-1224)、大疱性类天疱疮(费里西安尼(Feliciani)等人，国际免疫病理学与药理学杂志(Int J Immunopathol Pharmacol.)1999,12,55-61)和移植物抗宿主病的真皮表现(兴山(Okiyama)等人，研究性皮肤病学杂志(J Invest Dermatol.)2014,134,992-1000)的特征在于通过JAK活化进行信号传导的某些细胞介素升高。因此，本发明的化合物可能够减轻由这些细胞因子驱动的相关性真皮炎症或瘙痒症。特定来说，预计本发明的化合物可用于治疗异位性皮肤炎和其它炎症性皮肤病。

因此，在一个方面中，本发明提供治疗哺乳动物(例如人类)的炎症性皮肤病的方法，所述方法包含向哺乳动物的皮肤施加包含本发明的化合物和医药载剂的医药组合物。在一个方面中，炎症性皮肤病是异位性皮肤炎。

本发明的化合物还可与革兰氏(gram)阳性抗生素(例如莫匹罗星(mupirocin)和梭链孢酸)组合使用来治疗炎症性皮肤病。因此，在一个方面中，本发明提供治疗哺乳动物的炎症性皮肤病的方法，所述方法包含向哺乳动物的皮肤施加本发明的化合物和革兰氏阳性抗生素。在另一方面中，本发明提供包含本发明化合物、革兰氏阳性抗生素和医药上可接受载剂的医药组合物。

本发明的化合物已被证实在酶结合分析中为JAK1、JAK2、JAK3和TYK2酶的有效抑制剂且在细胞分析中具有有效的功能活性而无细胞毒性，如下列实例中所描述。

实例

提供下列合成和生物实例来说明本发明，且其并不视为以任一方式限制本发明的范围。在下文实例中，除非另有指示，否则下列缩写具有下列含义。下文未定义的缩写具有其通常被接受的含义。

ACN＝乙腈

CPME＝环戊基甲基醚

d＝天

DIPEA＝N,N-二异丙基乙胺

DMF＝N,N-二甲基甲酰胺

DMSO＝二甲基亚砜

EtOAc＝乙酸乙酯

EtOH＝乙醇

h＝小时

HATU＝六氟磷酸N,N,N',N'-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲鎓

IPA＝异丙醇

MeOH＝甲醇

min＝分钟

NMP＝N-甲基吡咯烷酮

RT＝室温

TEA＝三乙胺

THF＝四氢呋喃

TFA＝三氟乙酸

Xantphos＝4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨

Xphos＝二环己基膦基-2′,4′,6′-三异丙基联苯

XphosPd G2＝氯(2-二环己基膦基-2′,4′,6′-二异丙基-1,1′-联苯)[2-(2′-氨基-1,1′-联苯)]钯(II)

试剂和溶剂是购自商业供应商(奥德里奇(Aldrich)、佛鲁卡(Fluka)、西格玛(Sigma)等)，且不经进一步纯化即使用。通过薄层色谱(TLC)、分析型高效液相色谱(anal.HPLC)和质谱监测反应混合物的进展。如在每一反应中具体描述来处理反应混合物；通常通过萃取和其它纯化方法(例如温度和溶剂依赖性结晶和沉淀)来纯化反应混合物。另外，通常通过柱色谱或通过制备型HPLC、通常使用C18或BDS柱填充物和常规溶析剂来纯化反应混合物。下文描述典型制备型HPLC条件。

通常通过质谱和¹H-NMR光谱来实施反应产物的表征。对于NMR分析来说，将试样溶解于氘化溶剂(例如CD₃OD、CDCl₃或d₆-DMSO)中并利用Varian Gemini 2000仪器(400MHz)在标准观察条件下获取¹H-NMR光谱。通过电喷雾离子化方法(ESMS)利用耦合到自动纯化系统的应用生物系统(Applied Biosystems)(加利福尼亚州福斯特城(Foster City,CA))型号API 150 EX仪器或沃特斯(Waters)(马萨诸塞州米尔福德(Milford,MA))3100来进行化合物的质谱鉴别。

除非另有指示，否则使用下列条件进行制备型HPLC纯化。

柱：C18,5μm 21.2×150mm或C18,5μm 21×250mm或C14,5μm 21×150mm

柱温度：室温

流速：20.0mL/min

移动相：A＝水+0.05％TFA

B＝ACN+0.05％TFA，

注射体积：(100-1500μL)

检测器波长：214nm

将粗制化合物以约50mg/mL溶解于1:1水:乙酸中。使用2.1×50mm C18柱实施4分钟的分析规模测试运行，随后使用100μL注射液利用基于分析规模测试运行的B％滞留的梯度实施15或20分钟的制备规模运行。确切梯度具有试样依赖性。利用21×250mm C18柱和/或21×150mm C14柱检查具有封闭运行(close running)杂质的试样用于最好分离。通过质谱分析鉴别含有所需产物的部分。

分析型HPLC条件

方法A

柱：LUNA C18(2),150×4.60mm,3μm

柱温度：37℃

流速：1.0mL/min

注射体积：5μL

试样制备：溶解于1:1ACN:水中

移动相：A＝水:ACN:TFA(98:2:0.05)

B＝水:ACN:TFA(2:98:0.05)

检测器波长：250nm

梯度：32min总(时间(min)/B％)：0/2、10/20、24/90、29/90、30/2、32/2

方法B

柱：LUNA C18(2),150×4.60mm,3μm

柱温度：37℃

流速：1.0mL/min

注射体积：10μL

试样制备：溶解于1:1ACN:水中

移动相：A＝水:ACN:TFA(98:2:0.05)

B＝水:ACN:TFA(10:90:0.05)

检测器波长：254nm

梯度：35min总(时间(min)/B％)：0/2、20/25、23/90、26/90、27/2、35/2

制备1：(3-((2,6-二氯嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇

向2,4,6-三氯嘧啶(8.0g,43.7mmol)和(3-氨基-1H-吡唑-5-基)甲醇(7.4g,65.4mmol)于EtOH(80mL)中的混合物中添加DIPEA(11.3g,87.2mmol)。将反应混合物在20℃下搅拌12h并过滤，以得到白色固体状标题中间体(6.5g,57％产率)。C₈H₇Cl₂N₅O的(m/z):[M+H]⁺计算值为260.00，实验值为260.0。

制备2：(3-((2-(((1R,3s,5S)-8-氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇

(a)(1R,3s,5S)-3-((4-氯-6-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-8-氮杂二环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁基酯

将(3-((2,6-二氯嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇(6.0g,23.1mmol)、(1R,3s,5S)-3-氨基-8-氮杂二环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁基酯(6.3g,27.7mmol)和DIPEA(6.0g,46.2mmol)于DMSO(60mL)中的混合物在100℃下搅拌12h。将反应混合物与试验规模运行的产物合并且将其倒入水(800mL)中。过滤沉淀并在真空中干燥。使残余物自EtOAc(500mL)和石油醚(500mL)重结晶，以得到灰色固体状标题中间体(5.6g,50％产率)。通过NMR证实结构。

(b)(1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)氨基)-8-氮杂二环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁基酯

在20℃下向甲醇钠(2.4g,44.5mmol)于MeOH(30mL)中的溶液中添加先前步骤的产物(2.0g,4.45mmol)。将反应混合物在密封管中在100℃下搅拌8h。将反应混合物与试验规模运行的产物合并，将其倒入水(30mL)中，并用EtOAc(3×50mL)萃取。用盐水(2×30ml)洗涤有机层，经Na₂SO₄干燥，过滤并在真空中浓缩。通过制备型HPLC(Daiso 250×50mm 10μm,80mL/min,30-55％ACN+0.1％TFA/ACN)纯化残余物，以得到白色固体状标题中间体(0.7g,32％产率)。C₂₁H₃₁N₇O₄的(m/z):[M+H]⁺计算值为446.24，实验值为446.2。

(c)(3-((2-(((1R,3s,5S)-8-氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇

将先前步骤的产物(0.7g,1.57mmol)于4M HCl于EtOAc(20mL)中的溶液在20℃下搅拌2h，并在真空中浓缩以提供白色固体状标题化合物的HCl盐(0.6g,99％产率)。C₁₆H₂₃N₇O₂的(m/z):[M+H]⁺计算值为346.19，实验值为346.2。

制备3：(1R,3s,5S)-3-(甲基氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁基酯

(a)(1R,3s,5S)-3-(((苄氧基)羰基)氨基)-8-氮杂二环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁基酯

将(1R,3s,5S)-3-氨基-8-氮杂二环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁基酯(5.21g,23.00mmol)、DMF(115ml)和三乙胺(6.41mL,46.0mmol)的溶液在室温下搅拌15min。逐滴添加氯甲酸苄基酯(3.56mL,25.3mmol)并将反应混合物在室温下搅拌3h，用水淬灭，并用EtOAc(4×20mL)萃取。用盐水(2×20mL)洗涤合并的有机部分，经硫酸钠干燥，过滤，并浓缩，以得到黄色油状物，通过柱色谱(120g柱；于己烷中的0-70％EtOAc)对其进行纯化，以得到粘稠、澄清油状标题中间体(3.79g,36％产率；79％纯度)。C₂₀H₂₈N₂O₄的(m/z):[M+H]⁺计算值为361.20，实验值为361.2。

(b)(1R,3s,5S)-3-(((苄氧基)羰基)(甲基)氨基)-8-氮杂二环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁基酯

使先前步骤的产物(2.99g,8.29mmol)于DMF(41.5mL)中的溶液冷却到0℃，且一次性添加氢化钠于矿物油中的60％分散液(0.398g,16.58mmol)。将所得悬浮液在0℃下搅拌15min，且然后逐滴添加碘甲烷(1.03mL,16.58mmol)，并将所得浑浊、浅黄色混合物在0℃下搅拌15min，使其升温到室温并搅拌2h。用水淬灭反应混合物并用EtOAc(4×20mL)萃取。用盐水(2×20mL)洗涤合并的有机部分，经硫酸钠干燥，过滤，并浓缩，以得到澄清、浅黄色油状物，通过柱色谱(80g柱；于己烷中的0-70％EtOAc)对其进行纯化，以得到澄清、无色粘稠油状标题中间体(2.07g,65％产率；97％纯度)。C₂₁H₃₀N₂O₄的(m/z):[M+H]⁺计算值为375.22，实验值为375.5。

(c)(1R,3s,5S)-3-(甲基氨基)-8-氮杂二环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁基酯

向100mL烧瓶中添加碳载10wt％钯(0.577g,0.542mmol)。将所述物质暴露于氮且然后通过吸量管缓慢添加先前步骤的产物(1.015g,2.71mmol)于MeOH(54.2mL)中的溶液。附接氢气球。将烧瓶抽真空并用氢回填三次，之后使气氛对H₂气体完全开放。将反应混合物在室温下搅拌16h，通过

过滤，并浓缩，以得到澄清油状物，通过柱色谱(40g柱；于DCM中的0-100％MeOH)对其进行纯化，以得到澄清油状产物。用10:1MeOH:TEA冲洗柱。浓缩滤液以提供具有白色固体的粘稠、澄清油状物，将所述油状物溶解于EtOAc中，过滤，将其与澄清油状产物合并且浓缩以提供标题中间体(0.559g,86％产率)，C₁₃H₂₄N₂O₂的(m/z):[M+H]⁺计算值为241.18，实验值为241.3。

制备4：(3-((2-(((1R,3s,5S)-8-氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)(甲基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇

(a)(1R,3s,5S)-3-((4-氯-6-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-8-氮杂二环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁基酯

将(3-((2,6-二氯嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇(200mg,0.77mmol)、(1R,3s,5S)-3-(甲基氨基)-8-氮杂二环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁基酯(194mg,0.81mmol)和TEA(0.29mL,1.92mmol)的溶液在60℃下在DMSO(5mL)中搅拌过夜。在真空中浓缩反应混合物。通过反相色谱纯化粗制残余物，以得到标题中间体(143mg,0.31mmol,40％产率)，其直接用于下一步骤中。

(b)(3-((2-(((1R,3s,5S)-8-氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)(甲基)氨基)-6-氯嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇

向溶解于ACN(3.0mL)中的先前步骤的产物(143mg,0.31mmol)中添加于二噁烷中的4N HCl(1.156mL 4.62mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌30min。在真空中浓缩反应混合物以提供标题中间体的HCl盐，其未经纯化即用于下一步骤中。

(c)(3-((2-(((1R,3s,5S)-8-氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)(甲基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇

向先前步骤的产物(112mg,0.280mmol)于MeOH(5mL)中的搅拌溶液中添加于MeOH中的50％甲醇钠(0.960mL,8.39mmol)。将反应混合物在密封小瓶中在80℃下加热过夜。在真空中浓缩反应混合物并通过反相色谱纯化粗制残余物，以得到标题产物(27mg,0.057mmol,20％产率)。

制备5：(3-((2-(((1R,3s,5S)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇

(a)(1R,3s,5S)-3-((4-氯-6-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬烷-9-甲酸叔丁基酯

在氮下向(3-((2,6-二氯嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇(3.7g,14.2mmol)和(1R,3s,5S)-3-氨基-9-氮杂二环[3.3.1]壬烷-9-甲酸叔丁基酯(4.1g,17.0mmol)于DMSO(37mL)中的混合物中添加DIPEA(3.7g,28.4mmol)。将反应物在120℃下搅拌12h，倒入水(80mL)中，用EtOAc(3×100mL)萃取，干燥，并浓缩以提供粗产物，用EtOAc(20mL)对其进行洗涤，以得到白色固体状标题中间体(3.8g,56％产率)。

(b)(1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬烷-9-甲酸叔丁基酯

平行实施四个反应。在密封管中将先前步骤的产物(0.95g,2.0mmol)于MeOH(10mL)中的甲醇钠中的混合物在120℃下搅拌3h。将反应混合物添加到水(50mL)中并用EtOAc(3×50mL)萃取。用盐水(30mL)洗涤有机层，经Na₂SO₄干燥，并在真空中浓缩。通过制备型HPLC(Luna C18 250×50mm 10μm,ACN+0.1％TFA/ACN)纯化残余物以获得褐色固体状标题中间体(1.2g合并的产物，28％产率)。C₂₂H₃₃N₇O₄的(m/z):[M+H]⁺计算值为460.26，实验值为460.3。

(c)(3-((2-(((1R,3s,5S)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇

向先前步骤的产物(1.2g,2.5mmol)中添加于EtOAc(50mL)中的4M HCl。将反应物在25℃下搅拌2h。将残余物与制备的产物以1.5mmol规模合并且浓缩以提供浅黄色固体状标题中间体(2.0g,100％产率)。C₁₇H₂₅N₇O₂的(m/z):[M+H]⁺计算值为360.43，实验值为360.4。

制备6：(3-((2-(((1R,3s,5S)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)(甲基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇

(a)(1R,3s,5S)-3-((4-氯-6-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬烷-9-甲酸叔丁基酯

在氮下向(3-((2,6-二氯嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇(6.5g,24.9mmol)、(1R,3s,5S)-3-(甲基氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬烷-9-甲酸叔丁基酯(6.9g,27.4mmol)于DMSO(80mL)中的混合物中添加DIPEA(6.4g,49.8mmol)。将反应混合物在120℃下搅拌8h，倒入水(80mL)中，用EtOAc(500mL)萃取，干燥，并浓缩以提供粗产物。将粗产物与相同规模的单独制备的产物合并且通过制备型HPLC(Daiso 150×25mm5μm,80mL/min,35-60％ACN+0.1％TFA/ACN)纯化，以提供浅黄色固体状标题中间体(16.0g,64％产率)。C₂₂H₃₂ClN₇O₃的(m/z):[M+H]⁺计算值为478.23，实验值为478.2。

(b)(1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬烷-9-甲酸叔丁基酯

向先前步骤的产物(2.0g,4.19mmol)于MeOH(20mL)中的混合物中添加甲醇钠(2.2g,41.9mmol)。将反应混合物在120℃下搅拌6h，在密封管中保持12h，倒入水(100mL)中，用EtOAc(800mL)稀释，用盐水(50mL)洗涤，干燥，并浓缩以提供粗产物。将粗产物与2mmol规模的单独制备的产物合并且通过制备型HPLC(Synergi Max-RP,250×50mm 10μm,80mL/min,25-50％ACN+0.1％TFA/ACN)纯化以提供白色固体状标题中间体(2.1g,71％产率)。

(c)(3-((2-(((1R,3s,5S)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)(甲基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇

向先前步骤的产物(2.1g,4.43mmol)于EtOAc(20mL)中的混合物中添加于EtOAc(20mL)中的4M HCl，并将反应物在20℃下搅拌3h并浓缩，以提供白色固体状产物的HCl盐(2.0g,100％产率)。C₁₈H₂₇N₇O₂的(m/z):[M+H]⁺计算值为374.22，实验值为374.1。

实例1：1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-8-氮杂二环[3.2.1]辛-8-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈

向(3-((2-((1R,3s,5S)-8-氮杂二环[3.2.1]辛-3-基(甲基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇(15mg,0.042mmol)于DMF(4.0mL)中的溶液中相继添加DIPEA(0.022ml,0.125mmol)和3-氰基-1-氮杂环丁烷磺酰氯(7.54mg,0.042mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。在真空中去除溶剂并通过反相HPLC纯化粗残余物以提供标题化合物的TFA盐(3.2mg)。C₂₁H₂₉N₉O₄S的(m/z):[M+H]⁺计算值为504.21，实验值为504.1。

实例2：1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈

在0℃下向(3-((2-(((1R,3s,5S)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)(甲基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇HCl(150mg,0.402mmol)和DIPEA(0.351mL,2.008mmol)于DMF(3mL)中的溶液中添加3-氰基-1-氮杂环丁烷磺酰氯(72.5mg,0.402mmol)并将反应混合物在0℃下搅拌10min且然后在室温下搅拌15h。在真空中浓缩反应混合物，得到红色液体，通过制备型HPLC对其进行纯化，得到白色固体状标题化合物的TFA盐(72.4mg,0.115mmol,28.5％产率)。C₂₂H₃₁N₉O₄S的(m/z):[M+H]⁺计算值为518.22，实验值为518。

实例3：(3-((6-甲氧基-2-(甲基((1R,3s,5S)-9-(甲基磺酰基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇

使(3-((2-(((1R,3s,5S)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)(甲基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇HCl(250mg,0.669mmol)于DMF(7.0mL)中的溶液冷却到0℃，且一次性添加DIPEA(0.35mL,2.008mmol)，随后逐滴添加甲磺酰氯(0.053mL,77mg,0.676mmol)。将反应混合物搅拌过夜，将其溶解于1:1乙酸:水(6mL)中，过滤，并通过制备型HPLC纯化以提供白色粉末状标题化合物的TFA盐(94mg,31％产率)。C₁₉H₂₉N₇O₄S的(m/z):[M+H]⁺计算值为452.15，实验值为452.2。

实例4：(3-((6-甲氧基-2-(((1R,3s,5S)-9-((2-甲氧基乙基)磺酰基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)(甲基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇

使(3-((2-(((1R,3s,5S)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)(甲基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇HCl(250mg,0.703mmol)于DMF(7.0mL)中的溶液冷却到0℃并一次性添加DIPEA(0.35mL,2.008mmol)，随后逐滴添加2-甲氧基-乙磺酰氯(111mg,0.676mmol)。将反应混合物搅拌过夜，将其溶解于1:1乙酸:水(6mL)中，过滤，并通过制备型HPLC纯化以提供白色固体状标题化合物的TFA盐(41mg,12％产率)。C₂₁H₃₃N₇O₅S的(m/z):[M+H]⁺计算值为496.23，实验值为496.2。

实例5：3-((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-8-氮杂二环[3.2.1]辛-8-基)-丙腈

向(3-((2-((1R,3s,5S)-8-氮杂二环[3.2.1]辛-3-基(甲基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇(15mg,0.042mmol)于MeOH(4.0mL)中的溶液中相继添加DIPEA(0.022mL,0.125mmol)和丙烯腈(2.70μL,0.042mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，在真空中浓缩并通过反相HPLC纯化以提供标题化合物的TFA盐(4.3mg)。C₂₀H₂₈N₈O₂的(m/z):[M+H]⁺计算值为413.23，实验值为413.2。

实例6：5-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)甲基)吡啶甲腈

将二异丙胺(0.032mL,0.225mmol)(0.256mL)添加到(3-((2-(((1R,3s,5S)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇(29.8mg,0.075mmol)于DMF中的0.15M溶液中并使溶液涡旋以溶解所有材料。向溶液中添加4-(氯甲基)-吡啶甲腈)(0.5mL,34mg,0.113mmol)于DMF中的0.23M溶液并将反应混合物在室温下搅拌过夜。添加聚苯乙烯-苯硫酚树脂(0.115g,0.150mmol)，将反应混合物在室温下搅拌4h并过滤。用DMF(0.5mL)洗涤反应器皿并合并洗涤液，通过旋转蒸发浓缩，将其溶解于1:1乙酸:水中，过滤，并通过反相HPLC纯化以提供标题化合物的TFA盐(6.4mg)。C₂₄H₂₉N₉O₂的(m/z):[M+H]⁺计算值为476.24，实验值为476.1。

实例7：5-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)甲基)烟碱甲腈

将(3-((2-(((1R,3s,5S)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)(甲基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇HCl(20mg,0.054mmol)、5-(溴甲基)烟碱甲腈(10.55mg,0.054mmol)和碳酸钾(22.20mg,0.161mmol)的溶液在DMF(6.0mL)中在60℃下搅拌过夜。在真空中浓缩反应混合物并通过反相HPLC纯化以提供标题中间体的TFA盐(3.7mg)。C₂₅H₃₁N₉O₂的(m/z):[M+H]⁺计算值为490.26，实验值为490.2。

实例8：(1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬烷-9-甲酸异丁基酯

在0℃下向(3-((2-((1R,3s,5S)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基(甲基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇HCl(25mg,0.061mmol)和DIPEA(42.6μL,0.244mmol)于DMF(305μL)中的溶液中逐滴添加于DMF(305μL)中的氯甲酸异丁基酯(10mg,0.073mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌5min且然后使温度达到室温。24h后，浓缩反应混合物，将其溶解于1:1ACN:水中并通过反相HPLC纯化以提供标题化合物的TFA盐(6.4mg)。C₂₃H₃₅N₇O₄的(m/z):[M+H]⁺计算值为474.28，实验值为474.2。

实例9：2,2-二氟-1-((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)乙-1-酮

将HATU(0.029g,0.077mmol)添加到2,2-二氟乙酸(6.72mg,0.070mmol)于DMF(3mL)中的溶液中并将反应混合物在室温下搅拌5min以制备0.14M经活化酸的溶液。将0.14M经活化酸的溶液(0.5mL,0.070mmol)添加到(3-((2-(((1R,3s,5S)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)(甲基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇HCl(29mg,0.070mmol)和DIPEA(0.049mL,0.280mmol)于DMF中的溶液中并将反应混合物在室温下搅拌30min，在真空中浓缩并将所得残余物溶解于1:1乙酸:水中并通过反相HPLC纯化以提供标题化合物的TFA盐(3.9mg)。C₂₀H₂₇N₇O₃的(m/z):[M+H]⁺计算值为452.21，实验值为452.1。

使用类似合成方法，制备表1-3的化合物。

表1

表2

表3

实例10：1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈

(a)5-(((三异丙基硅基)氧基)甲基)-1H-吡唑-3-胺(3')

向100mL烧瓶中添加(3-氨基-1H-吡唑-5-基)甲醇(5.8g,51.3mmol)、1-甲基-2-吡咯烷酮(58.0mL)和咪唑(4.54g,66.7mmol)，随后添加三异丙基氯硅烷(11.95mL,56.4mmol)。将反应混合物在22℃下搅拌过夜且然后添加EtOAc(145mL)和水(145mL)。分离各层并用水(145mL)和盐水(15％,100mL)洗涤有机层，经Na₂SO₄干燥，并在减压下蒸发，以提供标题中间体(13.33g,49.5mmol,96％产率)HPLC方法A滞留时间19.00min。

(b)(1R,3s,5S)-3-((4-氯-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬烷-9-甲酸叔丁基酯(9')

向2,4-二氯-6-甲氧基嘧啶(20g,112mmol)和(1R,3s,5S)-3-(甲基氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬烷-9-甲酸叔丁基酯(36.9g,145mmol)于THF(300mL)中的混合物中添加DIPEA(39.0mL,223mmol)并将反应混合物在20-25℃下搅拌过夜。添加额外(1R,3s,5S)-3-(甲基氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬烷-9-甲酸叔丁基酯(4.26g,16.76mmol)并使反应混合物升温到55℃，搅拌2.5h，冷却到室温并搅拌2d。经30min添加庚烷(400mL)并过滤反应混合物。将液相与IPA(300mL，然后200mL)共沸到约200-300mL，在5℃下搅拌过夜，并过滤，以得到标题中间体(29.2g,71.4mmol,63.9％产率)。HPLC方法A滞留时间28.27min。

(c)(1R,3s,5S)-3-((4-甲氧基-6-((5-(((三异丙基硅基)氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬烷-9-甲酸叔丁基酯(7')

向250mL烧瓶中添加先前步骤的产物(9')(8g,20.16mmol)、步骤(a)的产物(3')(6.79g,25.2mmol)、Cs₂CO₃(13.13g,40.3mmol)、Xphos Pd G2(0.793g,1.008mmol)和XPhos(0.480g,1.008mmol)，将反应混合物脱气三次并添加1,4-二噁烷(80mL)和水(8.00mL)以得到悬浮液。在真空和氮下将反应混合物脱气三次并将其加热到100℃，回流过夜，并冷却到35℃。添加

硫醇官能化的二氧化硅(4g)并使反应混合物升温到65℃，搅拌2h，冷却到50℃并通过

(5g)过滤。添加水(200mL)和乙酸异丙酯(200mL)，分离各层，并用20％NaHSO₃洗涤有机层。分离各层，并用盐水洗涤有机层。再次分离各层，并用EtOAc(300mL)萃取水层。将合并的有机层经Na₂SO₄干燥并蒸发以提供粗产物(约20g)。添加甲醇(50mL)并在室温下搅拌反应混合物，过滤并用甲醇(10mL)洗涤以去除固体，以得到甲醇溶液形式的标题化合物，其直接用于下一步骤中。HPLC方法A：滞留时间16.05min。

(d)(3-((2-(((1R,3s,5S)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)(甲基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇(1)

向250mL烧瓶中添加于甲醇(50mL)中的先前步骤粗产物(7')(12.68g,20.136mmol)和于CPME中的3M HCl(67.1mL,201mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌2h，并过滤，以得到粗制标题化合物的3HCl盐(4.8g,9.94mmol,49.4％产率)。

向烧瓶中添加上述粗制3HCl盐(2g,4.14mmol)，随后添加水(30mL)和SiliaMetS硫醇官能化的二氧化硅40％w/w(0.8g,4.14mmol)，并使反应混合物升温到65℃，搅拌16h，通过Celite过滤并用水(1.5mL)洗涤。添加丙酮(120mL)并将反应混合物在室温下搅拌过夜，过滤，用丙酮(10mL)洗涤并在真空中在50℃下干燥以提供经纯化的标题化合物的3HCl盐(1.05g,2.175mmol,52.5％产率)。HPLC方法A：滞留时间10.09min。

(e)1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈

向小瓶中添加先前步骤的产物(1)(0.83g,1.719mmol)和NMP(8.3mL)，随后添加TEA(1.44mL,10.31mmol)。将反应混合物搅拌5-10min。在22℃下添加3-氰基氮杂环丁烷-1-磺酰氯(0.466g,2.58mmol)。2h后，经30min添加水(25mL)并将反应混合物搅拌22h。过滤反应混合物并用水(2mL)洗涤，以得到白色固体状标题产物(0.9g,1.704mmol,99％产率)。HPLC方法A：滞留时间16.18min。

实例11：1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈结晶型I

向100mL烧瓶中添加1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((3-(羟基甲基)-1H-吡唑-5-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈(1g,1.932mmol)和DMF(3.00mL)，随后添加丙酮(4mL)。然后经5min添加水(6mL)并将反应混合物搅拌过夜并过滤，并用水和丙酮洗涤固体，并干燥30min以提供标题化合物(0.94g,1.816mmol,94％产率)。HPLC方法A：滞留时间16.30min。

实例12：1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈结晶型I

向20L烧瓶中添加(3-((2-(((1R,3s,5S)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)(甲基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇(1)(1.20kg,2.69mol)、NMP(4.8kg)和TEA(1.36kg,13.45mol)并将反应混合物在室温下搅拌2h。然后，添加NMP(2.4kg)并搅拌反应混合物并经约1h使其冷却到5-10℃。分三批添加3-氰基氮杂环丁烷-1-磺酰氯(0.58kg,3.23mol)，每0.5h添加一批，并将反应混合物搅拌2h并使其升温到室温。添加甲醇(4.2kg)，将反应混合物搅拌0.5h。经3h添加水(21.6kg)并将反应混合物搅拌0.5h并过滤。用甲醇(1.0kg)冲洗固体，以得到粗制标题化合物(1.33kg)，将所述粗制标题化合物中的1.20kg溶解于NMP(3.6kg)中。添加丙酮(3.8kg)，过滤溶液并在搅拌下将滤液加热到45-55℃。经6h添加水(6.6kg)并搅拌混合物，使其冷却到25-30℃并过滤。用4:5.5丙酮:水(1.5L)冲洗固体并干燥以提供标题化合物(1.21kg,99％纯度，85％产率)HPLC方法B：滞留时间15.23min。使用空气喷射研磨工艺将产物微粉化成下列粒径分布：X₁₀＝0.70μm、X₅₀＝2.17μm和X₉₀＝6.15μm，其中X_n定义为小于n％的粒子的百分比。

实例13：1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈结晶型II

向烧瓶中添加1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈(16g,30.9mmol)和DMF(160mL)，并过滤反应混合物。经30min向溶液中添加水(480mL)并使反应混合物升温到65℃，将其搅拌过夜，使其冷却到室温，将其搅拌20h，并过滤。将固体干燥过夜，以得到标题中间体(11.8g,22.80mmol,73.8％产率)。HPLC方法A：滞留时间16.19min。

实例14-16：本发明的固体形式的性质

通过粉末X射线衍射(PXRD)、差示扫描量热(DSC)、热重分析(TGA)和动态水分吸附(DMS)分别分析实例12和13的1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈的形式I和形式II结晶游离碱的试样。

实例14粉末X射线衍射

图1和5的粉末X射线衍射图案是利用布鲁克(Bruker)D8-Advance X射线衍射仪使用Cu-Kα辐射

利用45kV的输出电压和40mA的电流获得。所述仪器是以布拉格-布伦塔(Bragg-Brentano)几何结构操作且入射狭缝、发散狭缝和散射狭缝经设定以最大化试样处的强度。为进行测量，将少量粉末(5-25mg)轻轻地按压到试样固持器上以形成光滑表面并使其经受X射线曝光。以2θ-2θ模式自2°2θ至35°2θ以0.02°的步长和0.30°秒/步的扫描速度扫描试样。通过布鲁克DiffracSuite测量软件控制数据采集并通过Jade软件(版本7.5.1)进行分析。利用刚玉标准品在±0.02°2θ角度内校准仪器。针对结晶型I和结晶型II所观察到的PXRD 2θ峰位置和d-间距分别显示于表4和5中。将表4中所列示的形式I微粉化材料的2θ峰位置与通过相同合成工艺制备的未微粉化的试样的峰位置相比较。在2θ峰位置观察到的最大差异为0.04度。

表4：结晶型I的PXRD数据

表5：结晶型II的PXRD数据

实例15：热分析

使用具有Thermal Analyst控制器的TA仪器(TA Instruments)型号Q-100模块来进行差示扫描量热(DSC)。收集数据并使用TA仪器热分析软件(TA Instruments ThermalAnalysis software)进行分析。将每一结晶型的试样精确地称重到经覆盖的铝盘中。在5℃下5分钟的等温平衡时段之后，使用10℃/min的线性加热斜坡将试样自0℃加热到300℃。本发明的形式I和形式II结晶游离碱的代表性DSC温度记录图分别显示于图2和6中。

使用配备有高分辨能力的TA仪器型号Q-50模块来进行热重分析(TGA)测量。使用TA仪器Thermal Analyst控制器收集数据并使用TA仪器通用分析软件(TA InstrumentsUniversal Analysis software)进行分析。将经称重试样置于铂盘上并以10℃的加热速率自环境温度到300℃进行扫描。在使用期间用氮流吹扫平衡和炉室。本发明的形式I和形式II结晶游离碱的代表性TGA迹线显示于图3和7中。

实例16：动态水分吸附评价

使用VTI大气微量天平、SGA-100系统(VTI公司，佛罗里达州海厄利亚(Hialeah,FL)33016)进行动态水分吸附(DMS)测量。使用经称重试样且湿度在开始分析时是最低可能值(接近0％RH)。DMS分析由以下组成：初始120分钟的干燥步骤(0％RH)，随后两个在5％RH到90％RH的湿度范围内利用5％RH/步的扫描速率的吸附和解吸附循环。在25℃下以等温方式进行DMS运行。本发明的形式I和形式II结晶游离碱的代表性DMS迹线分别显示于图4和8中。

生物分析

在下列生物分析中的一或多者中表征本发明的化合物。

分析1：生物化学JAK和脱靶激酶分析

在常用激酶反应缓冲液(50mM HEPES,pH 7.5、0.01％Brij-35、10mM MgCl₂和1mMEGTA)中实施一组四种LanthaScreen JAK生物化学分析(JAK1、2、3和Tyk2)。重组的带GST标签的JAK酶和带GFP标签的STAT1肽底物是自生命技术(Life Technologies)获得。

将连续稀释的化合物与四种JAK酶中的每一者和底物在环境温度下在白色384孔微量板(康宁(Corning))中预培育1h。随后添加ATP以具有1％DMSO的10μL总体积起始激酶反应。JAK1、2、3和Tyk2的最终酶浓度分别为4.2nM、0.1nM、1nM和0.25nM；所使用的相应KmATP浓度为25μM、3μM、1.6μM和10μM；同时所有四种分析的底物浓度为200nM。在环境温度下使激酶反应继续进行1小时，之后添加EDTA(10mM最终浓度)和Tb-抗pSTAT1(pTyr701)抗体(生命技术，2nM最终浓度)于TR-FRET稀释缓冲液(生命技术)中的10μL制剂。将各板在环境温度下培育1h，之后在远景(EnVision)读数器(珀金埃尔默)上读取。记录发射比信号(520nm/495nm)且使用其基于DMSO和背景对照来计算抑制百分比值。

为进行剂量-反应分析，绘制抑制百分比数据对化合物浓度的图形，且利用Prism软件(格拉夫派得软件(GraphPad Software))自4-参数稳健拟合模型来测定IC₅₀值。结果表示为pIC₅₀(IC₅₀的负对数)且随后使用郑-普鲁萨福(Cheng-Prusoff)等式将其转化成pKi(解离常数的负对数，Ki)。

在四种JAK分析中的每一者中具有较高pKi值的测试化合物显示较大的JAK活性抑制。在此分析中测试的本发明化合物通常展现介于约7.5与约10.3之间的pKi值。

使用类似方法利用自生命技术获得的重组酶和在埃拿斯派克(AnaSpec)合成的生物素化肽底物研发一组脱靶酪氨酸激酶分析(ABL1、Flt3、RET、FGFR2、NTRK1和pDGFRβ)。所有分析都在环境温度下以100μM的最终ATP浓度实施。检测试剂(包括Eu-抗磷酸酪氨酸(pY20)抗体和SureLight APC-SA)是购自珀金埃尔默。记录发射比信号(665nm/615nm)并利用其进行数据分析，且最终结果表示为pIC₅₀。在此分析中测试的所选化合物通常展现介于约5与约6.5之间的pIC₅₀值。

分析2：细胞JAK功效分析：IL-13的抑制

通过在HT-29人类结肠直肠腺癌细胞(ATCC)中测量IL-13(IL-13，研究与开发系统(R&D Systems))诱导的STAT6磷酸化来评价测试化合物于抑制JAK依赖性细胞因子白介素-13(IL-13)的功效。

将抗STAT6抗体(细胞信号传导技术(Cell Signaling Technologies))偶联到AlphaScreen受体珠粒(珀金埃尔默)，同时使用EZ连接的磺基-NHS-生物素(赛默飞世尔科技(Thermo Scientific))生物素化抗pSTAT6(pTyr641)抗体(细胞信号传导技术)。

使HT-29细胞在37℃下在5％CO₂增湿培育器中在补充有10％FBS(海克隆(Hyclone))、100U/mL青霉素(penicillin)、100μg/mL链霉素(streptomycin)(生命技术)和2mM GlutaMAX(生命技术)的McCoy’s 5a改良培养基(ATCC)中生长。在分析的第1天，将细胞以7,500个细胞/孔的密度接种于具有25μL培养基的白色聚-D-赖氨酸涂布的384孔板(康宁)中，并使其在培育器中粘附过夜。在分析的第2天，去除培养基并更换为12μL含有测试化合物的剂量反应的分析缓冲液(汉克氏平衡盐溶液(Hank's Balanced Salt Solution)/HBSS、25mM HEPES和1mg/ml牛血清白蛋白/BSA)。在DMSO中连续稀释化合物且然后在培养基中再稀释1000倍以使最终DMSO浓度达到0.1％。将细胞与测试化合物一起在37℃下培育1h，且随后添加12μL预热的IL-13(12ng/ml于分析缓冲液中)用于刺激。在37℃下培育30min之后，去除分析缓冲液(含有化合物和IL-13)，且10μL细胞溶解缓冲液(25mM HEPES、0.1％SDS、1％NP-40、5mM MgCl₂、1.3mM EDTA、1mM EGTA，且添加补充有来自罗氏诊断(RocheDiagnostics)的完全超迷你蛋白酶抑制剂和PhosSTOP)。将各板在环境温度下振荡30min，之后添加检测试剂。首先添加生物素-抗pSTAT6和抗STAT6偶联的受体珠粒的混合物并在环境温度下培育2h，随后添加链霉抗生物素蛋白偶联的供体珠粒(珀金埃尔默)。在最短2h的培育之后，在远景读板仪上读取分析板。记录AlphaScreen发光信号且使用其基于DMSO和背景对照来计算抑制百分比值。

为进行剂量-反应分析，绘制抑制百分比数据对化合物浓度的图形，且利用Prism软件自4-参数稳健拟合模型来测定IC₅₀值。结果表示为IC₅₀值的负对数(pIC₅₀)。

在此分析中具有较高pIC₅₀值的测试化合物显示较大的IL-13诱导的STAT6磷酸化的抑制。在此分析中测试的本发明化合物通常展现介于约6.0与约7.8之间的pIC₅₀值。

分析3：JAK细胞毒性分析

在正常生长条件下在BEAS-2B人类肺上皮细胞(ATCC)中实施CellTiter-Glo发光细胞活力/细胞毒性分析。

使细胞在37℃下在5％CO₂增湿培育器中在补充有10％FBS(海克隆)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素(生命技术)和2mM GlutaMAX(生命技术)的50％DMEM/50％F-12培养基(生命技术)中生长。在分析的第1天，将细胞以500个细胞/孔的密度接种于具有25μL培养基的白色384孔组织培养板(康宁)中，并使其在培育器中粘附过夜。在分析的第2天，添加5μL含有测试化合物的剂量反应的培养基，并在37℃下培育48h。随后添加30μL CellTiter-Glo检测溶液(普洛麦格(Promega))，在定轨振荡器上混合5min，并将其再培育10min，之后在远景读数器上读取。记录发光信号并计算DMSO对照百分比的值。

为进行剂量-反应分析，通过线式连接每一数据点绘制DMSO对照百分比数据对化合物浓度的图形以导出剂量-反应曲线。将每一曲线与15％抑制阈值相交的浓度定义为CC₁₅。结果表示为CC₁₅值的负对数(pCC₁₅)。

预计在此分析中展现较低pCC₁₅值的测试化合物不太可能引起细胞毒性。在此分析中测试的本发明的化合物通常展现小于5与约6之间的pCC₁₅值。

体外分析结果

在上述分析中的一或多者中测试实例1到9和表1到3的所有化合物。由于发现了JAK1酶功效且将其理解为可预测分析2中所述的细胞功效，因此某些化合物的酶表征限于JAK1酶。

在下表6中，对于JAK1、JAK2、JAK3和TYK2酶分析，A代表pK_i值≥10(K_i≤0.1nM)，B代表pK_i值在9与10之间(K_i在1nM与0.1nM之间)，C代表pK_i值在8与9之间(K_i在10nM与1nM之间)，且D代表pK_i值在7.5与8之间(K_i在31.6nM与10nM之间)。对于THP-1功效分析，A代表pIC₅₀值≥7.5(IC₅₀≤32nM)，B代表pIC₅₀值在6.7与7.5之间(IC₅₀在200nM与32nM之间)，且C代表pIC₅₀值在6与6.7之间(IC₅₀在1μM与200nM之间)。

表6

分析4：细胞JAK功效分析：在CD3+T细胞中IL-4刺激的pSTAT6的抑制

使用流式细胞术在自人类全血(史丹福血液中心(Stanford Blood Center))分离的人类末梢血单核细胞(PBMC)中的CD3阳性(CD3+)T细胞中测量测试化合物抑制白介素-4(IL-4)刺激的STAT6磷酸化的功效。由于IL-4通过JAK进行信号传导，因此此分析提供JAK细胞功效的量度。

使用藻红素(PE)偶联的抗CD3抗体(克隆UCHT1，碧迪生物科学(BD Biosciences))鉴别CD3+T细胞，同时使用Alexa Fluor 647偶联的抗pSTAT6抗体(pY641，克隆18/P，碧迪生物科学)来检测STAT6磷酸化。

使用聚蔗糖梯度自健康供体的人类全血分离人类末梢血单核细胞(PBMC)。在37℃、5％CO₂增湿培育器中在补充有10％热失活的胎牛血清(FBS，生命技术)、2mM Glutamax(生命技术)、25mM HEPES(生命技术)和1×青霉素/链霉素(生命技术)的RPMI(生命技术)中培养细胞。将细胞以250,000个细胞/孔接种于培养基(200μL)中，将其培养1h，且然后重悬浮于含有不同浓度的测试化合物的分析培养基(50μL)(补充有0.1％牛血清白蛋白(西格玛)、2mM Glutamax、25mM HEPES和1×Penstrep的RPMI)中。在DMSO中连续稀释化合物且然后在分析培养基中再稀释500倍(到2×最终分析浓度)。将测试化合物(50μL)与细胞一起在37℃、5％CO₂下培育1h，随后于预热的分析培养基中添加50μL IL-4(研究与开发系统；最终浓度20ng/mL)并保持30min。在细胞因子刺激之后，在37℃、5％CO₂下用预热的固定溶液(100μL)(碧迪生物科学)将细胞固定10min，用FACS缓冲液(1mL)(2％FBS于DPBS中)洗涤两次，并在4℃下将其重悬浮于1000μL冰冷破膜缓冲液III(碧迪生物科学)中并保持30min。用FACS缓冲液将细胞洗涤两次，且然后在室温下在黑暗中将其重悬浮于100μL含有抗CD3PE(1:50稀释)和抗pSTAT6 Alexa Fluor 647(1:5稀释)的FACS缓冲液中并保持60min。在培育之后，将细胞在FACS缓冲液中洗涤两次，之后使用LSRII流式细胞计数器(碧迪生物科学)进行分析。

为测定测试化合物因应IL-4的抑制功效，在CD3+T细胞中测量pSTAT6的中值荧光强度(MFI)。根据MFI对化合物浓度的抑制曲线的分析测定IC₅₀值。数据表示为pIC₅₀(IC₅₀的负十进制对数)值(平均值±标准偏差)。实例2的化合物在此分析中展现约7.3的pIC₅₀值。

分析5：细胞JAK功效分析：IFNγ诱导的pSTAT1的抑制

使用流式细胞术在衍生自于人类全血(史丹福血液中心)的CD14阳性(CD14+)单核细胞中测量测试化合物抑制干扰素γ(IFNγ)刺激的STAT1磷酸化的功效。由于IFNγ通过JAK进行信号传导，因此此分析提供JAK细胞功效的量度。

使用荧光黄异硫氰酸酯(FITC)偶联的抗CD14抗体(克隆RM052，贝克曼库尔特(Beckman Coulter))鉴别单核细胞，且使用Alexa Fluor 647偶联的抗pSTAT1抗体(pY701，克隆4a，碧迪生物科学)来检测STAT1磷酸化。

使用聚蔗糖梯度自健康供体的人类全血分离人类末梢血单核细胞(PBMC)。在37℃、5％CO₂增湿培育器中在补充有10％胎牛血清(FBS，生命技术)、2mM Glutamax(生命技术)、25mM HEPES(生命技术)和1×青霉素/链霉素(生命技术)的RPMI(生命技术)中培养细胞。将细胞以250,000个细胞/孔接种于培养基(200μL)中，将其培育2h并重悬浮于含有不同浓度的测试化合物的分析培养基(50μL)(补充有0.1％牛血清白蛋白(西格玛)、2mMGlutamax、25mM HEPES和1×Penstrep的RPMI)中。在DMSO中连续稀释化合物且然后在培养基中再稀释1000倍以使最终DMSO浓度达到0.1％。将测试化合物与细胞一起在37℃、5％CO₂下培育1h，随后于培养基(50μL)中以0.6ng/mL的最终浓度添加预热的IFNγ(研究与开发系统)并保持30min。在细胞因子刺激之后，在37℃、5％CO₂下用预热的固定溶液(100μL)(碧迪生物科学)将细胞固定10min，用FACS缓冲液(1mL)(于PBS中的1％BSA)将其洗涤两次，将其重悬浮于1:10抗CD14FITC:FACS缓冲液(100μL)中，并将其在4℃下培育15min。将细胞洗涤一次，且然后在4℃下将其重悬浮于冰冷破膜缓冲液III(碧迪生物科学)(100μL)中并保持30min。用FACS缓冲液将细胞洗涤两次，且然后在室温下在黑暗中将其重悬浮于1:10抗pSTAT1 Alexa Fluor 647:FACS缓冲液(100μL)中并保持30min，在FACS缓冲液中洗涤两次，并使用LSRII流式细胞计数器(碧迪生物科学)进行分析。

为测定测试化合物的抑制性功效，在CD14+单核细胞中测量pSTAT1的中值荧光强度(MFI)。根据MFI对化合物浓度的抑制曲线的分析测定IC₅₀值。数据表示为pIC₅₀(IC₅₀的负十进制对数)值(平均值±标准偏差)。实例2的化合物在此分析中展现约7.6的pIC₅₀值。

分析6：插套管的大鼠中的吸收的测定

根据下列两个研究在斯普拉-道来氏大鼠(Sprague Dawley rat)中测定口服生物利用度(F％)、吸收的分数(F_a％)和逃脱肝清除的分数(F_h％)：

(1)在测试化合物的IV投药后大鼠中的药物动力学：在IV投药之后，通常自0hr到6hr收集血浆试样。使用LC-MS-MS方法测定药物水平。使用所得药物水平来计算IV药物动力学参数：AUC IV和剂量IV。

(2)用测试化合物对已在门静脉(PV)以及颈静脉(JV)中插套管的大鼠进行经口投药。在经口投药之后，通常自0hr到6hr自门静脉和颈静脉二者收集血浆试样。使用LC-MS-MS方法测定药物水平。使用所得药物水平来计算下列药物动力学参数：AUC PO PV、AUC PO JV和剂量PO。

使用衍生自上述研究的数据，根据下列各式计算口服生物利用度F％和量F_a％和F_h％：

F％＝(AUC PO JV/AUC IV)*(剂量IV/剂量PO)*100

F_a％＝(AUC PO PV/AUC IV)*(剂量IV/剂量PO)*100

F_h％＝AUC PO JV/AUC PO PV

其中：

AUC PO JV＝在经口投药且自颈静脉收集血浆之后的曲线下面积

AUC PO PV＝在经口投药且自门静脉收集血浆之后的曲线下面积

AUC IV＝在静脉内投药之后的曲线下面积

剂量IV＝静脉内剂量(mg/kg)

剂量PO＝口服剂量(mg/kg)

在此分析中测试实例1到4的化合物且其展现小于约25％的口服生物利用度(F％)。特定来说，实例1、2和4的化合物展现小于约5％的F％值。另外，实例1和2的化合物展现小于约25％的门静脉吸收(F_a％)，而实例3和4的化合物展现大于40％的F_a％值。

分析7：大鼠中的结肠药物动力学

在0.5％甲基纤维素水溶液中调配测试化合物且通过经口胃管灌食以3.2mg/kg和100mg/kg向斯普拉道来氏大鼠投药。在投药后的多个时间点(通常0.5hr、1hr、3hr、6hr、24hr)，通过心脏穿刺移除血液试样且自大鼠切除完整结肠。以1500×g将血液试样离心15min以收集血浆。用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤结肠，称重，并以在PBS中1:10的稀释均质化。通过LC-MS分析针对在测试矩阵中构造成标准曲线的分析标准品来测定测试化合物的血浆和结肠水平。将结肠对血浆比率测定为结肠AUC(μg hr/g)对血浆AUC(μg hr/g)的比率。实例2的化合物展现在5mg/kg下超过约250和在100mg/kg下超过约1200的结肠对血浆比率。

分析8：小鼠噁唑酮诱发的结肠炎模型

噁唑酮诱发的结肠炎是与人类溃疡性结肠炎具有组织学相似性的实验模型(Heller等人，免疫学，2002,17,629-638)。在所述分析中使用来自哈兰(Harlan)的成年BALB/C小鼠。在第1天，用异氟醚轻微麻醉动物且小心去除肩部之间的毛发，之后缓慢施加噁唑酮(4％,150μL,4:1丙酮:橄榄油调配物)或媒剂溶液用于皮肤敏化。在皮肤敏化后七天，使小鼠禁食过夜，利用异氟醚吸入进行麻醉，并将配备有3.5-F导管且填充有噁唑酮溶液的1mL注射器小心插入小鼠结肠中约4cm。在插入后，将50μL噁唑酮溶液(1％,1:1乙醇:水调配物)极缓慢(经30sec，使用注射泵)注射到结肠中。去除导管且使小鼠保持垂直(头朝下)达2min以确保全部噁唑酮溶液留在结肠内部。在噁唑酮直肠内(IR)攻击前一天开始药物治疗(PO、BID或TID)或媒剂。在噁唑酮直肠内攻击后两天，由治疗盲化实验者根据标准评分评价每一小鼠的疾病活动指数(DAI)：粪便稠度评分(0，正常；2，松散；4，腹泻)，总出血评分(0，不存在；2，染血；4，存在)，和重量损失评分(0，无；1，1％-5％；2，5％-10％；3，10％-20％；4，大于20％)；DAI＝(粪便稠度评分+总出血评分+重量损失评分)的平均值。

在所述分析中测试所选本发明化合物。模型中的效能通过与媒剂治疗的动物的评分相比DAI评分的减小来证明。在噁唑酮模型中在1mg/kg、3mg/kg和/或10mg/kg BID的剂量下，与媒剂治疗的动物相比，实例2和4的化合物展现DAI评分在统计学上显著降低，而实例1的化合物在所述分析中测试的高达10mg/kg BID的剂量下未展现统计学显著的降低。

分析9：在小鼠脾脏天然杀手(NK)细胞中的免疫抑制作用

小鼠脾脏细胞的空乏是免疫抑制的实验模型(库拉兹(Kudlacz)等人，美国移植杂志(Am.J.of Transplantation),2004,4,51-57)。在与噁唑酮诱发的结肠炎模型(分析8)中所用相同的治疗范例之后在小鼠脾脏细胞模型中评价实例2的化合物。

使用来自哈兰的成年雄性Balb/C小鼠(12-14周龄)进行研究。向首次用于实验的小鼠经口投用化合物(1mg/kg、10mg/kg和100mg/kg,BID)和作为阳性对照的托法替尼(tofacitinib)(30mg/kg和60mg/kg,BID)达三天。在最后投药后1h收获脾并将其立即压碎用于细胞亚型染色。在固定之前，将CD19(FITC；B细胞)、CD3e(PE；全T细胞)和DX5(APC；NK细胞)的荧光团标记的抗体与来自每一动物的脾细胞试样一起培育，以容许在流式细胞计数器上进行同时、多亚型％分析。通过Scepter^TM 2.0手持式自动化细胞计数器测量每一动物的总脾细胞的数量。

根据每一亚型的百分比乘以每一动物的总脾细胞来计算淋巴细胞亚型群体(例如脾脏B、T和NK细胞)的绝对数量。使用单因子变异数分析(one way ANOVA)以及邓奈特事后测试(Dunnett’s post hoc test)来比较媒剂组和测试化合物组的脾脏淋巴细胞数量。将α水平设定为p<0.05。每一组的数据呈现为平均值±SEM。

阳性对照托法替尼(30mg/kg和60mg/kg；PO,BID)剂量依赖地且显著地降低脾脏NK细胞计数。在同一研究中，脾脏NK细胞计数在高达100mg/kg(最大测试剂量)的PO(BID)剂量下不受实例2的化合物的影响。使用任一化合物未观察到对B细胞群和T细胞群的治疗效应。

此数据结合在小鼠噁唑酮诱发的结肠炎模型(分析8)中引起显著抗结肠炎效应的1mg/kg最小剂量，容许对实例2的化合物计算出>100的功能治疗指数。

分析10：小鼠和小型猪皮肤中的真皮药物动力学

此分析的目标是测定在暴露于完整小鼠或小型猪皮肤24hr之后测试化合物的表皮、真皮和血浆药物动力学。

将在实例12中制备的化合物1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈调配成0.5％(w/w)乳霜或软膏剂，如分别作为表7中的调配物A或调配物B所述。

在投药前24小时，将暴露至少6cm²(身体表面的约10％)的面积的25g雄性Balb/c小鼠和在单独实验中暴露至少450cm²(身体表面的约10％)的面积的10kg哥廷根(Gottingen)小型猪的背部剃毛。在0时，在异氟醚麻醉之后，将测试化合物以25μL/cm²的剂量施加到小鼠或小型猪的背部。用粘着盖覆盖皮肤以防止化合物损失到笼或垫料。

在暴露24h之后，用肥皂和水轻轻洗涤背部以去除未吸收的药物并将其拍干。在此洗涤之后立即通过心脏穿刺自小鼠和通过静脉穿刺自小型猪抽出血液。然后通过胶带剥离去除外部皮肤(角质层)。在表皮的暴露之后，进行0.5cm钻孔活检。迅速分离表皮和真皮，称重并快速冷冻。在小鼠中在投药后48h和在小型猪中在投药后48h、94h和168h(7天)获得类似试样。

使用卡瑞斯(Covaris)超音波均质器在1:10(w/v)水中均质化表皮和真皮试样。在3体积乙腈中萃取试样并通过LC-MS分析对照标准曲线进行量化。如通过下表8中所显示的血浆、表皮和真皮的药物动力学参数AUC_0-t所证明，在表皮和真皮层中展现显著化合物暴露，而小鼠中的血浆暴露可忽略不计且小型猪中的血浆暴露低于量化限值。

表7

表8

分析11：小鼠中局部TPA诱发的刺激性接触性皮肤炎模型

此分析的目标是评价在急性皮肤炎模型中针对皮肤炎症性病况(例如异位性皮肤炎)研究的测试化合物的抗炎性作用(董(Dong)等人，药理学与实验治疗学杂志(JPharmacol Exp Ther),2013,344,436-446)。

在小鼠中局部真皮施加佛波酯(phorbol ester)12-O-十四烷酰基佛波醇-13-乙酸酯(TPA)造成以早期(2-24h)的水肿和嗜中性粒细胞流入和后期(24-48h)的表皮细胞增殖为特征的炎症性反应(格里菲斯(Griffiths)等人，药剂与作用(Agents and Actions),1988,25,344-351)。在每一耳朵上用媒剂(1:7DMSO:丙酮)或20μL TPA(2.5μg)于媒剂中的溶液对雌性Balb/c小鼠进行局部投与。在TPA投与前30min和TPA投与后15min，将媒剂或于媒剂中30μg、100μg、300μg、1000μg和3000μg的剂量的实例2化合物局部施加到每一耳朵。以TPA施加后6小时的耳朵厚度的变化来评价炎症程度。实例2的化合物展现TPA诱导的耳朵厚度增加的剂量和浓度依赖性抑制。最大统计显著作用是在1000μg剂量下观察到41％抑制。

尽管已参考本发明的具体方面或实施例描述了本发明，但所属领域技术人员将了解，在不背离本发明的真实精神和范围的情况下可作出各种改变或可取代等效内容。另外，根据适用专利法和条例所允许的程度，本文中所引用的所有出版物、专利和专利申请案都以全文引用方式并入本文中，其并入程度如同每个文件个别地以引用方式并入本文中一般。

Claims

1.一种式(I)化合物，

其中

R¹选自：

(a)-S(O)₂R⁴，其中R⁴选自：

杂环基，其含有4到6个环原子，包括一个氮原子，

其中任一杂环基任选地经-CN取代，

C_3-6环烷基，

吡啶基，其中吡啶基任选地经氟取代，和

苯基；

(b)C_1-4烷基，其中C_1-4烷基任选地经-CN、

或

吡啶基取代，其中吡啶基任选地经-CN取代；和

(c)-C(O)R⁵，其中R⁵选自：

C_1-4烷基，其中C_1-4烷基任选地经C_3-6环烷基或经一或两个氟取代，-OC_1-4烷基，

C_3-6环烷基，和

吗啉基；

R²是氢或甲基；

R³是C_1-3烷基；且

n为1或2；

或其医药上可接受的盐。

2.根据权利要求1所述的化合物或医药上可接受的盐，其中R³是甲基。

3.根据权利要求1所述的化合物或医药上可接受的盐，其中R²是甲基。

4.根据权利要求1所述的化合物或医药上可接受的盐，其中n是2。

5.根据权利要求1所述的化合物或医药上可接受的盐，其中R¹选自：

(a)S(O)₂R⁴，其中R⁴选自：

C_1-2烷基，其中C_1-2烷基任选地经-CN、-OCH₃或环丙基取代，氮杂环丁基或吡咯烷基，其中氮杂环丁基任选地经-CN取代，环丙基，

吡啶基，其中吡啶基任选地经氟取代，和

苯基；

(b)C_1-4烷基，其中C_1-4烷基任选地经-CN、

或

吡啶基取代，其中吡啶基任选地经-CN取代；和

(c)C(O)R⁵，其中R⁵选自：

C_1-2烷基，其中C_1-2烷基任选地经环丙基或经一或两个氟取代，

-OC_1-4烷基，

C_3-6环烷基，和

吗啉基。

6.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自：

和其医药上可接受的盐。

7.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是式(II)化合物：

或其医药上可接受的盐。

8.根据权利要求7所述的化合物或医药上可接受的盐，其中R⁴是甲基、乙基、氮杂环丁基、吡咯烷基、环丙基、吡啶基或苯基，其中乙基任选地经甲氧基取代，氮杂环丁基任选地经-CN取代，且吡啶基任选地经氟取代。

9.根据权利要求7所述的化合物，其中所述化合物选自：

3-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基-嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)-磺酰基)丙腈，

(3-((2-(((1R,3s,5S)-9-((环丙基甲基)磺酰基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-3-基)(甲基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑-5-基)甲醇，和

和其医药上可接受的盐。

10.一种化合物，其具有下式：

或其医药上可接受的盐。

11.一种化合物，其具有下式：

12.一种1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈的结晶型，其中所述结晶型的特征在于粉末X射线衍射在8.89±0.20、12.99±0.20、13.44±0.20和20.16±0.20的2θ值处包含衍射峰。

13.根据权利要求12所述的结晶型，其中所述粉末X射线衍射图案的特征进一步在于在选自10.64±0.20、10.99±0.20、15.02±0.20、15.74±0.20、16.47±0.20、20.93±0.20、22.22±0.20和26.25±0.20的2θ值处具有两个或更多个额外衍射峰。

14.根据权利要求12所述的结晶型，其中所述结晶型的特征在于粉末X射线衍射图案中的峰位置与图1中所示图案的峰位置基本上一致。

15.根据权利要求12所述的结晶型，其中所述结晶型的特征在于在10℃/分钟的加热速率下所记录的差示扫描量热迹线显示在235℃与245℃之间的温度下存在吸热热流最大值。

16.根据权利要求15所述的结晶型，其中所述结晶型的特征在于差示扫描量热迹线与图2中所示基本上一致。

17.一种医药组合物，其包含根据权利要求1到11中任一权利要求所述的化合物或根据权利要求12到16中任一权利要求所述的结晶型和医药上可接受的载剂。

18.根据权利要求17所述的医药组合物，其进一步包含一或多种可用于治疗胃肠炎症性疾病的其它治疗剂。

19.一种制备式(I)化合物或其医药上可接受的盐的方法，

其中R¹、R²、R³和n如权利要求1中所定义，所述方法包含：

(a)使式(III)化合物

其中R²、R³和n如权利要求1中所定义，与以下各物反应：

(i)Cl-S(O)₂R⁴，其中R⁴如权利要求1中所定义；

或吡啶基取代，其中吡啶基任选地经-CN取代；

(iii)Cl-C(O)R⁵，其中R⁵如权利要求1中所定义；或

(iv)HO-C(O)R⁵，其中R⁵如权利要求1中所定义；和

(b)任选地形成医药上可接受的盐

以提供式(I)化合物或其医药上可接受的盐。

20.一种式(III)化合物，

其中R²、R³和n如权利要求1中所定义。

21.根据权利要求20所述的化合物，其中R²和R³各自是甲基。

22.一种制备根据权利要求12所述的1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈的结晶型的方法，所述方法包含：

(a)将1-(((1R,3s,5S)-3-((4-((5-(羟基甲基)-1H-吡唑-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)(甲基)氨基)-9-氮杂二环[3.3.1]壬-9-基)磺酰基)氮杂环丁烷-3-甲腈溶解于选自N-甲基吡咯烷酮和二甲基甲酰胺的稀释剂中以形成反应混合物；

(b)向所述反应混合物中添加丙酮和水；和

(c)自所述反应混合物分离所述结晶型。

23.一种根据权利要求1到11中任一权利要求所述的化合物或根据权利要求12到16中任一权利要求所述的结晶型的用途，其用于制造用以治疗哺乳动物的胃肠炎症性疾病的药剂。

24.根据权利要求23所述的用途，其中所述胃肠炎症性疾病是溃疡性结肠炎。

25.根据权利要求23所述的用途，其中所述药剂与一或多种可用于治疗胃肠炎症性疾病的其它治疗剂组合使用。

26.一种根据权利要求1到11中任一权利要求所述的化合物或根据权利要求12到16中任一权利要求所述的结晶型的用途，其用于制造用以治疗哺乳动物的皮肤炎症性疾病的药剂。

27.根据权利要求26所述的用途，其中所述皮肤炎症性疾病是异位性皮肤炎。

28.根据权利要求23所述的用途，其中所述胃肠炎症性疾病是克罗恩病。