CN109055543A - 预测失重骨丢失髋关节骨密度下降风险的方法与dna甲基化标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供预测失重骨丢失髋关节骨密度下降风险的DNA甲基化标志物，包括一个或多个基因，基因位点注释信息见表3。本发明还提供相应的检测方法。本发明通过对血细胞DNA甲基化水平与骨密度指标的挖掘，发现通过检测血细胞DNA甲基化水平，能够实现对失重后人体髋关节骨密度下降个体差异的预测，从而筛选更加耐受失重条件的个体，或者用于对髋关节骨密度变化情况进行科学研究。本发明中提供了对失重后人体髋关节骨密度下降风险有预测功能的DNA甲基化位点集合，与人体骨代谢的相关性较高。

Description

预测失重骨丢失髋关节骨密度下降风险的方法与DNA甲基化 标志物
技术领域
本发明属于生理学技术领域，涉及失重环境条件一段时间后的生理变化，具体涉及预测失重骨丢失髋关节骨密度下降风险的方法与DNA甲基化标志物。
背景技术
骨密度全称是骨骼矿物质密度(BMD，Bone mineral density)，是骨骼强度的一个绝对值属性的重要指标，其单位为克/每立方厘米。骨密度以双能X射线吸收计量法(Dual-energy X-ray Absorptiometry)(DXA技术)测量的结果较准确，是国际卫生组织(WHO)采用的骨密度金标准。
在临床使用中，骨密度是诊断骨质疏松、预测骨质疏松性骨折风险、监测自然病程以及评价药物干预疗效的最佳定量指标。目前国内外公认骨质疏松症的诊断标准是世界卫生组织推荐的，定义骨密度值降低程度等于和大于2.5个标准差即判定为骨质疏松。载人航天领域，美国国家航空航天局将空间骨丢失为所有风险因素之首。
髋关节骨密度的测量一方面是评价老年髋部骨折危险性的一个重要指标，另一方面，在航天医学领域监测髋关节骨密度，对人体在轨健康风险判定中也具有重要意义。在地面为期90天的-6度头低位卧床实验中，DXA检测发现9名志愿者髋关节骨密度平均下降约为5％(Watanabe Y，2004)。在另一个为期12周的卧床实验中，志愿者髋关节骨密度下降3.8％(Zerwekh JE，1998)。这些结果与美国国家航空航天局在对14名国际空间站机组成员髋关节DXA检测结果类似。机组成员在进行为期4～6个月飞行后髋关节骨密度平均下降幅度为每个月1.5％(LeBlanc A，2000)。总之，骨密度的定量测定为疾病的诊断及不同原因所致的骨矿含量改变都提供了重要诊断依据。
鉴于此，在经受同样的失重/模拟失重条件影响后，人体髋关节骨密度下降水平的差异亦能反映人体对失重条件导致骨丢失耐受程度的个体差异。面向载人航天任务，如能在执行任务前对乘员或受试者在模拟失重条件下的髋关节骨密度下降风险进行预测，对优化成员选拔、为乘员提供早期健康防护干预以及对失重条件髋关节骨密度下降风险进行研究，都具有重要应用价值。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明采用-6度头低位卧床人体实验模型，筛选并鉴定了能预测失重后人体髋关节骨密度下降风险的表观遗传学指标集合。
本发明提供预测失重骨丢失髋关节骨密度下降风险的DNA甲基化标志物，包括下述一个或多个基因，基因位点注释信息见表3。
在表中通过基因符号(第11列)和至少一个染色体位点(第8、9和10列)来识别这些基因的优选甲基化核苷酸位置。这些基因由探针id(列1)进一步识别，其在这些基因中，特别是在它们的调控元件中识别CpG位点(在染色体位点)。
本文中的遗传参考文献通常参考基因组human hg38。在表中，探针id是指在阵列平台上表示的序列，每一个都用于询问特定的CpG位点，染色体(chr)、开始位点(start)和结束位点(end)可以唯一地识别每个探针的第一个nt位置。
本发明提供预测失重骨丢失髋关节骨密度下降风险的方法，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括下述步骤：确定受试者样品中髋关节骨密度风险基因位点的DNA甲基化水平，并将该基因位点的甲基化水平与对照样品进行比较，从而预测受试者在失重条件髋关节骨密度下降风险；
其中所述髋关节骨密度风险基因选自权利要求1中的一个或多个基因；
所述对照样品选自失重条件下髋关节骨密度下降幅度＜4％的样品；
所述确定DNA甲基化水平的方法可以通过本领域已知的任何方法确定，所述方法包括全基因组甲基化筛选分析、芯片平台的甲基化图谱分析、甲基化特异性PCR分析、飞行质谱检测(Sequenome)、亚硫酸盐处理后的基因组测序分析、联合亚硫酸氢盐限制性内切酶分析、甲基化特异性内切酶酶切和定量聚合酶链反应联合分析、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析或焦磷酸测序法检测分析方法。
本发明提供权利要求1中所述基因的甲基化检测试剂在制备预测失重骨丢失髋关节骨密度下降风险诊断产品中的应用，所述诊断产品包含检测权利要求1中一种或多种基因的甲基化水平检测试剂，所述试剂通过检测受试者样品中权利要求1中所述基因的甲基化水平，来判断受试者在失重条件下髋关节骨密度是否具有下降风险；
作为优选方案，所述试剂是基于全基因组甲基化筛选分析、芯片平台的甲基化图谱分析、甲基化特异性PCR分析、飞行质谱检测(sequenome)、亚硫酸盐处理后的基因组测序分析、联合亚硫酸氢盐限制性内切酶分析、甲基化特异性内切酶酶切和定量聚合酶链反应联合分析、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析或焦磷酸测序法检测分析所需的试剂。
作为又一优选方案，所述基因的甲基化水平是在标记基因的开放阅读框架的上游区域，特别是启动子区域确定的；或在下述中的一种：
(a)由权利要求1中所示染色体位点所定义的核酸；
(b)包含核酸a的CpG位点；
(c)与上述核酸a相距距离不超过1000个核苷酸内的核酸(a)。
作为又一优选方案，所述试剂包括特异性扩增包含甲基化位点在内的权利要求1中所述基因的引物；
作为又一优选方案，所述诊断产品是试剂盒、芯片或测序平台。
本发明提供一组核酸引物和/或杂交探针，其对权利要求1中所述一个或多个基因的潜在甲基化区域是特异性的；
作为优选方案，所述引物和/或杂交探针是特定于扩增标记基因开放阅读框架的甲基化上游区域，特别是启动子区域；或甲基化的下述中的一种：
(a)由权利要求1中所示染色体位点所定义的核酸；
(b)包含核酸a的CpG位点；
(c)与上述核酸a相距距离不超过1000个核苷酸内的核酸(a)。
引物和/或探针用于靶向表3中选择的一个或多个基因的DNA分子中的一个潜在甲基化区域。
本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求6所述的一组核酸引物或杂交探针，还包括甲基化特异性限制性酶和/或用于亚硫酸氢盐核苷酸脱胺的试剂。
本发明提供一种预测失重骨丢失髋关节骨密度下降风险的诊断产品，所述诊断产品包括能够检测权利要求1中所述基因甲基化水平的试剂；
作为优选方案，所述检测权利要求1中所述基因甲基化水平的试剂包括用于全基因组甲基化筛选分析的试剂、用于基于芯片的甲基化图谱分析的试剂、用于甲基化特异性PCR分析的试剂、用于飞行质谱检测(sequenome)的试剂、用于亚硫酸盐处理后的基因组测序分析的试剂、用于联合亚硫酸氢盐限制性内切酶分析的试剂、用于甲基化特异性内切酶酶切和定量聚合酶链反应联合分析的试剂、用于甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析的试剂或用于焦磷酸测序法检测分析的试剂。
作为又一优选方案，所述试剂包括特异性扩增包含甲基化位点在内的权利要求1中所述的基因片段的引物；
作为又一优选方案，所述诊断产品是试剂盒、芯片或测序平台。
本发明提供预测失重骨丢失髋关节骨密度下降超过4％的方法，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的，步骤如下：
(1)测定与探针cg00581979、cg17382950对应的基因位点的DNA甲基化水平；
(2)进行逻辑回归二分类模型构建，并代入下述公式：
其中，X＝219.9+cg00581979×569.5+cg17382950×(-555.8)，式中的cg00581979、cg17382950为对应的特定基因位点的DNA甲基化水平，Y为髋关节骨密度下降风险得分；如髋关节骨密度下降风险得分Y＜0.5，则判定为失重骨丢失髋关节骨密度下降超过4％。
本发明通过对血细胞DNA甲基化水平与骨密度指标(骨矿物质密度BMD，Bonemineral density)的挖掘，发现通过检测血细胞DNA甲基化水平，能够实现对失重后人体髋关节骨密度下降个体差异的预测，从而筛选更加耐受失重条件的个体，或者用于对髋关节骨密度变化情况进行科学研究。
本发明中提供了对失重后人体髋关节骨密度下降风险有预测功能的DNA甲基化位点集合，与人体骨代谢的相关性较高。这一发现为系统揭示失重条件影响引起的人体骨丢失提供了新的线索，值得科研人员进一步研究。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为45天-6度头低位卧床前后髋关节骨密度差异分析。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
本发明提供了可预测在失重后人体髋关节骨密度下降超过4％风险的DNA甲基化标志物列表(基因位置注释信息及预测性能见表3)，并提供了一种预测失重后人体髋关节骨密度下降超过4％风险的方法。在一个具体实施方案中，通过甲基化标志物组合cg00581979、cg17382950的甲基化水平，评价失重后人体髋关节骨密度下降个体差异，识别髋关节骨密度下降超过4％的受试者，进而筛选更加耐受失重条件的个体，或用于科研工作者对髋关节骨密度进行研究。
本发明虽然不拘囿于任何理论，但发明人认为表3中的特征位点的甲基化水平与失重条件下髋关节骨密度下降风险之间存在相关关系。
在本发明中，发明人发现髋关节骨密度下降风险得分Y，DNA甲基化水平cg00581979，cg17382950的关系满足
其中，X＝219.9+cg00581979×569.5+cg17382950×(-555.8)，式中的cg00581979，cg17382950为对应的基因位点的DNA甲基化水平。如Y＜0.5，则判定为髋关节骨密度下降超过4％。
实施例1
1、-6度头低位卧床模拟失重模型
(1)志愿者
试验志愿者为15名健康不吸烟男性，中专及中专以上文化程度。年龄在22岁到34岁之间(M＝26.62，SD＝4.21)，身高在160cm到174cm之间(M＝170.31，SD＝4.02)，体重53～72Kg(M＝62.81，SD＝5.90)。无特殊病史，视力或矫正视力正常，均为右利手，非运动员。所有的被试在接受实验前均填写知情同意书。
(2)实验条件
15位志愿者在-6度卧位床上保持头向下-6度状态，连续生活45天。实验过程中持续保持身体轴向-6度头部向下状态。
(3)实验程序
卧床实验开始前1天，通过EDTA抗凝管采集15位受试者血细胞样本，冻存于-80℃冰箱，留待后续DNA甲基化芯片检测；通过DXA技术检测受试者髋关节骨密度指标(骨矿物质密度BMD，Bone mineral density)。45天卧床实验结束当天，通过DXA技术检测受试者髋关节骨密度指标(骨矿物质密度BMD，Bone mineral density)。
2、数据采集总体情况
数据采集情况如表1所示：
表1数据采集情况表
3、髋关节骨矿物质密度BMD检测方法与质量控制
BMD测量：应用双能X线骨密度仪(DXA)测定髋关节(L14)BMD，仪器为法国MEDLINK公司锥形二维快闪型全数字双能x线骨密度仪，仪器型号为OSTEOCORE STATION。骨密度操作室温度18-25℃，湿度75％-90％，仪器每次均进行外置体模校准。
受试者准备：单衣单裤，无金属配饰，仰卧平躺。激光定位点移动到耻骨联合平行大腿处下3指位置，使用足部固定装置，固定检测者脚尖，保持脚尖内旋，检测过程中腿部不要移动。待检测完毕后，选择合适“ROI”计算髋关节BMD。仪器操作人员精度误差(LSC)为2.5％，操作人员及分析人员均接受国际临床骨密度测量学会(ISCD)举办的培训班培训，并获取相应证书。
45天-6度头低位卧床前后受试者髋关节骨矿物质密度BMD指标的变化趋势如表2所示。通过配对t检验分析，卧床前后受试者髋关节骨密度显著下降(p＝0.01)(图1)。将受试者划分为髋关节骨密度下降高风险组(H组，下降幅度＞4％，共计7位受试者)和低风险组(L组，下降幅度＜4％，共计8位受试者)。
图1为45天-6度头低位卧床前后髋关节骨密度差异分析。
表2髋关节骨矿物质密度BMD的变化趋势
4、DNA甲基化表达谱检测
采用Illumina Human 450k DNA甲基化芯片检测。
鉴于基因芯片技术相对成熟，且国内有运行成熟的商业化技术服务平台，采用外协测试的方式完成Illumina Human 450k DNA甲基化芯片测试。主要技术环节包括：
(1)基因组总DNA提取。使用商业化试剂盒QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取总DNA。
(2)DNA质检。使用NanoDrop及Agrose Gel质检方法，通过A260/280信号、A260/230信号、DNA总量(μg)等质检参数进行提取DNA的质量控制。
(3)亚硫酸氢盐转化，采用Zymo EZ DNA Methylation Kit试剂盒处理。
(4)WGA方式扩增、片段化，采用Illumina芯片扫描仪，用GenomeStudio软件控制。
(5)芯片杂交、洗脱、延伸、呈像，采用GenomeStudio软件。
(6)数据分析。
上述实验操作按相关试剂盒和公司的标准操作规程进行。
5、DNA甲基化表达谱芯片数据预处理
应用标准的Illumina Human 450k DNA methylation Chip数据输出文件*.idat文件中，使用R语言平台(v3.4.4)及Rstudio工具(v1.1.442)进行数据分析。预处理所用工具包包括：minfi(v1.24.0)，ChAMP(v2.9.10)。通过过滤以下探针：(1)检测p值大于0.01；(2)在超过5％的样本中探针bead-count数小于3；(3)非CG开头的探针；(4)SNPs位点开头的探针；(5)注释在多个基因位置的探针；(6)注释在X和Y染色体上的探针，最后得到412345个探针、15位受试者的DNA甲基化表达谱数据，用于后续分析。
6、头低位卧床模拟失重条件下髋关节骨丢失风险预测甲基化位点筛选
(1)模型特征筛选1——标准差过滤
对每个探针计算在15位受试者间的标准差，通过标准差对探针进行排序，筛选出在受试者人群中基准甲基化水平差异较大的探针。筛选阈值设为sd＞0.02，由此筛选出117872个探针，用于后续分析。
(2)模型特征筛选2——差异表达筛选
对117872个甲基化探针，在髋关节骨密度下降高风险组(H组)和低风险组(L组)间进行t检验分析。以p-value＜0.05为阈值，筛选组间甲基化水平显著差异的探针。由此筛选出2457个探针，用于后续分析。
(3)基于逻辑回归模型的单位点预测模型构建及性能分析
应用逻辑回归模型，以上述2457个探针中各位点分别进行分类模型构建。采用留一验证方法评价各位点模型的性能，输出模型AUC、Odds-Ratio值、模型精度Accuracy、模型精度置信区间及p值等参数信息。以p-value＜0.05为阈值，筛选出567个具有较高预测性能的甲基化位点。其中408个位点注释在已知基因上(表3)。后续在此408个位点中，优选特征组合，进行预测模型构建。
表3对失重条件下髋关节骨丢失风险具有预测能力的甲基化特征位点集合
针对应用逻辑回归模型筛选出的上述408个探针所在基因做功能富集分析。表4中分析结果显示，对-6度头低位卧床模拟失重条件下髋关节骨丢失风险具有预测能力的甲基化位点所在基因最显著富集于Long-term potentiation信号通路(p-value＝6.85E-04)等。
表4 45天头低位卧床模拟失重条件下髋关节骨丢失风险预测甲基化位点所在基因的功能富集结果
(4)模型特征筛选3——基于LASSO回归方法的逻辑回归建模
LASSO回归是在拟合广义线性模型的同时进行变量筛选(variable selection)和复杂度调整(regularization)。本分析旨在利用LASSO回归分析中的惩罚判别函数对所有408个甲基化探针变量的回归系数进行约束限制，把一些无意义或者意义极小的变量系数压缩至0，最终筛选出输入变量数目较少、且分类性能最优的特征集合。分析中采用3倍交叉验证策略，训练集和检验集的比例选择为2∶1，即每次从15个样本中随机抽取10个样本作为训练集，5个样本作为测试集，评估分类预测性能。该分析使用R语言中glmnet工具包(v2.0-16)。分析中设置参数type.measure＝″class″，限定模型分类的错误率最小。分析结果表明，λ值取0.32255时，可获得由2个甲基化探针组成的性能最优特征组合。
该性能最优特征的甲基化探针组合为：cg00581979，cg17382950。探针对应染色体序列及相应位置信息如下(斜体加粗字体显示，序列包含探针位置上下游25bp核酸序列)，参考基因组为human hg38：
＞chr19：47472205-47472256(cg00581979)
＞chr15：89748500-89748551(cg17382950)
(5)基于逻辑回归模型的多位点预测模型构建及性能分析
以甲基化探针组合cg00581979，cg17382950为输入指标，通过逻辑回归构建分类模型，对45天头低位卧床模拟失重条件下髋关节骨丢失高风险组(H组)和低风险组(L组)人群进行预测。预测模型系数如表5。
表5预测模型系数
变量 系数
cg00581979(自变量) 569.5
cg17382950(自变量) -555.8
常变量 219.9
所用计算公式如下：
其中，X＝219.9+cg00581979×569.5+cg17382950×(-555.8)，式中的cg00581979、cg17382950为特定基因位点的DNA甲基化水平，Y为髋关节骨密度下降风险得分。如髋关节骨密度下降风险得分Y＜0.5，则判定为髋关节骨密度下降超过4％。
通过留一验证分析，该预测模型AUC＝1(p-value＝8.035e-05)，其他模型性能参数输出详见表6。结果表明，该预测模型可对数据集中髋关节骨密度下降高风险/低风险人群进行准确预测。
表6预测模型性能参数
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.预测失重骨丢失髋关节骨密度下降风险的DNA甲基化标志物，包括下述一个或多个基因，其位点注释信息如下：
2.预测失重骨丢失髋关节骨密度下降风险的方法，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的，其特征在于：包括下述步骤：确定受试者样品中髋关节骨密度风险基因位点的DNA甲基化水平，并将该基因位点的甲基化水平与对照样品进行比较，从而预测受试者在失重条件髋关节骨密度下降风险；
其中所述髋关节骨密度风险基因选自权利要求1中的一个或多个基因；
所述对照样品选自失重条件下髋关节骨密度下降幅度＜4％的样品；
作为优选，所述确定DNA甲基化水平的方法包括全基因组甲基化筛选分析、芯片平台的甲基化图谱分析、甲基化特异性PCR分析、飞行质谱检测(Sequenome)、亚硫酸盐处理后的基因组测序分析、联合亚硫酸氢盐限制性内切酶分析、甲基化特异性内切酶酶切和定量聚合酶链反应联合分析、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析或焦磷酸测序法检测分析方法。
3.权利要求1中所述基因的甲基化检测试剂在制备预测失重骨丢失髋关节骨密度下降风险诊断产品中的应用，其特征在于：所述诊断产品包含检测权利要求1中一种或多种基因的甲基化水平检测试剂，所述试剂通过检测受试者样品中权利要求1中所述基因的甲基化水平，来判断受试者在失重条件下髋关节骨密度是否具有下降风险；
作为优选，所述试剂是基于全基因组甲基化筛选分析、芯片平台的甲基化图谱分析、甲基化特异性PCR分析、飞行质谱检测(sequenome)、亚硫酸盐处理后的基因组测序分析、联合亚硫酸氢盐限制性内切酶分析、甲基化特异性内切酶酶切和定量聚合酶链反应联合分析、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析或焦磷酸测序法检测分析所需的试剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述基因的甲基化水平是在标记基因的开放阅读框架的上游区域，特别是启动子区域确定的；或在下述中的一种：
(a)由权利要求1中所示染色体位点所定义的核酸；
(b)包含核酸a的CpG位点；
(c)与上述核酸a相距距离不超过1000个核苷酸内的核酸(a)。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述试剂包括特异性扩增包含甲基化位点在内的权利要求1中所述基因的引物；
作为优选，所述诊断产品是试剂盒、芯片或测序平台。
6.一组核酸引物和/或杂交探针，其对权利要求1中所述一个或多个基因的潜在甲基化区域是特异性的；
作为优选，所述引物和/或杂交探针是特定于扩增标记基因开放阅读框架的甲基化上游区域，特别是启动子区域；或甲基化的下述中的一种：
(a)由权利要求1中所示染色体位点所定义的核酸；
(b)包含核酸a的CpG位点；
(c)与上述核酸a相距距离不超过1000个核苷酸内的核酸(a)。
7.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求6所述的一组核酸引物或杂交探针，还包括甲基化特异性限制性酶和/或用于亚硫酸氢盐核苷酸脱胺的试剂。
8.一种预测失重骨丢失髋关节骨密度下降风险的诊断产品，其特征在于：所述诊断产品包括能够检测权利要求1中所述基因甲基化水平的试剂；
作为优选，所述检测权利要求1中所述基因甲基化水平的试剂包括用于全基因组甲基化筛选分析的试剂、用于基于芯片的甲基化图谱分析的试剂、用于甲基化特异性PCR分析的试剂、用于飞行质谱检测(sequenome)的试剂、用于亚硫酸盐处理后的基因组测序分析的试剂、用于联合亚硫酸氢盐限制性内切酶分析的试剂、用于甲基化特异性内切酶酶切和定量聚合酶链反应联合分析的试剂、用于甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析的试剂或用于焦磷酸测序法检测分析的试剂。
9.根据权利要求8所述的诊断产品，其特征在于：所述试剂包括特异性扩增包含甲基化位点在内的权利要求1中所述的基因片段的引物；
作为优选，所述诊断产品是试剂盒、芯片或测序平台。
10.预测失重骨丢失髋关节骨密度下降超过4％的方法，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的，其特征在于：步骤如下：
(1)测定与探针cg00581979、cg17382950对应的基因位点的DNA甲基化水平；
(2)进行逻辑回归二分类模型构建，并代入下述公式：
其中，X＝219.9+cg00581979×569.5+cg17382950×(-555.8)，式中的cg00581979、cg17382950为对应的特定基因位点的DNA甲基化水平，Y为髋关节骨密度下降风险得分；如髋关节骨密度下降风险得分Y＜0.5，则判定为失重骨丢失髋关节骨密度下降超过4％。
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