CN108220426B - 一种用于检测骨质疏松症的试剂盒 - Google Patents

一种用于检测骨质疏松症的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明用于检测骨质疏松症的试剂盒，所述试剂盒包括能特异性检测rs73100693的探针和引物。通过本试剂盒可以检测受试者是否患有骨质疏松症，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。而且操作简单，实验方法，成本低廉。

Description

一种用于检测骨质疏松症的试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体的属于一种用于检测骨质疏松症的试剂盒。
背景技术
骨质疏松即骨质疏松症，是多种原因引起的一组骨病，骨组织有正常的钙化，钙盐与基质呈正常比例，以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变。在多数骨质疏松中，骨组织的减少主要由于骨质吸收增多所致。以骨骼疼痛、易于骨折为特征。
临床表现为疼痛，原发性骨质疏松症最常见的症状，以腰背痛多见，占疼痛患者中的70％～80％。疼痛沿脊柱向两侧扩散，仰卧或坐位时疼痛减轻，直立时后伸或久立、久坐时疼痛加剧，弯腰、咳嗽、大便用力时加重。一般骨量丢失12％以上时即可出现骨痛。老年骨质疏松症时，椎体压缩变形，脊柱前屈，肌肉疲劳甚至痉挛，产生疼痛。新近胸腰椎压缩性骨折，亦可产生急性疼痛，相应部位的脊柱棘突可有强烈压痛及叩击痛。若压迫相应的脊神经可产生四肢放射痛、双下肢感觉运动障碍、肋间神经痛、胸骨后疼痛类似心绞痛。若压迫脊髓、马尾神经还影响膀胱、直肠功能。退行性骨质疏松症最常见和最严重的并发症。
骨质疏松的检查在实验室层面上主要是如下几点:(1)血钙、磷和碱性磷酸酶在原发性骨质疏松症中，血清钙、磷以及碱性磷酸酶水平通常是正常的，骨折后数月碱性磷酸酶水平可增高。(2)血甲状旁腺激素应检查甲状旁腺功能除外继发性骨质疏松症。原发性骨质疏松症者血甲状旁腺激素水平可正常或升高。(3)骨更新的标记物骨质疏松症患者部分血清学生化指标可以反应骨转换(包括骨形成和骨吸收)状态，这些生化测量指标包括：骨特异的碱性磷酸酶(反应骨形成)、抗酒石酸酸性磷酸酶(反应骨吸收)、骨钙素(反应骨形成)、Ⅰ型原胶原肽(反应骨形成)、尿吡啶啉和脱氧吡啶啉(反应骨吸收)、Ⅰ型胶原的N-C-末端交联肽(反应骨吸收)。(4)晨尿钙/肌酐比值正常比值为0.13±0.01，尿钙排量过多则比值增高，提示有骨吸收率增加可能。
其次是辅助检查，又分为以下几个方面，骨影像学检查和骨密度①摄取病变部位的X线片X线可以发现骨折以及其他病变，如骨关节炎、椎间盘疾病以及脊椎前移。骨质减少(低骨密度)摄片时可见骨透亮度增加，骨小梁减少及其间隙增宽，横行骨小梁消失，骨结构模糊，但通常需在骨量下降30％以上才能观察到。大体上可见椎体双凹变形，椎体前缘塌陷呈楔形变，亦称压缩性骨折，常见于第11、12胸椎和第1、2腰椎。②骨密度检测骨密度检测是骨折的预测指标。测量何部位的骨密度，可以用来评估总体的骨折发生危险度；测量特定部位的骨密度可以预测局部的骨折发生的危险性。
在现有技术中，CN 102534019 A公开了一种试剂盒通过检测与骨质疏松症发生密切相关的5个单核苷酸多态性位点的基因型来筛查出容易患骨质疏松症的女性高危人群，并最终根据每一位受检者的基因检测结果从基因层面评估骨质疏松症易感的风险级别，指导更年期女性针对性的有效预防骨质疏松症的发生。
CN 106755522 A公开了一种用于幼年型骨质疏松症检测的试剂盒，通过基因比对发现在幼年型骨质疏松患者和正常人群中DKK1基因存在着明显的突变位点，为721位点。通过检测这个突变位点，特别是提供的1对特异性引物对，可以特异性的鉴定人体时候患有幼年型骨质疏松症状。该检测方法相对于现有技术的方法具有检测方便，准确快速的优点，适宜于推广使用。
CN 107043811 A公开了CFAP20基因可以作为骨质疏松症早期诊断的分子标志物。利用高通量测序和QPCR实验研究了骨质疏松症患者中的差异表达基因。该研究成果表明可以通过检测血液中CFAP20基因表达情况来判断受试者是否患有骨质疏松症。
基于现有技术中检测骨质疏松症的手段的局限性，寻找骨质疏松早期诊断及预后相关的特异性分子标志物对实现骨质疏松的早期诊断及个体化治疗具有深远意义。
发明内容
本发明提供了用于检测rs73100693基因型的试剂盒，检测结果能够用于骨质疏松症的辅助分析。
本发明的第一个目的是提供用于检测基因SNP位点rs73100693基因型的试剂盒，所述试剂盒包括引物对和PCR检测反应试剂。
依据本发明的试剂盒，可以提供一种对个体的骨质疏松症易感性进行诊断的方法，该方法为：检测个体的rs73100693位点的多态性状态，当位点为G时不表现出低骨密度特性，当突变基因型A导致了骨密度值的降低，从而最终导致骨质疏松症的发生。
本发明提供了一种检测样本中是否存在rs73100693多态性的方法，该方法包括如下步骤：(1)利用我们自己设计的试剂盒扩增样本，得到PCR扩增产物。
本发明利用TAQMAN技术检测扩增产物中是否存在单核苷酸多态性。本发明的基本技术路线是：一种鉴定rs73100693多态性中SNP分子标记的方法，通过提取样本的基因组DNA，采用本发明提供的试剂盒进行PCR扩增，扩增目的片段，利用TAQMAN技术进行检测，发现SNP存在，利用DNA测序方法证实该SNP的存在以及存在的位置。
rs73100693位点的检测片段序列如SEQ ID NO：1所示。长度为181bp，具体序列如下：atgcctgggt gtgtggatgg atagaatttt ttttaaaaaa cccaaaactt ccttaagctgtagttagtca w ctataacatg gaaataataa tacgtaactg ataagattat tatgtgaattaaaaacaata atgtatataa agtacttagc ttgcatataa gtgggaaata aattgtagca；其中w为a/t突变。
本领域的技术人员都清楚，有很多分析方法可以用于检测基因内含子序列中存在单核酸多态性分布频率。这些技术包括：DNA测序、PCR-SSCP、PCR-HPLC、PCR-TAQMAN等。
本发明特别地提供了一种使用方便、灵敏度高的检测上述SNP的检测试剂盒，它含有PCR特异扩增引物和用于PCR扩增检测的PCR反应液(如试剂、缓冲液等常规组件)等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。在采用TAQMAN技术检测扩增产物检测突变位点，还需要TAQMAN所需要的一些常规试剂等。
具体来说，本发明提供了一种检测rs73100693的SNP的PCR试剂盒，其特征是由引物1、引物2、探针3、探针4和PCR反应液构成，其中，所述探针3及探针4的5'端标记有报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，且探针4的5'端报告基团与探针3的5'端报告基团不同。
其中，5'端标记的报告基团可选自：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、R0X、Cy3、Cy5、MAR、JUP、SAT、PLU或NEP，且不限于上述基团；3'端标记的荧光淬灭基团可选自：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB，且不限于上述基团。
优选地，5'端标记的报告基团为FAM或VIC，3'端标记的荧光淬灭基团为MGB。
PCR扩增:所使用的扩增引物序列为:
正向引物1:atgcctgggt gtgtggatgg；
反向引物2:tgctacaatt tatttcccac；
特异探针序列3:tagttagtca a ctataacatg，其中序列5’段使用FAM标记，3’端用MGB标记，
特异探针序列4:tagttagtca t ctataacatg，其中序列5’段使用VIC标记，3’端用MGB标记。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了rs73100693多态性与骨质疏松症相关，通过检测受试者中rs73100693的多态性情况，可以判断受试者是否患有骨质疏松症，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。而且操作简单，实验方法，成本低廉。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1SNP分子标记的获得
研究样本从多个研究和体检中心获得。所有研究均通过了伦理委员会的审批，并获得了研究对象的知情同意。我们对来自六个不同血统具有腰椎和股骨颈骨密度值测量的样本进行了全基因组关联性分析(GWAS)，并合并数据进行meta分析。此外，我们还收集了GEFOS-seq公共数据库中的欧洲血统人群腰椎和股骨颈骨密度的meta分析结果，并将两部分数据合并进行联合分析以相互验证关联结果。
第一部分内部样本meta分析
1、样本的选择
前期，我们在七个具有腰椎和股骨颈骨密度值测量的样本中进行了GWAS meta分析。其中，因弗雷明汉心脏病研究(FHS)样本与GEFOS-seq样本重合，为了保证两部分样本的独立性，我们将FHS样本从内部样本中剔除。剩余的六个样本基本信息如下：
(1)Omaha骨质疏松研究样本(OOS)：OOS样本包括了1000名随机参与者的横断面研究。
(2)堪萨斯城骨质疏松研究样本(KCOS)：KCOS样本包括了2286名随机参与者的横断面研究。
(3)印第安纳州脆性骨折研究样本(IFS)：IFS样本是通过dbGAP数据库获得的，包括了1493名欧洲血统的绝经前姐妹对参与者的横断面研究。
(4)中国骨质疏松症研究样本(COS)：COS样本包括了1627名随机参与者的横断面研究。
(5)非裔美国人女性健康初步观测研究(WHI-AA)：WHI-AA样本是女性健康初步观测研究(WHI)的一部分，包含了845名非裔美国人参与者，可以通过dbGAP数据库获得。
(6)西班牙裔女性健康初步观测研究(WHI-HIS)：WHI-HIS样本也是WHI的一部分，包含了446名西班牙裔参与者，可以通过dbGAP数据库获得。
2、表型测量和建模
通过DXA骨密度仪测得骨密度值。使用步进回归法筛查性别、年龄、年龄平方、身高以及从基因组数据计算出的前10个主成分(用于衡量种群分层效应)等协变量的显著性。原始骨密度值经过协变量校正后的残差使用正态分布的分位数来正态化。正态化后的残差用于下游关联分析。
3、基因分型及质控
所有六个样本使用高通量基因分型芯片分型。质控在样本层面以及SNP层面实现。在样本层面，使用plink软件分析X染色体推断性别，并和问卷调查表中的性别做比较。性别不符的个体从数据中删除。在SNP层面，不符合哈-温平衡的SNP从数据中删除。当存在人群极端值时，检查主成分的基因型，并剔除极端值。
4、基因型补缺
使用千人基因组的测序数据(2013年5月版本)对所有样本进行基因型补缺。首先，从千人基因组网站下载4类人种的测序个体的单体型数据(欧洲血统503人、东亚血统504人、非洲血统661人以及混合美国人血统347人)，分别将其作为各自样本的基因分型参考模板。其次，对参考基因组(即千人基因组数据)和目标基因组(即GWAS样本)的等位基因做一致性检验，检验不符者将从目标基因组中删除。最后，使用软件FISH开展基因型补缺，这个算法具有运算速度快，占用内存小，无需对目标基因组提前分相(phasing)等优点。软件参数默认设置。
5、单样本中的关联分析及meta分析
在每个样本中，正态化的表型残差和分型及补缺出的基因型间的遗传关联通过遗传累加模型来检验。在无关样本中，遗传关联使用线性回归模型检验，软件为MACH2QTL。对于IFS家系样本,则使用混合线性模型计算基因型的关联度。六个样本的关联结果合并在一起开展meta分析。所用模型为样本量加权的固定效应模型，所用软件是METAL。
第二部分GEFOS-seq meta分析结果的收集
GEFOS-seq研究组织在超过50,000名欧洲血统参与者中进行了测序及基因型补缺为基础的骨密度GWAS meta分析。样本信息、质控和统计分析详见GEFOS-seq官网。简而言之，此研究包括三部分内容：1、对UK10K研究中的2,882名研究对象进行全基因组测序；2、对5个队列研究中的3,549名研究对象进行全基因组测序；3、对26,534名研究对象进行全基因组基因型补缺。所有样本都进行了meta分析，并且部分结果已对外公开。在此，我们通过GEFOS-seq官网下载了这部分样本量高达32,965的meta分析结果。
SNP纳入标准
对于第一部分六个内部样本的meta分析结果，我们采取的SNP纳入的质控标准为：基因异质性I2<50％。对于第二部分GEFOS-seq meta分析结果，我们采取的纳入质控标准则为：①基因异质性I2<50％；②最小等位基因频率(MAF)>1％。对于均符合两部分质控的SNPs，我们将其纳入下一步研究中。
联合分析
通过两部分样本的meta分析结果我们分别得到了两部分z值：z1和z2。接着，我们运用加权固定效应meta分析模型进行联合分析，公式如下：
式中，n1和n2分别指内部样本和GEFOS-seq样本的样本量。在零假设成立的情况下，即不存在关联时,统计值Z服从正态分布或近似正态分布。GWAS显著水平设为5.0x10-8。
结论
内部样本研究中，共涵盖了7,484名研究对象。在每个样本中应用主成分分析未检出异质性个体。应用PCA校正种群分层后，腰椎和股骨颈骨密度基因组膨胀系数分别是1.03和1.02，低于警戒值，说明没有明显的种群分层效应。GEFOS-seq meta分析结果中，一共有32,965名研究对象，涵盖了10,586,901个SNPs，经过质控筛除后，一共有7,434,754个SNPs被纳入到下一步的联合分析中。
两部分的联合分析发现了许多与腰椎和股骨颈骨密度相关的位点。一些位点不仅在GEFOS-seq样本中达到全基因组显著水平(GWS,p<5.0x10-8)，在内部样本中也得到了重复验证(p<0.05)。此外，我们还发现了达到全基因组显著水平的新的位点：20p12.1(rs73100693,p＝2.65x10-8)。
位于该位点上的SNP rs73100693与腰椎骨密度的关联最为显著。详细结果如下表1：
表1 rs73100693结果数据
从表1的数据可以看出，针对rs73100693位点，存在A/T的突变，当其为T的时候，表现为低骨密度特性，当其为A时不表现出低骨密度特性。突变基因型T导致了骨密度值的降低，从而最终导致骨质疏松症的发生，这种升高在统计学上是极端显著的(p＝2.65x10-8)，因此可以通过检测该位点基因型来检测骨质疏松症。
实施例2具体样本检测
1.研究样本的选择；
本发明所使用的骨质疏松症患者血样样本来自苏州大学附属第一医院，共100例确诊患者样本。研究样本的入选标准如下:年龄为18-70岁的女性；经骨密度检测以及X光检测确诊；无主要脏器的功能障碍，血常规、肝肾功能及心脏功能基本正常；能获得完整的随访信息。所有研究对象均为无血缘关系的汉族人群，地理上主要来自华东及其周边地区。以100个正常人群血液为对照。对上述纳入病患，收集整理其基本信息、临床信息以及治疗信息，并依据知情同意原则签署知情同意书。
2.基因组DNA的抽提；
样本使用EDTA抗凝的采血管收集研究对象的外周静脉血2ml，离心分离血清和血细胞后保存于-80℃冰箱。采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲系统，提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到50ng DNA，纯度(紫外2600D:2800D)在1.8左右。
3、准备PCR扩增体系：
并对每个DNA分别加入SEQ ID NO：2-5所示的引物和探针的混合液做PCR反应，来分别对每个SNP进行分型，所需试剂包括Taqman Genotyping Master Mix 5μl、ddH20 3.5μ1、荧光探针和引物混合液0.5μl，其余为50ng/μl的受检查人DNA样本1μl,总体积10μl。
4、PCR扩增程序：
PCR反应第一步：60℃、35s；PCR反应第二步：96℃、10min；PCR反应第三步：93℃、20s；PCR反应第四步：60℃、95s；PCR反应第五步：循环第三步第四步5次，然后60℃、25s。采用ABI Stepone突光定量PCR仪(Applied Biosystems，美国应用生物技术有限公司)。
5、实验结果：
PCR反应结束后，应用Stepone software V2.1进行分析，将得到的200例结果进行分类，依据本发明的探针共分辨出3种基因型：SNP rs73100693三种基因型AA、AT和TT。
6、试剂盒的准确性分析
为验证试剂盒检测的准确性，对200例样本进行测序验证。SNP rs73100693基因型AA有138例，AT基因型有58例，TT基因型有4例；其中AT和TT基因型均为骨质疏松症患者，因此试剂盒检测的准确性达到了100％。
此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的扩增引物检测SNP位点，再通过SNP谱评价患者情况，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导高危人群的筛检和更有效的个体化治疗。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 北京岳昊科技发展有限公司
<120> 一种用于检测骨质疏松症的试剂盒
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 181
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
atgcctgggt gtgtggatgg atagaatttt ttttaaaaaa cccaaaactt ccttaagctg 60
tagttagtca actataacat ggaaataata atacgtaact gataagatta ttatgtgaat 120
taaaaacaat aatgtatata aagtacttag cttgcatata agtgggaaat aaattgtagc 180
a 181
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<211> 20
<212> DNA
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atgcctgggt gtgtggatgg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 3
tgctacaatt tatttcccac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Homo sapiens)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Homo sapiens)
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tagttagtca tctataacat g 21

Claims (1)

1.SEQ ID NO：2-5所述的引物组和探针序列在制备用于骨质疏松症检测的试剂盒中的应用。
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