CN109053874B - 钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明为一种钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子的制备方法和应用。该方法将一种钙调蛋白特异性结合靶肽在碱性条件下，共价连接到还原型氧化石墨烯上，提供一种新的调节CaM相关离子通道的纳米粒子(rGO‑P)。本发明是针对rGO‑P作为受钙调蛋白调控的Kv10.1离子通道或SK2离子通道的调节剂的用途，能够远程调控、应用于治疗与离子通道相关的肿瘤以及心房颤动等疾病的新思路。

Description

钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子 的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及材料化学、细胞生物学和医学交叉领域，更具体地本发明涉及一种钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子的制备方法及其在远程可控地调节电压依赖性钾离子通道Kv10.1和小电导钙激活钾离子通道SK2的新用途。
背景技术
近红外光与可见光相比，具有较强的组织穿透能力，能够在不损伤外围组织的情况下，到达病灶部位。石墨烯是最接近二维的碳纳米材料，由一层密集呈蜂巢状排列的碳原子组成，具有良好的导电性，优异的稳定性和非凡的光热效应性能。氧化石墨烯(GO)与还原型氧化石墨烯(rGO)在近红外的照射下，均能产生光热效应。研究表明，rGO的光热转换效率比GO的更高。因此，在相同条件下，rGO能够达到更好的光热治疗效果。
钙调蛋白(Calmodulin，CaM)是真核细胞中的一种重要的胞质溶胶蛋白，通过与胞内“第二信使”——钙离子的结合行使众多功能。CaM是由148个氨基酸残基组成的单链多肽，其本身单独存在时不具有任何生物学活性，只有当与钙离子结合时引起CaM的构象发生变化，形成活性状态的CaM/Ca2+复合物，进而执行相应的功能。CaM参与胞内多种生化反应和信号通路，涉及不少关键性酶类或蛋白质，其中包括多种离子通道蛋白。例如，Kv10.1通道是一种电压依赖性钾离子通道，在多种组织和器官中都有发现，但是在正常情况下除在神经组织中有较高表达外以外，其他部位表达量相对较低。研究发现，肿瘤与Kv10.1的异常表达密切相关，在胃癌、前列腺癌、卵巢癌等多种肿瘤中都呈现过表达。Kv10.1能够被活性状态的CaM(CaM/Ca2+复合物)所抑制。而另一种钙激活小电导钾离子(SK2)通道则能够被活性状态的CaM激活，这点与Kv10.1相反。SK2通道主要表达在心肌细胞和神经细胞上，对于其膜电位的复极化有重要作用。研究表明，SK2的状态与心房颤动的发生有紧密联系。由此可见，Kv10.1离子通道或SK2离子通道调节剂可为相关疾病的治疗提供新的方式。而内向整流钾离子Kir2.1的开放与关闭，只跟电压有关，不受CaM的调控。此外，钙调蛋白相关的离子通道与多种疾病的发生密切相关。因此，钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子(rGO-P)对于肿瘤、心房颤动具有潜在的临床应用价值。
本发明公开了一种新的与CaM相关的离子通道调节物质rGO-P以及一种远程调控Kv10.1离子通道和SK2离子通道的新方法，为治疗与这两种离子通道相关疾病的提供新思路。
发明内容
本发明的目的是针对当前技术存在的步骤，提供一种钙调蛋白特异性结合靶肽在碱性条件下，共价连接到还原型氧化石墨烯上，提供一种新的调节CaM相关离子通道的纳米粒子(rGO-P)。目的是针对rGO-P作为受钙调蛋白调控的Kv10.1离子通道或SK2离子通道的调节剂的用途，能够远程调控、应用于治疗与离子通道相关的肿瘤以及心房颤动等疾病的新思路。
本发明的技术方案为：
一种钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子的制备方法，该方法包括以下步骤：
a)将氧化石墨烯(GO)分散液超声破碎30-120分钟，之后离心除去微米级别的氧化石墨烯；所述的氧化石墨烯分散液浓度为0.5-5mg/mL；
b)将上步得到的溶液用微孔滤膜过滤，得到纳米氧化石墨烯；
c)在50-80℃下，将氧化石墨烯、钙调蛋白结合靶肽、氢氧化钾加入到水中搅拌10-20小时；其中，质量比为氧化石墨烯：钙调蛋白结合肽：氢氧化钾：水＝20-50：2-5：100-500：2000-10000；
d)反应完成后，冷却至室温，经超滤管洗脱，得到钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子(rGO-P)；
所述步骤a)中，超声破碎的超声功率50-200W，离心速度为2000-5000转/分。
所述b)中微孔滤膜材质为尼龙、混合纤维素酯、聚偏氟乙烯、聚醚砜、聚丙烯聚或四氟乙烯，微孔的尺度为0.22或0.45微米。
所述d)中室温为20-25℃，超滤管规格为10-100kDa，洗脱次数为3-10次。
所述的钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子的应用，用于调控离子通道或体外调控钙调蛋白的构象变化；
所述的用于调控离子通道，包括以下步骤：
a)将细胞接种在铺有细胞爬片的24孔板中，待细胞生长24小时后，每孔加入50μL孵育完成的液体，然后继续培养18～36小时；加入rGO-P，放入培养箱中继续孵育2-6小时；
其中，细胞接种密度为0.5*105-5*106，所述的孵育完成的液体的孵育步骤包括：将2微克离子通道质粒与6μL X-tremeGENE HP DNA转染试剂在200μL Opti-MEM培养基里混合，静置20分；
b)取出爬片，用缓冲液清洗，用近红外光照射爬片上的细胞3-8分钟，完成离子通道的
调控。
所述a)中，rGO-P加入后在24孔板中溶液的浓度为5-50μg/mL，培养箱中为5％二氧化碳/37℃；
所述b)中，所述缓冲液可为HEPES缓冲液、台氏液、Tris缓冲液、PB缓冲液或PBS缓冲液。
所述的的钙调蛋白结合靶肽优选为氨基酸序列为NH2-QASERGHITRKKLKGEKK-COOH的靶肽。
所述近红外光的波长为750～1500nm，具体为808nm，光照强度为0.5-4W/cm2。
所述的细胞具体为HEK 293细胞。
本发明的有益效果为：
本发明基于钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子(rGO-P)，利用还原型氧化石墨烯优良的光热效应，通过近红外光照射失活钙调蛋白，远程、无损调控与钙调蛋白相关离子通道的开关。
本发明提供了一种多肽或蛋白质连接到氧化石墨烯的新方法：在碱性条件下，氧化石墨烯的环氧基团与多肽或蛋白质上的氨基反应，共价连接到石墨烯上。将石墨烯优良的光热性能、力学性能、电子性能与多肽或蛋白质的催化性能、特异性靶向作用结合，在材料、传感、药物载体、催化等领域实现更广泛的应用。
本发明通过808nm近红外光照射，rGO-P能明显激活Kv10.1通道和抑制SK2离子通道，具体来说，为与这两种离子通道相关的肿瘤、心房颤动等疾病的治疗提供了新的思路和潜在的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中的制备完成后rGO-P纳米粒子在水中的稳定性和水合粒径；其中，图1a为室温下rGO-P(50μg/mL)分别在HEPES缓冲液和DMEM培养基中保存2天的照片。图1b为动态光散射测量rGO-P的水合粒径。
图2为实施例1中的对反应前后纳米粒子变化的表征，用原子力显微镜观察GO与多肽反应前后的变化。图2a为反应之前，氧化石墨烯(GO)的原子力显微镜图像，图2b为GO的拓扑高度剖面图。图2c为反应之后，rGO-P的原子力显微镜图像；图2d为反应之后，rGO-P的拓扑高度剖面图。
图3为实施例2中的全细胞模式下记录转染Kv10.1离子通道的HEK293细胞与不同纳米粒子孵育2小时，近红外光照前后通道电流的变化情况。
图4为实施例3中的全细胞模式下记录转染SK2离子通道的HEK293细胞与不同纳米粒子孵育2小时，近红外光照前后通道电流的变化情况。
图5为实施例4中的全细胞模式下记录转染Kir2.1离子通道的HEK293细胞与不同纳米粒子孵育2小时，近红外光照前后通道电流的变化情况。
具体实施方式
本发明发明了一种钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子(rGO-P)，通过利用rGO-P对CaM的调控，对Kv10.1离子通道或SK2离子通道产生调节作用，从而可能对多种肿瘤及心房颤动具有临床治疗效果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。钙调蛋白结合靶肽由吉尔生化(上海)有限公司合成，具体氨基酸序列为NH2-QASERGHITRKKLKGEKK-COOH。
实施例1：rGO-P的制备与表征。
首先，将GO(1mg/mL)在水中通过超声破碎的方式变成纳米级，超声功率100W持续30min。之后将分散液离心(5000r/min)除去微米尺寸的GO。将剩余的用0.22μm聚偏氟乙烯微孔滤膜过滤，得到纳米级的氧化石墨烯(GO)。含2mg GO、0.2mg钙调蛋白结合靶肽和10mg氢氧化钾的水溶液(10mL)，在75℃水浴条件下搅拌反应10小时。反应得到的rGO-P通过100kD截留量的超滤管，用水在3000r/min条件下洗3次,除去未反应的多肽和盐类。再利用超滤管进行浓缩，得到1mg/mL的钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子储存液。在这个过程中，氧化石墨烯被还原成为还原型氧化石墨烯，同时多肽上的氨基与氧化石墨烯上的环氧基团反应，共价连接到石墨烯上。
反应后，相同浓度rGO-P比GO的颜色明显变深，表明其吸光能力增强。如图1a所示，50μg/mL rGO-P的在HEPES缓冲液和DMEM培养基中保存两天依然没有沉淀，表明其稳定性和分散性很好。图1b为动态光衍射测量rGO-P的水合粒径分布图，其平均粒径为63.8nm,表明大多数rGO-P尺寸分布在纳米级别。
氧化石墨烯与钙调蛋白特异性结合靶肽的共价连接是通过环氧基团在碱性条件下与多肽上的氨基发生反应。图2a,2b所示，反应之前，氧化石墨烯的厚度在0.8-1.2nm之间；反应之后，如图2c，2d所示，厚度增加到4nm，表明结合肽已经连接到石墨烯上。
实施例2：通过808nm近红外光光照，光照强度为(2.5W/cm2)，rGO-P能够增强Kv10.1钾离子通道的活性，使得转染有Kv10.1离子通道的HEK293细胞的电流增大。
将表达Kv10.1的质粒转入哺乳动物细胞HEK 293中。在细胞转染后24小时后，进行电生理检测(利用膜片钳技术)。具体方法如下：
将400μL体积的细胞(接种密度为1.5*105)接种在铺有细胞爬片的24孔板中，待细胞生长24小时后，将2μg离子通道质粒与6μL X-tremeGENE HP DNA转染试剂(Roche公司)在200μL Opti-MEM培养基里混匀，孵育20分，每孔加入50μL后继续培养24小时；加入实施例1得到的rGO-P(工作浓度为17μg/mL)(同时，采用相同浓度的rGO、以及空白对照组作为对照)，放入培养箱中继续孵育；孵育完成后，取出爬片，用细胞浴液洗去杂质，利用膜片钳的全细胞模式测量离子通道在近红外光照前后电流的变化。
HEK293细胞用含有10％胎牛血清的DMEM(高糖)培养基传代培养(含100UI/ml的青霉素和100μg/ml链霉素)。细胞于37℃,5％CO2饱和湿度培养箱中培养至对数生长期用于实验。
膜片钳全细胞测试的步骤为
细胞浴液的成分为(mM)：115,NaCl；2.8,KCl；1.0,MgCl2；10,HEPES；1.0,CaCl2；(调pH为7.4).内液组分(mM):144,K-gluconate；10,HEPES；5,EGTA；1.15,MgCl2；500nM游离钙Ca2+保证细胞内的CaM被充分激活，用KOH调至pH 7.3。在做膜片钳实验前两小时往细胞培养液加入rGO-P，使工作浓度为17μg/mL。电生理检测在室温下进行(约25℃)，采用全细胞(Whole-cell)记录模式(EPC-10Amplifier，HEKA公司，德国)，实时记录光照前后电流的变化。
结果如图3所示，开始时，与rGO-P孵育的Kv10.1通道的平均电流在60mV时为1290pA。在NIR照射后，平均电流达到2344pA，这几乎是该值的两倍。相比之下，与rGO孵育的平均电流仅增加253pA，空白的平均电流几乎没有变化。说明rGO-P对转染有Kv10.1质粒的HEK293细胞有明显的激活作用，能够调控Kv10.1离子通道的活性。Kv10.1离子通道，又称Eag1(ether-à-go-go-1)离子通道，是电压依赖性钾通道家族的成员，它在肿瘤增殖，恶性转化，侵袭，转移，复发和预后中发挥重要作用，已成为肿瘤诊断和肿瘤靶向治疗的新的分子靶点(Eag1as a cancer target.[J].Expert Opinion on Therapeutic Targets,2008,12(7):837.)。因此，调控Kv10.1离子通道的活性对于肿瘤治疗具有潜在应用价值。
实施例3：通过808nm近红外光光照，rGO-P能够抑制SK2钾离子通道的活性，使得转染有SK2离子通道的HEK293细胞的电流降低。
SK2通道则能够被活性状态的CaM激活，这点与Kv10.1相反,因此选择SK2通道做为另外验证。实验步骤同Kv10.1通道，但膜片钳实验的液体不同。SK2实验所需细胞浴液的成分为(mM)：140,N-methylglucamine；10HEPES；4,KCl；5,glucose；,1.0MgCl2,(调pH为7.4).内液组分(mM):144,K-gluconate；10,HEPES；5,EGTA；1.15,MgCl2；500nM游离钙Ca2+保证细胞内的CaM被充分激活，用KOH调至pH 7.3。
结果如图3，所示用rGO-P处理细胞的SK2通道电流光照后显著降低，rGO或空白的平均电流值没有变化。说明rGO-P对SK2离子通道的电流有明显的抑制作用，能够调控SK2离子通道的活性。SK通道在人类心房存在，并参与动作电位的复极化。当SK2通道的电流过高时，就会破坏心房肌细胞复极期间向内和向外电流的复杂平衡，导致心房颤动(Small-conductance calcium-activated potassium(SK)channels contribute to actionpotential repolarization in human atria.[J].Cardiovascular Research,2014,103(1):156.)和心房性心律失常(Li N,Ablation of a Ca2+-activated K+channel(SK2channel)results in action potential prolongation in atrial myocytes andatrial fibrillation.[J].Journal of Physiology,2009,587(5):1087.)。因此，加入rGO-P后，经过红外光照，能够抑制SK2通道的电流，进而能够对心房颤动和心房性心律失常进行有效的治疗。
实施例4：808nm近红外光光照前后，rGO-P不能调控CaM非依赖型离子通道，对转染有Kir2.1离子通道的HEK293细胞的电流没有影响。
Kir2.1通道不受CaM状态的影响，这点与Kv10.1和SK2通道不一样，通道的开放与关闭，只跟电压有关，作为对照组。实验步骤同Kv10.1通道，但膜片钳实验的液体不同。Kir2.1实验所需实验步骤同Kv10.1通道，细胞浴液的成分为(mM)：140NaCl,5.4KCl,1.0MgCl2,10葡萄糖,CaCl2和1.0 10.0HEPES(调pH为7.4).电极内液(mM):140KCl,10HEPES,1.0MgCl2,5EGTA,500nM游离钙Ca2+保证细胞内的CaM被充分激活，用KOH调至pH 7.3。
结果如图5所示，无论是rGO-P、rGO还是空白对照组的Kir2.1通道电流在光照前后都没有明显变化。说明rGO-P对不受CaM调控的离子通道的活性没有影响。
综上所述，综上所述，rGO-P可以远程、有效调控与钙调蛋白相关的离子通道，对治疗肿瘤、心房颤动和心房性心律失常提供新的方法和极有潜力的应用。
本发明未尽事宜为公知技术。

Claims (9)

1.一种钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子的制备方法，其特征为该方法包括以下步骤：
a）将氧化石墨烯分散液超声破碎30-120分钟，之后离心除去微米级别的氧化石墨烯；所述的氧化石墨烯分散液浓度为0.5-5mg/mL；
b）将上步得到的溶液用微孔滤膜过滤，得到纳米氧化石墨烯；
c）在50-80℃下，将氧化石墨烯、钙调蛋白结合靶肽、氢氧化钾加入到水中搅拌10-20小时；其中，质量比为氧化石墨烯：钙调蛋白结合肽：氢氧化钾：水=20-50：2-5：100-500：2000-10000；
d）反应完成后，冷却至室温，经超滤管洗脱，得到钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子；
所述的的钙调蛋白结合靶肽是氨基酸序列为NH2-QASERGHITRKKLKGEKK-COOH的靶肽。
2.如权利要求1所述的钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子的制备方法，其特征为所述步骤a）中，超声破碎的超声功率50-200W，离心速度为2000-5000转/分。
3.如权利要求1所述的钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子的制备方法，其特征为所述b）中微孔滤膜材质为尼龙、混合纤维素酯、聚偏氟乙烯、聚醚砜、聚丙烯聚或四氟乙烯，微孔的尺度为0.22或0.45微米。
4.如权利要求1所述的方法制备的钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子的应用，其特征为用于体外调控离子通道或体外调控钙调蛋白的构象变化。
5.如权利要求4所述的方法制备的钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子的应用，其特征为所述的体外用于调控离子通道，包括以下步骤：
a)将细胞接种在铺有细胞爬片的24孔板中，待细胞生长24小时后，每孔加入50μL孵育完成的液体，然后继续培养18～36小时；加入钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子，放入培养箱中继续孵育2-6小时；
其中，细胞接种密度为0.5×105-5×106，所述的孵育完成的液体的孵育步骤包括：将2微克离子通道质粒与6μL X-tremeGENE HP DNA 转染试剂在200μL Opti-MEM培养基里混合，静置20分；
b) 取出爬片，用缓冲液清洗，用近红外光照射爬片上的细胞3-8分钟，完成离子通道的调控；
所述a）中 钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子加入后在24孔板中溶液的浓度为5-50μg/mL。
6.如权利要求5所述的方法制备的钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子的应用，其特征为所述b）中，所述缓冲液为HEPES缓冲液、台氏液、Tris缓冲液、PB缓冲液或PBS缓冲液。
7.如权利要求5所述的钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子的应用，其特征为所述近红外光的波长为750～1500nm，光照强度为0.5-4 W/cm2。
8.如权利要求5所述的钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子的应用，其特征为所述的细胞为HEK 293细胞。
9.如权利要求5所述的方法制备的钙调蛋白特异性结合靶肽修饰的还原型氧化石墨烯纳米粒子的应用，其特征为所述a）中培养箱中为5%二氧化碳，37℃。
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