CN109053515B

CN109053515B - 一种杀草丹半抗原及杀草丹人工抗原的制备方法

Info

Publication number: CN109053515B
Application number: CN201811002822.8A
Authority: CN
Inventors: 周常义; 蔡陈芳; 苏国成
Original assignee: Jimei University
Current assignee: Jimei University
Priority date: 2018-08-30
Filing date: 2018-08-30
Publication date: 2020-10-16
Anticipated expiration: 2038-08-30
Also published as: CN109053515A

Abstract

本发明提供一种杀草丹半抗原及杀草丹人工抗原的制备方法，包括以下步骤：1)羟基化杀草丹合成：向反应容器中加入乙基羟乙胺、硫单质、无水碳酸钾和N,N‑二甲基甲酰胺，在温度40‑60℃下通入一氧化碳常压反应6h，然后加入对氯氯苄，持续反应2h，反应完毕后，进行萃取、分离纯化、旋转蒸发浓缩后获得羟基化杀草丹；2)杀草丹半抗原合成：向反应容器中加入步骤1)获得的羟基化杀草丹、琥珀酸酐和无水吡啶，在温度40‑60℃下反应10‑15h，反应完毕后，加入体积分数为5％盐酸溶液，然后进行氮吹、萃取、再氮吹浓缩、重结晶获得杀草丹半抗原。该方法中杀草丹半抗原合成原料获取容易、价格便宜、反应条件温和；合成的杀草丹半抗原产率在85％以上。

Description

一种杀草丹半抗原及杀草丹人工抗原的制备方法

技术领域

本发明属于化学合成技术领域，具体涉及一种杀草丹半抗原及杀草丹人工抗原的制备方法。

背景技术

杀草丹是一种选择性、内吸传导型除草剂，可被杂草根部及幼牙吸收,抑制其蛋白质的合成。产品主要用于防除水田中的稗草、牛毛毡、鸭舌草、瓜皮草等,也可用于防除旱田马唐、狗尾、野燕麦等。

杀草丹属于小分子农药，不能直接作为免疫原使用，去免疫动物获取相应抗体。杀草丹分子需要通过结构上的修饰，使其具有活性基团，即成为杀草丹半抗原，进而偶联上载体蛋白成为具有免疫活性的杀草丹人工抗原，并通过免疫动物实验获取高特异性抗体。

在建立免疫分析方法并应用该方法检测杀草丹农药残留量时，关键技术在于能够获取到特异性强的抗体，而要实现这一目标，前提条件就是得合成、制备出合适的杀草丹半抗原及其人工抗原。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种杀草丹半抗原及杀草丹人工抗原的制备方法，以解决现有的杀草丹半抗原及杀草丹人工抗原的制备方法成本高，反应条件苛刻等问题。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种杀草丹半抗原的制备方法，包括以下步骤：

1)羟基化杀草丹合成：向反应容器中(例如两口或三口圆底烧瓶、锥形瓶、烧杯等)加入乙基羟乙胺、硫单质、无水碳酸钾和N,N-二甲基甲酰胺，在温度40-60℃下通入一氧化碳常压反应6h，然后加入对氯氯苄，持续反应2h，反应完毕后，进行萃取、分离纯化、旋转蒸发浓缩后获得羟基化杀草丹；

其中，所述乙基羟乙胺：硫单质：无水碳酸钾：N,N-二甲基甲酰胺：对氯氯苄摩尔比为1：1-2：1-2：8-10：1-2；

2)杀草丹半抗原合成：向反应容器中加入步骤1)获得的羟基化杀草丹、琥珀酸酐和无水吡啶，在温度40-60℃下反应10-15h，反应完毕后，加入体积分数为5％盐酸溶液(物质的量浓度为0.6mol/L)，然后进行氮吹、萃取、再氮吹浓缩、重结晶获得杀草丹半抗原；

其中，所述羟基化杀草丹：琥珀酸酐：无水吡啶：盐酸的摩尔比为1：2-5：15-30：15-25。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以有如下进一步的具体选择或优化选择。

具体的，步骤1)中所述硫单质为升华硫。

具体的，步骤1)中所述通入的一氧化碳作为反应原料，通入量为过量。

具体的，步骤1)中所述旋转蒸发浓缩为使用旋转蒸发仪浓缩分离纯化的滤液至4-8mL。

具体的，步骤1)中所述加入对氯氯苄时，将对氯氯苄溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液中(其中对氯氯苄：N,N-二甲基甲酰胺的摩尔比为1：3-5)，缓慢滴入反应液，10-20min滴毕。

具体的，步骤1)中所述萃取为使用乙酸乙酯萃取三次，收集有机相。

具体的，步骤1)中所述分离纯化采用柱层析方法，其中洗脱液为乙酸乙酯-石油醚体积比为2:2-4。

具体的，步骤2)中所述萃取为使用乙酸乙酯萃取二次，收集有机相。

具体的，步骤2)中所述重结晶为使用乙酸乙酯二次结晶。

此外，本发明还提供了一种杀草丹人工抗原的制备方法，包括如下步骤：

1)向反应容器中加入上述方法制备的杀草丹半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺、和N,N-二甲基甲酰胺，室温下震荡10-20min，然后加入N,N-二环己基碳二亚胺，室温下震荡8-12h，反应结束后离心收集上清液；

其中所述杀草丹半抗原：N-羟基琥珀酰亚胺：N,N-二甲基甲酰胺：N,N-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1:120-150：2-3；

2)将步骤1)所述上清液滴加入牛血清蛋白BSA溶液中，磁力搅拌下反应8h，然后置于经前处理过的透析袋中，在温度2-8℃下用浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.40)透析72h，最后获得杀草丹人工抗原；

其中所述上清液：牛血清蛋白BSA溶液的体积比为1～2：10；

3)将步骤2)所述杀草丹人工抗原分装、保存于-20℃冰箱备用。

具体的，步骤1)中所述离心时采用5000rpm，持续2-6min。

具体的，步骤2)中所述透析时每8h更换一次400mL的透析液(即磷酸盐缓冲液)。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：1)杀草丹半抗原合成原料获取容易、价格便宜、反应条件温和；2)合成的杀草丹半抗原产率在85％以上；3)制备的杀草丹人工抗原偶联比为6.59：1，在适宜偶联比区间范围内。

附图说明

图1羟基化杀草丹在ESI(+)模式下一级质谱图；

图2羟基化杀草丹二级质谱图；

图3杀草丹半抗原在ESI(-)模式下质谱扫描图；

图4杀草丹半抗原红外扫描谱图；

图5牛血清蛋白溶液浓度梯度紫外扫描光谱图；

图6杀草丹半抗原溶液梯度浓度紫外扫描光谱图；

图7杀草丹半抗原、牛血清蛋白和人工抗原紫外扫描光谱图；

图8杀草丹半抗原、牛血清蛋白和人工抗原荧光发射光谱图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合附图及具体实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

本发明提供了一种杀草丹半抗原的制备方法，包括以下步骤：

1)羟基化杀草丹合成：向圆底烧瓶中加入乙基羟乙胺、硫单质、无水碳酸钾和N,N-二甲基甲酰胺，在温度40-60℃下通入一氧化碳常压反应6h，然后加入对氯氯苄，持续反应2h，反应完毕后，进行萃取、分离纯化、旋转蒸发浓缩后获得羟基化杀草丹；

其中，所述乙基羟乙胺：硫单质：无水碳酸钾：N,N-二甲基甲酰胺：对氯氯苄摩尔比为2：3：3：20：2；

2)杀草丹半抗原合成：向圆底烧瓶中加入步骤1)获得的羟基化杀草丹、琥珀酸酐和无水吡啶，在温度40-60℃下反应10-15h，反应完毕后，加入体积分数为5％盐酸溶液(用质量分数为37.5％浓盐酸配制的，其物质的量浓度为0.6mol/L)，然后进行氮吹、萃取、再氮吹浓缩、重结晶获得杀草丹半抗原；

其中，羟基化杀草丹：琥珀酸酐：无水吡啶：盐酸的摩尔比为1：2-5：15-30：15-25。

具体的，所述杀草丹半抗原合成路线如下所示：

其中，式1为羟基化杀草丹，式2为杀草丹半抗原。

具体的，步骤1)中所述硫单质为升华硫。

具体的，步骤1)中所述加入对氯氯苄时，将对氯氯苄溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液中，缓慢滴入反应液，10-20min滴毕。

具体的，步骤2)中所述重结晶为使用乙酸乙酯二次结晶。

1)向烧杯中加入上述方法制备的杀草丹半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺、和N,N-二甲基甲酰胺，室温下震荡10-20min，然后加入N,N-二环己基碳二亚胺，室温下震荡8-12h，反应结束后离心收集上清液；

其中所述杀草丹半抗原：N-羟基琥珀酰亚胺：N,N-二甲基甲酰胺摩尔比为1:1:2-3；

2)将步骤1)所述上清液滴加入牛血清蛋白BSA溶液中，磁力搅拌下反应8h，然后置于经前处理过的透析袋中，在温度2-8℃下用磷酸盐缓冲液(浓度为0.01mol/L、pH＝7.40)透析72h，最后获得杀草丹人工抗原。

具体的，所述杀草丹人工抗原合成路线如下所示：

具体的，步骤1)中所述离心时采用5000rpm，持续2-6min。

具体的，步骤2)中所述透析时每8h更换一次400mL的透析液。

具体的，所述杀草丹人工抗原分装并保存于-20℃冰箱备用。

实施例：

羟基化杀草丹合成

用移液枪移取2mL乙基羟乙胺于500mL两口圆底烧瓶内，然后依次加入0.96g升华硫、3.85g无水碳酸钾和15mL N,N-二甲基甲酰胺溶液，轻轻振荡烧瓶，并将其置于45℃水浴锅中进行反应。同时将一氧化碳气体通入圆底烧瓶内，维持烧瓶中压力约0.1MPa，使烧瓶内物质反应近6h。接着称取3.24g对氯氯苄晶体溶于5ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，将该溶液缓慢滴加入两口圆底烧瓶，20min滴毕后，让反应体系保温反应2h。

反应结束，往两口圆底烧瓶中加入100mL超纯水溶解稠状深褐色反应产物，用60mL乙酸乙酯萃取水溶液三次，收集有机相溶液，用5g无水硫酸镁去除有机相溶液中水分，并过0.45μm滤纸，使用旋转蒸发仪浓缩过滤后的滤液。用20mL甲醇溶解30g柱层析硅胶粉末，填充层析柱。将橙红色浓缩液从层析柱顶端加入，配制比例为2:3的乙酸乙酯-石油醚洗脱液，对合成物质进行洗脱、分离纯化，收集洗脱出来的物质。最后，用旋转蒸发仪浓缩得到橙黄色浓稠物，并贮藏于4℃冰箱备用。应用薄层层析法和质谱法分析鉴定该合成物。

杀草丹半抗原合成

称取0.8350g羟基化杀草丹、1.2080g琥珀酸酐于250mL圆底烧瓶中，加入5mL无水吡啶，将烧瓶置于50℃水浴锅中进行反应12h。反应结束后，室温下氮吹去除无水吡啶。然后往烧瓶中加入10mL 5％盐酸溶液溶解反应产物，接着用60mL乙酸乙酯分两次萃取，收集有机相溶液。往有机相溶液中加入5g无水硫酸镁粉末，去除多余水分，并过0.45μm滤纸。40℃水浴中氮吹浓缩过滤后的有机相液体，其过程中有大量晶体物质生成，收集晶体物质。用乙酸乙酯二次结晶纯化反应物。最后干燥反应物，贮藏于4℃冰箱备用。应用质谱法和红外法分析鉴定该合成半抗原。

人工抗原的制备

称取0.0748g(0.2mmol)合成杀草丹半抗原、0.0230g(0.2mmol)N-羟基琥珀酰亚胺于100ml烧杯中，加入2ml N,N-二甲基甲酰胺溶液，室温下振荡15min，溶解反应物质。接着加入0.0516g(0.25mmol)N,N-二环己基碳二亚胺，室温下振荡过夜，反应时间约10h。结束反应后，将反应产物离心处理(5000rpm，5min)，收集上清活性酯液，沉淀物用0.5ml N,N-二甲基甲酰胺溶液洗涤1次，离心合并上清液。

在室温条件下，将上述上清活化酯液滴加入10mL 5mg/mL牛血清蛋白BSA溶液中，磁力搅拌下反应8h。反应结束，将反应物全装入经前处理过的透析袋中，置于4℃环境下，用磷酸盐缓冲液透析72h，每8h更换一次约400mL的透析液，最后将获得的人工抗原溶液分装、保存于-20℃冰箱备用。应用紫外光谱和荧光光谱法分析鉴定制备的人工抗原。

薄层层析法与质谱法分析鉴定羟基化杀草丹

应用薄层层析色谱法分析经分离纯化、浓缩过的羟基化杀草丹样品液，配制体积比为9:1的三氯甲烷-甲醇展开剂，测得比移值R_f＝0.35。

羟基化杀草丹的分子式为C₁₂H₁₆ClNO₂S，相对分子质量为273.8。用色谱级乙腈配制浓度为10μg/ml羟基化杀草丹溶液进行质谱分析，对样液进行一级质谱全扫描，如图1所示，在ESI(+)质谱图中的加H分子量为[M+H]＝274.1，与计算分子量相符合。在母离子确定条件下，对样液进行二级质谱扫描，结果如图2所示，羟基化杀草丹碎片子离子的质荷比分别为116.0和124.9，与文献资料报道相符。由此可确定该合成该物质为羟基化杀草丹。

质谱法与红外光谱法分析鉴定杀草丹半抗原

杀草丹半抗原的分子式为C₁₆H₂₀ClNO₅S，相对分子质量为373.7。采用毛细管法测定杀草丹半抗原的熔点，测定结果表明该产物熔程在182～184℃。杀草丹半抗原的ESI(-)质谱图和红外光谱图如图3、4所示。

用色谱级乙腈配制浓度10μg/ml的杀草丹半抗原样品液进行质谱分析，对样液进行一级质谱全扫描，在ESI(-)质谱图中的减H分子量为[M-H]＝372.0，与计算分子量相符合，初步判定该合成物为杀草丹半抗原。

采用KBr压片法测定杀草丹半抗原的红外光谱，以纯KBr粉末压片作为红外光谱扫描背景值，另称取0.2000g KBr粉末和0.2000g样品研磨混合压片，经红外光谱仪扫描，获取谱图信息。对半抗原的红外吸收光谱分析如表1所示。根据分析结果进一步判定此合成样品为杀草丹半抗原。

表1 杀草丹半抗原红外吸收分析表

杀草丹人工抗原的鉴定

实验中鉴定是否成功制备杀草丹人工抗原，先采用紫外光谱法进行初步判定，然后用荧光光谱法分析进一步确认。

(1)牛血清蛋白与杀草丹半抗原紫外光谱中最大吸收波长的确定

采用紫外可见分光光度计分别扫描系列梯度浓度的牛血清蛋白溶液和杀草丹半抗原溶液，测定结果表明，牛血清蛋白最大吸收波长在278nm、杀草丹半抗原最大吸收波长在221nm。牛血清蛋白溶液梯度浓度与杀草丹半抗原溶液梯度浓度的紫外扫描光谱图分别如图5、图6所示。

(2)人工抗原紫外可见光谱法分析

设置紫外扫描波长范围200-400nm，对杀草丹半抗原溶液、牛血清蛋白溶液和人工抗原溶液进行紫外谱扫描。由紫外光谱扫描图图7上可见，偶联前杀草丹半抗原在221nm处有特征吸收峰，而牛血清载体蛋白在278nm处有特征吸收峰，偶联后的人工抗原特征吸收峰出现在260nm处，明显不同于半抗原和载体蛋白吸收曲线，对比发现其吸收峰发生了偏移，可初步判定牛血清载体蛋白上面偶联上了杀草丹半抗原分子。

(3)人工抗原荧光光谱法分析

设置激发波长为278nm，发射波长扫描范围200-900nm，对杀草丹半抗原溶液、牛血清载体蛋白溶液和人工抗原溶液进行荧光光谱分析。从荧光发射光谱图图8可以看出，杀草丹半抗原在扫描波长内没有荧光峰产生；牛血清载体蛋白在340nm处有荧光峰出现，这与文献资料报道相一致，由于牛血清蛋白上含有色氨基酸残基，而色氨基酸残基与酪氨酸残基能使蛋白质产生内源荧光，其荧光峰位于348nm附近；人工抗原在340nm处的荧光强度明显降低，同时在560nm附近产生了新的荧光峰，表明牛血清载体蛋白上偶联了杀草丹半抗原分子，因为杀草丹半抗原是通过与载体蛋白中氨基反应而结合上的，致使载体蛋白上氨基酸残基受到影响，进而表现为对牛血清载体蛋白具有一定荧光猝灭作用。

(4)人工抗原中蛋白含量的确定与其偶联比的计算

人工抗原中蛋白质含量测定采用的是考马斯亮蓝法。绘制出以牛血清蛋白BSA溶液浓度为横坐标、其吸光度值为纵坐标的蛋白质浓度标准曲线，然后依据标准曲线计算出人工抗原中蛋白质的含量。

人工抗原中半抗原与载体蛋白的偶联比计算公式为：

其中：C_TBC/C_BSA——人工抗原中杀草丹半抗原与牛血清蛋白的偶联比；

K＝A/C——K为物质的摩尔消光系数、A为物质的吸光度、C为物质的质量浓度；

——人工抗原分别在半抗原和载体蛋白最大吸收波长处的吸光值；

——牛血清蛋白分别在杀草丹半抗原和其本身最大吸收波长处的摩尔消光系数；

——杀草丹半抗原分别在其本身和牛血清蛋白最大吸收波长处的摩尔消光系数。

通过对数据进行线性回归拟合处理，得到了牛血清蛋白BSA浓度标准曲线的线性回归方程式，即Y＝10.125X+0.0081(Y为吸光度，X为牛血清蛋白浓度mg/mL，R²＝0.9994)，吸光度符合线性要求。制备的人工抗原中蛋白质含量计算结果与相对应的人工抗原偶联比计算结果如表2所示。

表2 不同反应条件下制备的人工抗原中蛋白质浓度与其偶联比

由表2可看出，杀草丹人工抗原中的蛋白浓度和偶联比是受反应温度影响的。室温条件下反应获得的杀草丹人工抗原，其原液中蛋白浓度和偶联比明显高于冰浴条件下反应获得的人工抗原。因此，选择室温条件作为制备杀草丹人工抗原的最佳反应温度。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种杀草丹半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)羟基化杀草丹合成：向反应容器中加入乙基羟乙胺、硫单质、无水碳酸钾和N,N-二甲基甲酰胺，在温度40-60℃下通入一氧化碳常压反应6h，然后加入对氯氯苄，持续反应2h，反应完毕后，进行萃取、分离纯化、旋转蒸发浓缩后获得羟基化杀草丹；

其中，式1为羟基化杀草丹，所述乙基羟乙胺：硫单质：无水碳酸钾：N,N-二甲基甲酰胺：对氯氯苄的摩尔比为1：1-2：1-2：8-10：1-2；

2)杀草丹半抗原合成：向反应容器中加入步骤1)获得的羟基化杀草丹、琥珀酸酐和无水吡啶，在温度40-60℃下反应10-15h，反应完毕后，加入体积分数为5％盐酸溶液，然后进行氮吹、萃取、再氮吹浓缩、重结晶获得杀草丹半抗原；

其中，式2为杀草丹半抗原,所述羟基化杀草丹：琥珀酸酐：无水吡啶：盐酸的摩尔比为1：2-5：15-30：15-25。

2.根据权利要求1所述的一种杀草丹半抗原的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述加入对氯氯苄时，将对氯氯苄溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液中，缓慢滴入反应液，10-20min滴毕。

3.根据权利要求1所述的一种杀草丹半抗原的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述萃取为使用乙酸乙酯萃取三次，收集有机相。

4.根据权利要求1所述的一种杀草丹半抗原的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述分离纯化采用柱层析方法，其中洗脱液为乙酸乙酯-石油醚体积比为2:2-4。

5.根据权利要求1所述的一种杀草丹半抗原的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述重结晶为使用乙酸乙酯二次结晶。

6.一种杀草丹人工抗原的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)向反应容器中加入使用权利要求1-5任一项的方法制备的杀草丹半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二甲基甲酰胺，室温下震荡10-20min，然后加入N,N-二环己基碳二亚胺，室温下震荡8-12h，反应结束后离心收集上清液；

2)将步骤1)所述上清液滴加入牛血清蛋白BSA溶液中，磁力搅拌下反应8h，然后置于经前处理过的透析袋中，在温度2-8℃下用浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液透析72h，最后获得杀草丹人工抗原；

其中所述上清液：牛血清蛋白BSA溶液的体积比为1～2：10；

3)将步骤2)所述杀草丹人工抗原分装、保存于-20℃冰箱备用。

7.根据权利要求6所述的一种杀草丹人工抗原的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述离心时采用5000rpm，持续2-6min。

8.根据权利要求6所述的一种杀草丹人工抗原的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述透析时每8h更换一次400mL的磷酸盐缓冲液。