CN109022537B - 一种快速评价柑橘溃疡病药剂药效的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于柑橘病害防治技术领域，尤其是一种快速评价柑橘溃疡病药剂药效的方法。一种快速评价柑橘溃疡病药剂药效的方法，包括如下步骤：(1)接种用主要器具准备；(2)柑橘溃疡病病叶采集；(3)柑橘健康离体叶片采集；(4)溃疡病叶片处置；(5)离体叶片处置；(6)接种病菌；(7)接种后药剂处置和(8)药剂后处置。本发明的方法所用器具简单，无高难度技术操作，简单易行；跳过细菌液准备阶段，缩短病菌接种时间，占用空间小；发病症状同田间症状一致，易识别，药剂防治效果差异显著，接种发病条件容易控制，容易实现技术方法的标准化。

Description

一种快速评价柑橘溃疡病药剂药效的方法
技术领域
本发明属于柑橘病害防治技术领域，尤其是一种快速评价柑橘溃疡病药剂药效的方法。
背景技术
在柑橘病虫害防治领域的农药药效试验中，除了田间喷洒预防实验之外，由于相对环境较好控制，实验室中模拟病害发生的方法也广泛应用，相关研究均需要人工接种发病这一基本手段。而病害人工发病的方法可以选择活体接种或离体接种，其中活体接种的优点是更能反映病菌发病的本貌，缺点是试验周期长，占用较多空间和资源，常处于多因子环境中，局部条件控制较困难；离体接种则可以节省时间，节约资源，实施难度减小，提高试验规模和效率。许多研究结果也表明，离体接种结果和活体接种是一致的，因此植物病虫害的相关研究均采用离体接种方式进行。
柑橘溃疡病是一种危害性很大的细菌性病害，已被多国和地区列为检疫对象，其特点是传染性强，传染途径多样，病害发生后影响树体生长，严重的降低果实商品率，影响柑橘产业发展。
一般植物病虫害防治药剂的筛选评价，通常采用大田喷药试验和实验室接种试验，大田试验通常对植株进行药剂处理，和CK株发病率做比较，以评价药效，实验室方法如管碟法比较药剂所产生的抑菌圈评价药剂对病菌的抑制作用。近年来，柑橘产业蓬勃发展，其中不乏对柑橘溃疡病敏感的品种大量种植和推广，柑橘溃疡病的防治也刻不容缓，而由于柑橘种植企业、个人的种植栽培技术和经验良莠不齐，给其防治带来较大困难。除了传统防治柑橘溃疡病的铜制剂、抗生素、乙蒜素之外，市场上也充斥着大量新型柑橘溃疡病防治药剂，要评价该类药剂是否有效，传统药剂筛选，大田试验周期过长，效率低，环境复杂，条件难以控制；而实验室药剂筛选的具体操作需要较好植物学、微生物学知识背景为基础。要达到简化操作的目的，使更多普通种植者能自行检验并实际操作，急需开发一种新的快速检测方法。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种快速评价柑橘溃疡病药剂药效的方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种快速评价柑橘溃疡病药剂药效的方法，包括以下步骤：
(1)接种用器具的准备：用接种针、消毒剪刀、研钵、灭菌滤纸、溃疡病防治药剂和普通培养皿做接种用器具，培养皿规格视不同品种柑橘叶片大小而定，清洁消毒后备用；
(2)柑橘溃疡病叶采集：选取明显溃疡病病症特征的叶片作为菌种来源，叶片发病病症特点是病灶部位周围有明显黄色菌圈，发病中期时病灶中心为木栓化，呈火山口开裂状；
(3)柑橘健康离体叶片采集：选用叶片为本次梢期所生叶面积已展开至最大，颜色转绿的新叶，用消毒剪刀剪取与步骤(1)中相应培养皿规格大小近似的叶片作为供试材料；
(4)溃疡病叶片的处置：将步骤(2)准备的溃疡病叶片表面进行清洗，采用75％酒精进行简单消毒，用消毒剪刀将叶片上病斑延菌圈分界处剪下，去掉中间木栓化病灶部，减少杂菌侵入，将剪下的菌圈叶片组织放入研钵，加入5mL无菌水，进行研磨后静置5min，吸取上清菌液，备用；
(5)离体叶片的处置：打开步骤(1)备好的培养皿皿盖，将灭菌滤纸平铺在培养皿底部，取步骤(3)准备的离体叶片，用接种针在离体叶片正面选3个部位进行针刺处理，针头完全穿过叶片组织，每部位3针，每片叶共9针；
(6)接种病菌：将步骤(1)准备的灭菌滤纸剪成圆或方形小片，吸足菌液后贴在3个针刺点为一组的部位上；
(7)接种后药剂处置：配制步骤(1)准备的溃疡病防治药剂溶液，在接种1h后滴在所接种病菌的滤纸小片上，每纸片1滴，CK滴1滴无菌水；
(8)药剂后处置：在步骤(7)处理过的叶片上部覆盖一张灭菌滤纸，在滤纸表面喷洒无菌水保湿，盖上皿盖，置于28℃培养箱中培养，在5-10d内观察发病情况，统计、比较各组处理的发病率。
作为优选，步骤(4)中剪下的菌圈叶片组织要通过预实验，将10个菌圈的叶片组织剪下，在3mL无菌水中研磨，所提取接种液可使对溃疡病敏感的柑橘品种健康叶片的发病率超过70％。
作为优选，步骤(6)中圆或方形小片的大小能覆盖每个穿刺区域的3个针孔。
作为优选，步骤(8)中灭菌滤纸的大小与培养皿大小一致。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的方法所用器具简单，操作方便；供试材料叶片、菌源来源广，采集方便；直接跳过细菌培养阶段，大幅度缩减筛选试验周期，提高筛选效率；且接种发病条件容易控制，易实现方法的标准化。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1
一种快速评价柑橘溃疡病药剂药效的方法，在沃柑离体叶片上接种溃疡病病菌，按如下步骤操作：
1)接种用主要器具准备：用接种针、消毒剪刀、研钵、灭菌滤纸、溃疡病防治药剂和普通培养皿做接种用主要器具，培养皿规格视不同品种柑橘叶片大小而定，清洁消毒后备用；
2)柑橘溃疡病叶采集：主要选取明显溃疡病病症特征的叶片作为菌种来源，叶片发病病症特点是病灶部位周围有明显黄色菌圈，发病中期时病灶中心为木栓化，呈火山口开裂状；
3)柑橘健康离体叶片采集：选用叶片为本次梢期所生叶面积已展开至最大，颜色转绿的新叶，用消毒剪刀剪取与步骤1)相应培养皿规格大小近似的叶片作为供试材料；
4)溃疡病叶片处置：将步骤2)准备的溃疡病叶片表面进行清洗，采用75％酒精进行简单消毒，用消毒剪刀将叶片上病斑延菌圈分界处剪下，去掉中间木栓化病灶部，减少杂菌侵入，将剪下的菌圈叶片组织(通过预实验，将10个菌圈的叶片组织剪下，在3ml无菌水中研磨，所提取接种液可使对溃疡病敏感的柑橘品种健康叶片的发病率超过70％)，放入研钵，加入5ml无菌水，进行研磨后静置5min，吸取上清菌液备用；
5)离体叶片处置：打开步骤1)备好的培养皿皿盖，将灭菌滤纸平铺在培养皿底部，取步骤3)准备的离体叶片，用接种针在离体叶片正面选3个部位进行针刺处理(针头完全穿过叶片组织)，每部位3针，每片叶共9针；
6)接种病菌：将步骤1)准备的灭菌滤纸剪成圆或方形小片，大小以足够覆盖每个穿刺区域的3个针孔为宜，吸足菌液后贴在3个针刺点为一组的部位上(如图1所示)；
7)接种后药剂处置：配制步骤1)准备的溃疡病防治药剂溶液，在接种1h后滴在所接种病菌的滤纸小片上，每纸片1滴，CK滴1滴无菌水；
8)药剂后处置：在步骤7)处理过的叶片上部覆盖一张灭菌滤纸，滤纸大小与培养皿大小一致，在滤纸表面喷洒无菌水保湿，盖上皿盖(如图2所示)，置于28℃培养箱中培养，在5-10d内观察发病情况，统计、比较各组处理的发病率。
结果表现出如图3、图4一样的肉眼可辨的小病斑；图3为CK发病症状，图4为药剂处理发病症状。
实施例2
一种快速评价柑橘溃疡病药剂药效的方法，在茂谷柑离体叶片上接种溃疡病病菌，按实施例1的步骤(1)-(8)操作实施。
结果表现出如图5、图6一样的病斑，图5为CK发病症状，图6为药剂处理发病症状。
实施例3
一种快速评价柑橘溃疡病药剂药效的方法，在砂糖橘离体叶片上接种溃疡病病菌，按实施例1的步骤(1)-(8)操作实施。
结果表现出如图7、图8一样的病斑，图7为CK发病症状，图8为药剂处理发病症状。
实施例4
一种快速评价柑橘溃疡病药剂药效的方法，在纽荷尔脐橙离体叶片上接种溃疡病病菌，按实施例1的步骤(1)-(8)操作实施。
结果表现出如图9、图10一样的病斑，图9为CK发病症状，图10为药剂处理发病症状。
对上述实施例1-4中柑橘溃疡病的发病率进行调查、统计，结果见表1。
表1药剂处理后溃疡病发病率统计结果
Figure BDA0001772604990000061
如表1所示，与传统方法相比，本发明的方法直接跳过细菌培养阶段，可以大大缩减试验周期，明显提高筛选药剂的效率；且方法中接种发病条件容易控制，易实现方法的标准化。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (3)

1.一种快速评价柑橘溃疡病药剂药效的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)接种用器具的准备：用接种针、消毒剪刀、研钵、灭菌滤纸、溃疡病防治药剂和普通培养皿做接种用器具，培养皿规格视不同品种柑橘叶片大小而定，清洁消毒后备用；
(2)柑橘溃疡病叶采集：选取明显溃疡病病症特征的叶片作为菌种来源，叶片发病病症特点是病灶部位周围有明显黄色菌圈，发病中期时病灶中心为木栓化，呈火山口开裂状；
(3)柑橘健康离体叶片采集：选用叶片为本次梢期所生叶面积已展开至最大，颜色转绿的新叶，用消毒剪刀剪取与步骤(1)中相应培养皿规格大小近似的叶片作为供试材料；
(4)溃疡病叶片的处置：将步骤(2)准备的溃疡病叶片表面进行清洗，采用75％酒精进行简单消毒，用消毒剪刀将叶片上病斑延菌圈分界处剪下，去掉中间木栓化病灶部，减少杂菌侵入，将剪下的菌圈叶片组织放入研钵，加入5mL无菌水，进行研磨后静置5min，吸取上清菌液，备用；
(5)离体叶片的处置：打开步骤(1)备好的培养皿皿盖，将灭菌滤纸平铺在培养皿底部，取步骤(3)准备的离体叶片，用接种针在离体叶片正面选3个部位进行针刺处理，针头完全穿过叶片组织，每部位3针，每片叶共9针；
(6)接种病菌：将步骤(1)准备的灭菌滤纸剪成圆或方形小片，吸足菌液后贴在3个针刺点为一组的部位上；
(7)接种后药剂处置：配制步骤(1)准备的溃疡病防治药剂溶液，在接种1h后滴在所接种病菌的滤纸小片上，每纸片1滴，CK滴1滴无菌水；
(8)药剂后处置：在步骤(7)处理过的叶片上部覆盖一张灭菌滤纸，在滤纸表面喷洒无菌水保湿，盖上皿盖，置于28℃培养箱中培养，在5-10d内观察发病情况，统计、比较各组处理的发病率；
其中，步骤(4)中剪下的菌圈叶片组织要通过预实验，将10个菌圈的叶片组织剪下，在3mL无菌水中研磨，所提取接种液可使对溃疡病敏感的柑橘品种健康叶片的发病率超过70％。
2.根据权利要求1所述的快速评价柑橘溃疡病药剂药效的方法，其特征在于，步骤(6)中圆或方形小片的大小能覆盖每个穿刺区域的3个针孔。
3.根据权利要求1所述的快速评价柑橘溃疡病药剂药效的方法，其特征在于，步骤(8)中灭菌滤纸的大小与培养皿大小一致。
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