CN109022381A - 氨基酸脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了氨基酸脱氢酶突变体及其应用。该氨基酸脱氢酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点之一：第64位、第94位、第133位、第137位、第148位、第168位、第173位、第183位、第191位、第207位、第229位、第248位、第255位和第282位；或者氨基酸脱氢酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。本发明的氨基酸脱氢酶突变体具有酶活性大幅度提高的优势，其酶活相对于野生型氨基酸脱氢酶提高了大于50倍，并且酶特异性也有相应提高。

Description

氨基酸脱氢酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种氨基酸脱氢酶突变体及其应用。
背景技术
氨基酸是至少有一个羧基和一个氨基的两性化合物，按照氨基酸的存在方式，可以分为天然氨基酸和非天然氨基酸两类，天然氨基酸是自然界中存在的氨基酸，非天然氨基酸是由人工合成的氨基酸，一般是在天然氨基酸的侧链上引入一些基团以优化其性能。氨基酸及其衍生物因为其特殊的结构的性质在农业、工业、化工、食品、医药等方面有着广泛的应用。光学活性的非天然氨基酸是一些生物活性肽的手性合成单元，也是许多药物和精细化学品的重要中间体。
随着科学研究的深入以及新药的开发，D-氨基酸在药物开发制备以及食品领域中具有了越来越重要的地位。
D-氨基酸的酶法合成主要有转氨酶(Appl.Microbiol.Biot.2008,79,775-784)和氨基酸脱氢酶(Journal of the American Chemical Society,2006,128(33):10923-10929)。氨基酸脱氢酶可以从潜手性酮酸为底物出发，利用游离的NH4 +作为氨基供体，在辅酶循环体系的存在下，合成手性氨基酸，是一种绿色经济的方法。
然而自然界存在的D-氨基酸脱氢酶底物谱非常有限，对大多数底物，尤其是空间位阻较大的底物，反应活性很低，反应中底物浓度不高，酶上载量很大，成本较高。一般而言，可以通过定向进化的手段对野生酶进行改造，提高酶的各种性质，从而可以应用在生产中。
发明内容
本发明旨在提供一种氨基酸脱氢酶突变体及其应用，以解决现有技术中现有技术中野生型的氨基酸脱氢酶不适合应用于工业化生产的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种氨基酸脱氢酶突变体。该氨基酸脱氢酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点之一：第64位、第94位、第133位、第137位、第148位、第168位、第173位、第183位、第191位、第207位、第229位、第248位、第255位和第282位，且第64位的赖氨酸突变为天冬氨酸；第94位的天冬氨酸突变为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸；第133位的半胱氨酸突变为丙氨酸或苏氨酸；第137位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；第148位的苯丙氨酸突变为缬氨酸或丙氨酸；第168位的天冬酰胺突变为天冬氨酸；第173位的苏氨酸突变为丝氨酸、组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸；第183位的精氨酸突变为苯丙氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、丙氨酸或亮氨酸；第191位的脯氨酸突变为谷氨酸；第207位的酪氨酸突变为精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸；第229位的组氨酸突变为缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸；第248为的丝氨酸突变为谷氨酸；第255位的天冬酰胺突变为丙氨酸、谷氨酰胺或天冬氨酸；第282位的谷氨酰胺突变为谷氨酸；或者氨基酸脱氢酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
进一步地，突变至少包括如下突变位点之一：第64位的赖氨酸突变为天冬氨酸；第94位的天冬氨酸突变为丝氨酸；第133位的半胱氨酸突变为苏氨酸；第137位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；第148位的苯丙氨酸突变为缬氨酸；第173位的苏氨酸突变为苯丙氨酸；第183位的精氨酸突变为苯丙氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、缬氨酸或亮氨酸；第191位的脯氨酸突变为谷氨酸；第229位的组氨酸突变为缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸；
优选的，突变至少包括如下突变位点组合之一：第183位的精氨酸突变为半胱氨酸和第229位的组氨酸突变为丝氨酸；第183位的精氨酸突变为缬氨酸和第229位的组氨酸突变为丝氨酸；第183位的精氨酸突变为亮氨酸和第229位的组氨酸突变为丙氨酸；第173位的苏氨酸突变为苯丙氨酸和第183位的精氨酸突变为半胱氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸和第229位的组氨酸突变为亮氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸和第207位的酪氨酸突变为精氨酸；第183位的精氨酸突变为丙氨酸和第229位的组氨酸突变为丝氨酸；第183位的精氨酸突变为缬氨酸和第229位的组氨酸突变为天冬酰胺；第173位的苏氨酸突变为组氨酸和第229位的组氨酸突变为丝氨酸；
优选的，突变至少包括如下突变位点组合之一：第183位的精氨酸突变为半胱氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第148位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第207位的酪氨酸突变为精氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第148位的苯丙氨酸突变为缬氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第173位的苏氨酸突变为苯丙氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第173位的苏氨酸突变为色氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第207位的酪氨酸突变为谷氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第207位的酪氨酸突变为精氨酸；第183位的精氨酸突变为丙氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第173位的苏氨酸突变为组氨酸；第183位的精氨酸突变为缬氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第173位的苏氨酸突变为组氨酸；第183位的精氨酸突变为缬氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第148位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；第173位的苏氨酸突变为组氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第148位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；
或者氨基酸脱氢酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有95％以上同源性的氨基酸序列。
根据本发明的另一个方面，提供了一种DNA分子。该DNA分子编码上述任一种氨基酸脱氢酶突变体。
根据本发明的再一个方面，提供了一种重组质粒。该重组质粒含有上述任一种DNA分子。
进一步地，重组质粒为pET-22b(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19。
根据本发明的又一个方面，提供了一种宿主细胞。该宿主细胞含有上述任一种重组质粒。
进一步地，宿主细胞包括原核细胞、酵母或真核细胞；优选原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞。
根据本发明的再一个方面，提供了一种生产D-氨基酸的方法。该方法包括采用氨基酸脱氢酶对酮类化合物进行催化还原氨化反应的步骤，氨基酸脱氢酶为上述任一种氨基酸脱氢酶突变体。
进一步地，酮类化合物为还原氨化反应产物为
进一步地，还原氨化反应中的氨基供体为氯化铵。
本发明的上述氨基酸脱氢酶突变体是在SEQ ID NO：1所示的氨基酸脱氢酶基础上，通过定点突变的方法进行突变，从而改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到具有上述突变位点的氨基酸脱氢酶，本发明的氨基酸脱氢酶突变体具有酶活性大幅度提高的优势，其酶活相对于野生型氨基酸脱氢酶提高了大于50倍，并且酶特异性也有相应提高，从而大幅度降低了D-氨基酸工业生产中的成本。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
本发明的发明人通过定向进化的方法提高氨基酸脱氢酶SEQ ID NO：1
(MGEKIRVAIVGYGNIGRYALDAIKAAPDMELAGVVRRSSSLGDKPAELADVPVVGSIKELTGVKVALLCTPTRSVPEYAREILALGINTVDSYDIHGQLADLRLELDKVAKEHNAVAVISAGWDPGTDSMVRCMFEFMAPKGITYTNFGPGMSMGHSVAVKAVKGVKNALSMTIPLGTGVHRRMVYVELEPGADFAQVEKAVKTDPYFVKDETHVIQVEDVDALIDMGHGVLMERKGVSGGTHNQLLSFSMRINNPALTAQIMVASARASVKQKPGAYTMIQIPIIDYMYGDPDEIIRQLV，对应的核苷酸序列SEQ ID NO：2：
ATGGGTGAAAAAATTCGCGTTGCAATCGTTGGTTACGGCAACATTGGCCGTTATGCCCTGGATGCAATCAAAGCCGCACCGGATATGGAACTGGCCGGCGTGGTGCGCCGTAGTAGCAGTCTGGGCGACAAGCCGGCCGAACTGGCAGATGTGCCTGTTGTGGGCAGCATCAAAGAGCTGACCGGTGTGAAAGTTGCACTGCTGTGCACCCCGACCCGCAGTGTTCCGGAATATGCCCGTGAGATTCTGGCCCTGGGCATCAACACCGTGGATAGCTATGACATCCACGGTCAGCTGGCCGATCTGCGTCTGGAGCTGGATAAAGTGGCCAAAGAACACAACGCCGTGGCCGTGATTAGCGCAGGTTGGGACCCTGGCACCGATAGCATGGTTCGCTGCATGTTCGAGTTTATGGCCCCGAAGGGCATCACCTATACCAATTTCGGTCCGGGCATGAGCATGGGTCACAGCGTGGCCGTTAAAGCCGTGAAGGGCGTGAAAAATGCCCTGAGCATGACCATTCCGCTGGGCACCGGTGTTCATCGTCGTATGGTGTATGTGGAGCTGGAACCTGGTGCCGATTTCGCCCAGGTGGAAAAGGCCGTGAAAACCGATCCGTACTTCGTGAAGGATGAGACCCACGTGATTCAGGTGGAAGACGTGGACGCCCTGATTGATATGGGCCATGGCGTTCTGATGGAACGTAAGGGCGTTAGCGGTGGCACCCATAACCAGCTGCTGAGCTTCAGTATGCGTATCAATAACCCGGCCCTGACCGCCCAGATTATGGTGGCCAGCGCCCGTGCCAGCGTGAAACAGAAACCGGGCGCATACACCATGATCCAGATTCCGATCATTGATTACATGTACGGCGACCCGGATGAGATCATTCGTCAGCTGGTGTAA)的活性与稳定性，降低酶的使用量。首先通过全质粒PCR的方式在氨基酸脱氢酶SEQ ID NO：1上引入突变位点，对突变体进行活性和稳定性检测，挑选活性或稳定性提高的突变体。
以野生型氨基酸脱氢酶SEQ ID NO：1为模版，设计了43对定点突变引物(K64D，D94A，D94G，D94V，D94S，C133A，C133T，F137A，F148V，F148A，N168D，T173S，T173F，T173H，T173W，T173L，R183F，R183K，R183L，R183C，R183V，R183A，P191E，Y207F，Y207R，Y207E，Y207V，H229V，H229A，H229N，H229G，H229S，H229T，S248E，N255A，N255Q，N255D，Q282E)利用定点突变手段，以pET-22b(+)为表达载体，获得带有目的基因的突变质粒。
其中，定点突变：是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
利用全质粒PCR引入定点突变的方法简单有效，是目前使用比较多的手段。其原理是，一对包含突变位点的引物(正、反向)，和模版质粒退火后用聚合酶“循环延伸”，所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn I酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对Dpn I敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
上述得将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内，在大肠杆菌中过量表达。然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。氨基酸脱氢酶诱导表达最佳条件：25℃，0.1mM IPTG诱导过夜。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种氨基酸脱氢酶突变体。该氨基酸脱氢酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点之一：第64位、第94位、第133位、第137位、第148位、第168位、第173位、第183位、第191位、第207位、第229位、第248位、第255位和第282位，且所述第64位的赖氨酸突变为天冬氨酸；第94位的天冬氨酸突变为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸；第133位的半胱氨酸突变为丙氨酸或苏氨酸；第137位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；第148位的苯丙氨酸突变为缬氨酸或丙氨酸；第168位的天冬酰胺突变为天冬氨酸；第173位的苏氨酸突变为丝氨酸、组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸；第183位的精氨酸突变为苯丙氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、丙氨酸或亮氨酸；第191位的脯氨酸突变为谷氨酸；第207位的酪氨酸突变为精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸；第229位的组氨酸突变为缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸；第248为的丝氨酸突变为谷氨酸；第255位的天冬酰胺突变为丙氨酸、谷氨酰胺或天冬氨酸；第282位的谷氨酰胺突变为谷氨酸；或者氨基酸脱氢酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
优选的，突变至少包括如下突变位点之一：第64位的赖氨酸突变为天冬氨酸；第94位的天冬氨酸突变为丝氨酸；第133位的半胱氨酸突变为苏氨酸；第137位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；第148位的苯丙氨酸突变为缬氨酸；第173位的苏氨酸突变为苯丙氨酸；第183位的精氨酸突变为苯丙氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、缬氨酸或亮氨酸；第191位的脯氨酸突变为谷氨酸；第229位的组氨酸突变为缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸；
优选的，突变至少包括如下突变位点组合之一：第183位的精氨酸突变为半胱氨酸和第229位的组氨酸突变为丝氨酸；第183位的精氨酸突变为缬氨酸和第229位的组氨酸突变为丝氨酸；第183位的精氨酸突变为亮氨酸和第229位的组氨酸突变为丙氨酸；第173位的苏氨酸突变为苯丙氨酸和第183位的精氨酸突变为半胱氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸和第229位的组氨酸突变为亮氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸和第207位的酪氨酸突变为精氨酸；第183位的精氨酸突变为丙氨酸和第229位的组氨酸突变为丝氨酸；第183位的精氨酸突变为缬氨酸和第229位的组氨酸突变为天冬酰胺；第173位的苏氨酸突变为组氨酸和第229位的组氨酸突变为丝氨酸；
优选的，突变至少包括如下突变位点组合之一：第183位的精氨酸突变为半胱氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第148位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第207位的酪氨酸突变为精氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第148位的苯丙氨酸突变为缬氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第173位的苏氨酸突变为苯丙氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第173位的苏氨酸突变为色氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第207位的酪氨酸突变为谷氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第207位的酪氨酸突变为精氨酸；第183位的精氨酸突变为丙氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第173位的苏氨酸突变为组氨酸；第183位的精氨酸突变为缬氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第173位的苏氨酸突变为组氨酸；第183位的精氨酸突变为缬氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第148位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；第173位的苏氨酸突变为组氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第148位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；
或者氨基酸脱氢酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有95％以上同源性的氨基酸序列。本文使用的术语“同源性”具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知测定不同序列间同源性的规则、标准。本发明用不同程度同源性限定的序列还必须要同时具有改进的氨基酸脱氢酶活性。
本发明的上述氨基酸脱氢酶突变体是在SEQ ID NO：1所示的氨基酸脱氢酶的基础上，通过定点突变的方法进行突变，从而改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到具有上述突变位点的氨基酸脱氢酶，本发明的氨基酸脱氢酶突变体具有酶活性大幅度提高的优势，其酶活相对于氨基酸脱氢酶提高了大于50倍，并且酶特异性也有相应提高，从而大幅度降低了工业生产的成本。
根据本发明一种典型的实施方式，野生型氨基酸脱氢酶第64位的赖氨酸突变为天冬氨酸；第94位的天冬氨酸突变为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸；第133位的半胱氨酸突变为丙氨酸或苏氨酸；第137位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；第148位的苯丙氨酸突变为缬氨酸；第168位的天冬酰胺突变为天冬氨酸；第173位的苏氨酸突变为丝氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸；第183为的精氨酸突变为苯丙氨酸、赖氨酸或亮氨酸；第191位的脯氨酸突变为谷氨酸；第207位的酪氨酸突变为苯丙氨酸或缬氨酸；第229位的组氨酸突变为缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸；第248为的丝氨酸突变为谷氨酸；第255位的天冬酰胺突变为丙氨酸、谷氨酰胺或天冬氨酸；第282位的谷氨酰胺突变为谷氨酸。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种DNA分子。上述DNA编码得到的氨基酸脱氢酶，提高了酶活性和酶的稳定性，在D-氨基酸的工业生产中可以减少加入的酶量，降低后处理难度。
本发明的上述DNA分子还可以以“表达盒”的形式存在。“表达盒”是指线性或环状的核酸分子，涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的DNA和RNA序列。一般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但在正义或反义方向也编码目标功能RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得的。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种重组质粒。该重组质粒含有上述任一种DNA分子。上述重组质粒中的DNA分子置于重组质粒的适当位置，使得上述DNA分子能够正确地、顺利地复制、转录或表达。
虽然本发明在限定上述DNA分子时所用限定语为“含有”，但其并不意味着可以在DNA序列的两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在DNA序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。
本发明中所使用的术语“质粒”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达质粒，可以是原核表达质粒也可以是真核表达质粒，但优选原核表达质粒，在某些实施方案中，重组质粒选自pET-22b(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19。更优选，上述重组质粒是pET-22b(+)。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种宿主细胞，宿主细胞含有上述任一种重组质粒。适用于本发明的宿主细胞包括但不仅限于原核细胞、酵母或真核细胞。优选原核细胞为真细菌，例如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。更优选原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种生产D-氨基酸的方法。该方法包括氨基酸脱氢酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的步骤，氨基酸脱氢酶为上述任一种氨基酸脱氢酶突变体。由于本发明的上述氨基酸脱氢酶突变体具有更高的酶催化活性，因而利用本发明的氨基酸脱氢酶突变体制备的D-氨基酸不仅能够降低生产成本，而且所获得的D-氨基酸ee值大于99％。
根据本发明一种典型的实施方式，酮类化合物为还原氨化反应产物为反应式为
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。且下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
实施例1
底物1加入20mg，1mL反应体系，氯化铵22mg，葡萄糖30mg，葡萄糖脱氢酶4mg，NAD+0.4mg，氨基酸脱氢酶4mg，0.1M Tris-HCl buffer。30℃反应18h，100μL体系加入900μL(0.1N HCl：MeOH＝1：1)，12000rpm离心3min，取上清进行检测。检测ee值方法：取100μL反应体系，加100μL ACN，100μL H2O，100μL 1M NaHCO3，12000rpm离心3min，取出上清，加入200μL5mg/mL Na-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙胺酰胺，50℃ 1h，加500μL ACN离心后取上清进行液相分析。
活性相比母本提高的倍数，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍。
ee值在80-90％的*，ee值在90-98％的**，ee值大于98％的***
实施例2
底物2加入20mg，1mL反应体系，氯化铵22mg，葡萄糖30mg，葡萄糖脱氢酶4mg，NAD+0.4mg，氨基酸脱氢酶4mg，0.1M Tris-HCl buffer。30℃反应18h，100μL体系加入900μL(0.1N HCl：MeOH＝1：1)，12000rpm离心3min，取上清进行检测。检测ee值方法：取100μL反应体系，加100μL ACN，100μL H2O，100μL 1M NaHCO3，12000rpm离心3min，取出上清，加入200μL5mg/mL Na-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙胺酰胺，50℃ 1h，加500μL ACN离心后取上清进行液相分析。
活性相比母本提高的倍数，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍。
ee值在80-90％的*，ee值在90-98％的**，ee值大于98％的***
实施例3
底物3加入20mg，1mL反应体系，氯化铵22mg，葡萄糖30mg，葡萄糖脱氢酶4mg，NAD+0.4mg，氨基酸脱氢酶4mg，0.1M Tris-HCl buffer。30℃反应18h，100μL体系加入900μL(0.1N HCl：MeOH＝1：1)，12000rpm离心3min，取上清进行检测。检测ee值方法：取100μL反应体系，加100μL ACN，100μL H2O，100μL 1M NaHCO3，12000rpm离心3min，取出上清，加入200μL5mg/mL Na-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙胺酰胺，50℃ 1h，加500μL ACN离心后取上清进行液相分析。
活性相比母本提高的倍数，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍。
ee值在80-90％的*，ee值在90-98％的**，ee值大于98％的***
继续进行突变，提高底物浓度，降低反应体积。
实施例4
底物1加入33mg，1mL反应体系，氯化铵33mg，葡萄糖49.5mg，葡萄糖脱氢酶6.6mg，NAD+0.66mg，氨基酸脱氢酶6.6mg，0.1M Tris-HCl buffer。30℃反应18h，100μL体系加入900μL(0.1N HCl：MeOH＝1：1)，12000rpm离心3min，取上清进行检测。检测ee值方法：取100μL反应体系，加100μL ACN，100μL H2O，100μL 1M NaHCO3，12000rpm离心3min，取出上清，加入200μL 5mg/mL Na-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙胺酰胺，50℃ 1h，加500μL ACN离心后取上清进行液相分析。
活性相比母本提高的倍数，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍。
ee值在80-90％的*，ee值在90-98％的**，ee值大于98％的***
实施例5
底物2加入33mg，1mL反应体系，氯化铵33mg，葡萄糖49.5mg，葡萄糖脱氢酶6.6mg，NAD+0.66mg，氨基酸脱氢酶6.6mg，0.1M Tris-HCl buffer。30℃反应18h，100μL体系加入900μL(0.1N HCl：MeOH＝1：1)，12000rpm离心3min，取上清进行检测。检测ee值方法：取100μL反应体系，加100μL ACN，100μL H2O，100μL 1M NaHCO3，12000rpm离心3min，取出上清，加入200μL 5mg/mL Na-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙胺酰胺，50℃ 1h，加500μL ACN离心后取上清进行液相分析。
活性相比母本提高的倍数，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍。
ee值在80-90％的*，ee值在90-98％的**，ee值大于98％的***
实施例6
底物3加入33mg，1mL反应体系，氯化铵33mg，葡萄糖49.5mg，葡萄糖脱氢酶6.6mg，NAD+0.66mg，氨基酸脱氢酶6.6mg，0.1M Tris-HCl buffer。30℃反应18h，100μL体系加入900μL(0.1N HCl：MeOH＝1：1)，12000rpm离心3min，取上清进行检测。检测ee值方法：取100μL反应体系，加100μL ACN，100μL H2O，100μL 1M NaHCO3，12000rpm离心3min，取出上清，加入200μL 5mg/mL Na-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙胺酰胺，50℃ 1h，加500μL ACN离心后取上清进行液相分析。
活性相比母本提高的倍数，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍。
ee值在80-90％的*，ee值在90-98％的**，ee值大于98％的***
有益突变位点进一步进行组合，进一步提高底物浓度，降低反应体积。
实施例7
底物1加入50mg，1mL反应体系，氯化铵55mg，葡萄糖75mg，葡萄糖脱氢酶10mg，NAD+1mg，氨基酸脱氢酶10mg，0.1M Tris-HCl buffer。30℃反应18h，100μL体系加入900μL(0.1NHCl：MeOH＝1：1)，12000rpm离心3min，取上清进行检测。检测ee值方法：取100μL反应体系，加100μL ACN，100μL H2O，100μL 1M NaHCO3，12000rpm离心3min，取出上清，加入200μL 5mg/mL Na-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙胺酰胺，50℃ 1h，加500μL ACN离心后取上清进行液相分析。
活性相比母本提高的倍数，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍。
ee值在80-90％的*，ee值在90-98％的**，ee值大于98％的***
实施例8
底物2加入50mg，1mL反应体系，氯化铵55mg，葡萄糖75mg，葡萄糖脱氢酶10mg，NAD+1mg，氨基酸脱氢酶10mg，0.1M Tris-HCl buffer。30℃反应18h，100μL体系加入900μL(0.1NHCl：MeOH＝1：1)，12000rpm离心3min，取上清进行检测。检测ee值方法：取100μL反应体系，加100μL ACN，100μL H2O，100μL 1M NaHCO3，12000rpm离心3min，取出上清，加入200μL 5mg/mL Na-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙胺酰胺，50℃ 1h，加500μL ACN离心后取上清进行液相分析。
活性相比母本提高的倍数，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍。
ee值在80-90％的*，ee值在90-98％的**，ee值大于98％的***
实施例9
底物3加入50mg，1mL反应体系，氯化铵55mg，葡萄糖75mg，葡萄糖脱氢酶10mg，NAD+1mg，氨基酸脱氢酶10mg，0.1M Tris-HCl buffer。30℃反应18h，100μL体系加入900μL(0.1NHCl：MeOH＝1：1)，12000rpm离心3min，取上清进行检测。检测ee值方法：取100μL反应体系，加100μL ACN，100μL H2O，100μL 1M NaHCO3，12000rpm离心3min，取出上清，加入200μL 5mg/mL Na-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙胺酰胺，50℃ 1h，加500μL ACN离心后取上清进行液相分析。
活性相比母本提高的倍数，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍。
ee值在80-90％的*，ee值在90-98％的**，ee值大于98％的***
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 凯莱英生命科学技术（天津）有限公司
<120> 氨基酸脱氢酶突变体及其应用
<130> PN88409KLY
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(301)
<223> SEQ ID NO：1
<400> 1
Met Gly Glu Lys Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Ile Gly
1 5 10 15
Arg Tyr Ala Leu Asp Ala Ile Lys Ala Ala Pro Asp Met Glu Leu Ala
20 25 30
Gly Val Val Arg Arg Ser Ser Ser Leu Gly Asp Lys Pro Ala Glu Leu
35 40 45
Ala Asp Val Pro Val Val Gly Ser Ile Lys Glu Leu Thr Gly Val Lys
50 55 60
Val Ala Leu Leu Cys Thr Pro Thr Arg Ser Val Pro Glu Tyr Ala Arg
65 70 75 80
Glu Ile Leu Ala Leu Gly Ile Asn Thr Val Asp Ser Tyr Asp Ile His
85 90 95
Gly Gln Leu Ala Asp Leu Arg Leu Glu Leu Asp Lys Val Ala Lys Glu
100 105 110
His Asn Ala Val Ala Val Ile Ser Ala Gly Trp Asp Pro Gly Thr Asp
115 120 125
Ser Met Val Arg Cys Met Phe Glu Phe Met Ala Pro Lys Gly Ile Thr
130 135 140
Tyr Thr Asn Phe Gly Pro Gly Met Ser Met Gly His Ser Val Ala Val
145 150 155 160
Lys Ala Val Lys Gly Val Lys Asn Ala Leu Ser Met Thr Ile Pro Leu
165 170 175
Gly Thr Gly Val His Arg Arg Met Val Tyr Val Glu Leu Glu Pro Gly
180 185 190
Ala Asp Phe Ala Gln Val Glu Lys Ala Val Lys Thr Asp Pro Tyr Phe
195 200 205
Val Lys Asp Glu Thr His Val Ile Gln Val Glu Asp Val Asp Ala Leu
210 215 220
Ile Asp Met Gly His Gly Val Leu Met Glu Arg Lys Gly Val Ser Gly
225 230 235 240
Gly Thr His Asn Gln Leu Leu Ser Phe Ser Met Arg Ile Asn Asn Pro
245 250 255
Ala Leu Thr Ala Gln Ile Met Val Ala Ser Ala Arg Ala Ser Val Lys
260 265 270
Gln Lys Pro Gly Ala Tyr Thr Met Ile Gln Ile Pro Ile Ile Asp Tyr
275 280 285
Met Tyr Gly Asp Pro Asp Glu Ile Ile Arg Gln Leu Val
290 295 300
<210> 2
<211> 906
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(906)
<223> SEQ ID NO：2
<400> 2
atgggtgaaa aaattcgcgt tgcaatcgtt ggttacggca acattggccg ttatgccctg 60
gatgcaatca aagccgcacc ggatatggaa ctggccggcg tggtgcgccg tagtagcagt 120
ctgggcgaca agccggccga actggcagat gtgcctgttg tgggcagcat caaagagctg 180
accggtgtga aagttgcact gctgtgcacc ccgacccgca gtgttccgga atatgcccgt 240
gagattctgg ccctgggcat caacaccgtg gatagctatg acatccacgg tcagctggcc 300
gatctgcgtc tggagctgga taaagtggcc aaagaacaca acgccgtggc cgtgattagc 360
gcaggttggg accctggcac cgatagcatg gttcgctgca tgttcgagtt tatggccccg 420
aagggcatca cctataccaa tttcggtccg ggcatgagca tgggtcacag cgtggccgtt 480
aaagccgtga agggcgtgaa aaatgccctg agcatgacca ttccgctggg caccggtgtt 540
catcgtcgta tggtgtatgt ggagctggaa cctggtgccg atttcgccca ggtggaaaag 600
gccgtgaaaa ccgatccgta cttcgtgaag gatgagaccc acgtgattca ggtggaagac 660
gtggacgccc tgattgatat gggccatggc gttctgatgg aacgtaaggg cgttagcggt 720
ggcacccata accagctgct gagcttcagt atgcgtatca ataacccggc cctgaccgcc 780
cagattatgg tggccagcgc ccgtgccagc gtgaaacaga aaccgggcgc atacaccatg 840
atccagattc cgatcattga ttacatgtac ggcgacccgg atgagatcat tcgtcagctg 900
gtgtaa 906

Claims (10)

1.一种氨基酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述氨基酸脱氢酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，所述突变至少包括如下突变位点之一：第64位、第94位、第133位、第137位、第148位、第168位、第173位、第183位、第191位、第207位、第229位、第248位、第255位和第282位，且所述第64位的赖氨酸突变为天冬氨酸；第94位的天冬氨酸突变为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸；第133位的半胱氨酸突变为丙氨酸或苏氨酸；第137位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；第148位的苯丙氨酸突变为缬氨酸或丙氨酸；第168位的天冬酰胺突变为天冬氨酸；第173位的苏氨酸突变为丝氨酸、组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸；第183位的精氨酸突变为苯丙氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、丙氨酸或亮氨酸；第191位的脯氨酸突变为谷氨酸；第207位的酪氨酸突变为精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸；第229位的组氨酸突变为缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸；第248为的丝氨酸突变为谷氨酸；第255位的天冬酰胺突变为丙氨酸、谷氨酰胺或天冬氨酸；第282位的谷氨酰胺突变为谷氨酸；或者所述氨基酸脱氢酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的氨基酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变至少包括如下突变位点之一：第64位的赖氨酸突变为天冬氨酸；第94位的天冬氨酸突变为丝氨酸；第133位的半胱氨酸突变为苏氨酸；第137位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；第148位的苯丙氨酸突变为缬氨酸；第173位的苏氨酸突变为苯丙氨酸；第183位的精氨酸突变为苯丙氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、缬氨酸或亮氨酸；第191位的脯氨酸突变为谷氨酸；第229位的组氨酸突变为缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸；
优选的，所述突变至少包括如下突变位点组合之一：第183位的精氨酸突变为半胱氨酸和第229位的组氨酸突变为丝氨酸；第183位的精氨酸突变为缬氨酸和第229位的组氨酸突变为丝氨酸；第183位的精氨酸突变为亮氨酸和第229位的组氨酸突变为丙氨酸；第173位的苏氨酸突变为苯丙氨酸和第183位的精氨酸突变为半胱氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸和第229位的组氨酸突变为亮氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸和第207位的酪氨酸突变为精氨酸；第183位的精氨酸突变为丙氨酸和第229位的组氨酸突变为丝氨酸；第183位的精氨酸突变为缬氨酸和第229位的组氨酸突变为天冬酰胺；第173位的苏氨酸突变为组氨酸和第229位的组氨酸突变为丝氨酸；
优选的，所述突变至少包括如下突变位点组合之一：第183位的精氨酸突变为半胱氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第148位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第207位的酪氨酸突变为精氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第148位的苯丙氨酸突变为缬氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第173位的苏氨酸突变为苯丙氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第173位的苏氨酸突变为色氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第207位的酪氨酸突变为谷氨酸；第183位的精氨酸突变为半胱氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第207位的酪氨酸突变为精氨酸；第183位的精氨酸突变为丙氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第173位的苏氨酸突变为组氨酸；第183位的精氨酸突变为缬氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第173位的苏氨酸突变为组氨酸；第183位的精氨酸突变为缬氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第148位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；第173位的苏氨酸突变为组氨酸、第229位的组氨酸突变为丝氨酸和第148位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；
或者所述氨基酸脱氢酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有95％以上同源性的氨基酸序列。
3.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1或2所述的氨基酸脱氢酶突变体。
4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求3所述的DNA分子。
5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pET-22b(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4或5所述的重组质粒。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母或真核细胞；优选所述原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞。
8.一种生产D-氨基酸的方法，包括采用氨基酸脱氢酶对酮类化合物进行催化还原氨化反应的步骤，其特征在于，所述氨基酸脱氢酶为权利要求1或2所述的氨基酸脱氢酶突变体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述酮类化合物为还原氨化反应产物为
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述还原氨化反应中的氨基供体为氯化铵。
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