CN109010830B

CN109010830B - 血小板相关抑制剂在制备治疗血小板减少症药物中的应用

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Publication number: CN109010830B
Application number: CN201710429561.7A
Authority: CN
Inventors: 戴克胜
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2017-06-08
Filing date: 2017-06-08
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2037-06-08
Also published as: CN109010830A

Abstract

本发明公开了血小板相关抑制剂在制备治疗血小板减少症药物中的应用，包括血小板活化、凋亡抑制剂和血小板吞噬抑制剂。血小板相关抑制剂包括抗GPIb‑IX和GPIIb/IIIa抗体结合抑制剂、GPIbα集簇抑制剂、胞内钙离子螯合剂、Caspase抑制剂、磷脂酰丝氨酸受体‑配体结合抑制剂。本发明解决了现有治疗方案对一些血小板减少症病人没有治疗效果的问题；从而能够为临床上这类难治性血小板减少症提供新的治疗靶点，并提供分子理论基础与临床治疗指导。

Description

血小板相关抑制剂在制备治疗血小板减少症药物中的应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及血小板活化抑制剂、血小板凋亡抑制剂或者血小板吞噬抑制剂在制备治疗血小板减少症药物中的应用，公开的血小板减少症治疗药物可有效抑制血小板数量减少。

背景技术

免疫性血小板减少症（Immune thrombocytopenia, ITP）是以血小板数量减少为主要特征的自身免疫性疾病，表现为轻重不等的出血症状。当血小板数量低于10×10⁹/L时，患者颅内出血的风险将大大增加，危及生命。ITP的一线治疗方法，包括糖皮质激素、静脉注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin G, IVIG）等免疫抑制治疗。

ITP的发病机制具有多样性，至今仍未完全阐明，约80%的ITP患者血清中存在抗血小板自身抗体，主要分为抗GPIIbIIIa和抗GPIb-IX抗体；现有技术认为，抗GPIIb/IIIa抗体的F(ab’)₂片段不能诱导小鼠血小板减少，覆盖有自身抗体的血小板通过抗体的Fc部分，主要在脾脏被表达Fc受体的巨噬细胞清除；ITP一线治疗药物IVIG就是通过封闭Fc受体及Fc受体依赖途径阻止血小板被破坏。然而约15-25%的患者，对IVIG甚至脾切除治疗无效，约有61%的患者在脾切除后仍然无法将血小板数维持在30×10⁹/L以上，最终进展为难治性ITP。

脂筏（lipid raft），也称GEM（glycolipid-enriched membranes），是质膜上富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域。由于脂筏能够募集并排除特定的蛋白，因此被认为是细胞发生信号转导的平台。受体簇（cluster）的形成是脂筏介导信号转导的特征之一。蛋白在未与配体结合时，对脂筏的亲和力低，结合配体后转移到脂筏中，蛋白在脂筏中进一步集簇（clustering），将脂筏连接合并成更大的结构域，帮助信号转导。

发明内容

本发明公开了一种免疫性血小板减少症治疗药物，首次公开了基于抗GPIbα抗体的ITP病人体内血小板减少的新的机制，公开的药物能够解决血小板发生集簇而在肝脏被清除，以及血小板发生活化和凋亡，并暴露PS，能够被巨噬细胞上的PSR识别，从而被巨噬细胞吞噬，导致血小板清除的问题；从而能够为临床上这类难治性ITP提供新的治疗靶点提供分子理论基础与实际指导。

本发明采用如下技术方案：血小板相关抑制剂在制备治疗血小板减少症药物中的应用；所述血小板相关抑制剂包括血小板活化抑制剂、血小板凋亡抑制剂、血小板吞噬抑制剂。所述血小板减少症包括免疫性或非免疫性血小板减少症，比如免疫性血小板减少性紫癜。

上述技术方案中，所述血小板相关抑制剂包括抗GPIb-IX和GPIIb/IIIa抗体结合抑制剂、GPIbα集簇抑制剂、胞内钙离子螯合剂、Caspase抑制剂、磷脂酰丝氨酸受体-配体结合抑制剂。

上述技术方案中，所述抗GPIb-IX和GPIIb/IIIa抗体结合抑制剂为抑制抗GPIb-IX和GPIIb/IIIa抗体与血小板结合的试剂；所述GPIbα集簇抑制剂包括抑制或者破坏GPIbα脂伐运动的试剂；所述磷脂酰丝氨酸受体-配体结合抑制剂包括抑制磷脂酰丝氨酸外翻或者封闭的试剂。

本发明还公开了一种血小板减少症治疗药物，包括血小板活化抑制剂、血小板凋亡抑制剂或者血小板吞噬抑制剂，比如抗GPIb-IX和GPIIb/IIIa抗体结合抑制剂、GPIbα集簇抑制剂、胞内钙离子螯合剂、Caspase抑制剂、磷脂酰丝氨酸受体-配体结合抑制剂。

本发明还公开了一种血小板减少症治疗药物的制备方法，所述血小板减少症治疗药物由血小板活化抑制剂、血小板凋亡抑制剂或者血小板吞噬抑制剂与药物辅料制备得到。

本发明还公开了一种血小板减少症治疗药品，所述血小板减少症治疗药品的活性成份包括血小板活化抑制剂、血小板凋亡抑制剂或者血小板吞噬抑制剂；还包括药物辅料、包装瓶。

本发明公开的血小板减少症治疗药物的活性成分为以上抑制剂，还包括常规药物辅料，比如缓冲液、生理盐水等，组成最终的免疫性血小板减少症治疗药物体系，再装入包装瓶中，用于患者，可解决血小板减少的问题。

本发明所述抗GPIb-IX和GPIIb/IIIa抗体结合抑制剂为抑制抗GPIb-IX和GPIIb/IIIa抗体与血小板结合的试剂，包括多肽、小分子化合物、单链抗体、抗体Fab片段，比如能够和抗GPIbα抗体结合的肽段，根据GPIbα蛋白分子合成的肽段，能够和GPIbα结合的肽段，根据抗GPIbα抗体合成能够结合在GPIbα，阻断抗GPIbα抗体结合在GPIbα，包括抗体的单体Fab；根据抗体可变区设计的肽。

本发明所述磷脂酰丝氨酸受体-配体结合抑制剂包括能够阻止磷脂酰丝氨酸与其配体结合的有机物、无机物或生物制剂；所述磷脂酰丝氨酸受体-配体结合抑制剂包括抑制PS外翻，即抑制导致PS外翻的酶，比如TMEM16家族，Xkr家族，还包括封闭PS，如磷脂结合剂，即可以与磷脂结合的物质，比如磷脂结合蛋白，包括膜联蛋白，AnnexinV蛋白。

本发明所述GPIbα集簇抑制剂包括抑制或者破坏GPIbα在脂伐上聚集的糖类化合物、抗体或者生物制剂；所述GPIbα集簇抑制剂可以抑制GPIbα向脂伐运动，包括聚糖，比如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、果糖、木糖、岩藻糖、唾液酸、葡糖醛酸、艾杜糖醛酸；还可以破坏脂伐运动，比如甲基-β-环糊精（methyl-b-cyclodextrin,MCD）；还比如GlcNAc、GM3。

本发明所述胞内钙离子螯合剂包括能够清除胞浆内钙离子的有机物或无机物，可以为有机化合物比如GETA、BATPA、Fluo-3或者其衍生物比如BATBA-AM、BAPTA-AM；所述Caspase抑制剂包括能够抑制Caspase活性的有机物、无机物或生物制剂，为氨基酸类化合物，可选自：苄氧基羰基-缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-氟甲基酮、异亮氨酸-谷氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-氟甲基酮、t-丁氧基羰基-天冬氨酸(OCH₃)-CH₂F、叔丁氧羰基-天冬氨酰(OMe)-氟甲基酮(BAF)和叔丁氧羰基-天冬氨酸-fmk(BD)、BD-fmk、Z-FA-fmk、z-VAD、z-缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-氟甲基酮(z-VAD-fmk)、IAP、苄氧基羰基-缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸 (OCH₃)-CH₂-氟甲基酮、苄氧基羰基-异亮氨酸-谷氨酸(OCH₃)-苏氨酸-天冬氨酸(OCH₃)-CH₂-氟甲基酮、Z-AAD-fmk、DEVD、Ac-DEVD-CHO、Z-天冬氨酸-CH₂–DCB、乙酰基-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-氟甲基酮 (Ac-DEVD-FMK)、YVAD、乙酰基-酪氨酸-缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-氯甲基酮(Ac-YVAD-CMK)、z-DEVD-fmk、苄氧基羰基-天冬氨酸(OCH₃)-谷氨酸(OCH₃)-缬氨酸-天冬氨酸(OCH₃)-CH₂-氟甲基酮、z-IETD-fmk、Z-VDVAD-fmk、CrmA、Bcl-2、Diap1、cIAP1、cIAP2、XIAP、Q-VD-Oph、p35。

本发明首次公开了ITP病人体内血小板减少的新的机制，公开的药物能够解决血小板发生集簇、暴露PS而在肝脏被清除的问题；解决了现有治疗方案对一些ITP病人没有效果的问题；从而能够为临床上这类难治性ITP提供新的治疗靶点提供分子理论基础与实际指导。

附图说明

图1为实施例一ITP病人血浆与正常人血小板共孵育后检测结果图；

图2为实施例一人洗涤血小板与抗体共孵育后在不同时间检测活化和凋亡指标结果图；

图3为实施例一小鼠PRP与抗体共孵育后在不同时间检测活化和凋亡指标结果图；

图4为实施例二血小板与抑制剂孵育后结果图；

图5为实施例三血小板与抗体孵育后组织聚集以及吞噬结果图；

图6为磷酯酰丝氨酸受体抑制剂对血小板清除的影响图；

图7为GPIbα 集簇抑制剂对血小板清除的影响图；

图8为血小板活化抑制剂、血小板凋亡抑制剂对血小板清除的影响图。

具体实施方式

实施例一

将ITP病人血浆按照含有的不同抗体进行分类后与正常人血小板共孵育后检测，图1为结果。结果显示，与对照相比，抗GPIbα抗体阳性ITP病人血浆能够导致正常人血小板线粒体膜电位下降（图1A），血小板膜表面P选择素表达增加（图1E），同时血小板膜磷酯酰丝氨酸外翻增加（图1B），并且在相应的活化和凋亡指标中，含抗GPIIbIIIa抗体的ITP病人血浆并不能导致血小板线粒体膜电位下降（图1A），P选择素表达增加（图1E），PS外翻（图1B）；图1C、图1D也可看出区别。

人洗涤血小板分别与10ug/ml的抗体IgG、抗GPIbα抗体AN51、抗GPIbα抗体HIP1、抗GPIIbIIIa抗体SZ21、抗GPIIbIIIa抗体D57在37℃共孵育，并在不同时间检测活化和凋亡指标，见图2，结果显示只有AN51能够导致人血小板线粒体膜电位去极化增加（图2A）、PS暴露增加（图2B）、P选择素表达增加（图2C）、PAC-1结合增加（图2D）；小鼠PRP分别与5ug/ml抗体IgG和抗小鼠GPIbα抗体R300在37℃共孵育，并在不同时间检测血小板活化和凋亡指标，见图3，结果显示R300能够诱导小鼠血小板线粒体膜电位去极化增加（图3A）、PS暴露增加（图3B）、P选择素表达增加（图3C）、JON/A结合增加（图3D）。

以上结果证明，和ITP病人血浆诱导的情况一致，不是所有的抗血小板抗体都能导致血小板发生活化和凋亡，其中抗GPIbα抗体能导致血小板发生活化和凋亡。

实施例二

人洗涤血小板分别提前孵育GPIbα 集簇抑制剂GlcNAc（100mM）和GM3（100uM）室温下15分钟、活化抑制剂BAPTA（10uM）37℃ 15分钟、凋亡抑制剂Q-VD-Oph（100uM）37℃ 30分钟后，所有组均加入AN51 10ug/ml，并在37℃孵育8小时后检测PS外翻，同样小鼠PRP分别提前孵育GPIbα 集簇抑制剂GlcNAc（100mM）和GM3（100uM）室温下15分钟、活化抑制剂BAPTA（20uM）37℃ 15分钟、凋亡抑制剂Q-VD-Oph（100uM）37℃ 30分钟后，加入R300 5ug/ml，并在37℃孵育6小时后，检测PS外翻、线粒体膜电位、P选择素表达，见图4，结果显示GlcNAc、GM3、BAPTA、Q-VD-Oph都能抑制AN51诱导的血小板活化和凋亡的共同通路PS外翻（图4A）；小鼠结果和人结果一样，GlcNAc、GM3、BAPTA、Q-VD-Oph都能抑制R300诱导的血小板活化和凋亡的共同通路PS外翻（图4B）；同时检测线粒体膜电位、P选择素表达，发现GPIbα 集簇抑制剂GlcNAc、GM3不仅能够抑制R300导致的线粒体膜电位去极化（图4C），同时降低了R300导致的P选择素表达（图4D）。GPIbα在静息血小板膜上是均匀分布的，当血小板受到特定刺激，GPIbα向脂筏结构转移，并在脂筏中彼此靠近，发生集簇，形成GPIbα簇；GPIbα集簇抑制剂N-乙酰-葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine, GlcNAc）可抑制血小板凋亡的发生，用甲基-β-环糊精（methyl-b-cyclodextrin, MCD）破坏脂筏或用GlcNAc抑制GPIbα集簇，可明显抑制血小板聚集。血小板处于静息状态（resting）时，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）分布在血小板质膜内侧。当血小板受到凋亡和活化刺激后，PS会通过不同的途径被磷脂翻转酶（phospholipid scramblase）翻转到质膜外侧，引起PS暴露，暴露PS的细胞可被吞噬细胞上的PSR（PS receptor）识别并吞噬；采用甘露糖、BATBA-AM、乙酰基-酪氨酸-缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-氯甲基酮等也可达到以上近似效果。以上结果可以说明GPIbα集簇抑制剂、血小板活化抑制剂或者血小板凋亡抑制剂都避免了PS外翻，从而避免PS暴露，解决了血小板可被吞噬细胞上的PSR识别并吞噬的问题。

实施例三

分别将带荧光的二抗与对照抗体、R300、R300F(ab)₂混合后通过腹腔注射小鼠体内，4小时后取出各组织器官用小动物活体成像观察；分别腹腔注射对照抗体、R300、F(ab)₂4小时后取肝脏制冰冻切片后，用F4/80（绿色）标记巨噬细胞、GPIbα（红色）标记血小板、DAPI（蓝色）染核，结果如图5所示。

图5A可以看出R300和R300 F(ab)₂结合的血小板均主要聚积在肝脏；图5B结果显示，血小板主要与巨噬细胞共定位；图5C显示用氯膦酸二钠脂质体清除巨噬细胞，能够解救R300腹腔注射导致的血小板减少；图5D显示清除巨噬细胞后，能明显减少R300 F(ab)2孵育的血小板回输后清除。

实施例四

钙黄绿色标记小鼠血小板

（1）20-25g C57小鼠由2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，下腔静脉取血，经1/7小鼠ACD抗凝后混匀；

（2）小鼠全血生理盐水稀释一倍后，每管5ml稀释后全血，200g，11分钟，去上层乳白色液体，为小鼠富血小板血浆；

（3）小鼠PRP经1200g，2分钟离心后，去上清，CGS buffer重悬；

（4）室温600g，2分钟，去上清，CGS buffer 重悬；

（5）室温600g，2分钟，去上清，MTB buffer 重悬；

（6）上述洗涤血小板调至1×10⁹/ml，与钙黄绿色-AM（calcein-AM）5ug/ml室温下孵育15分钟；

（7）加入等体积含20ug/ml PGI₂ CGS buffer 稀释；

（8）室温600g，2分钟离心，去上清，CGS（含10ug/ml PGI₂）buffer重悬；

（9）室温600g，2分钟离心，去上清，MTB重悬；

（10）小鼠洗涤血小板调整至1×10⁹/ml，加入1 mM CaCl₂，1mM MgCl₂后静息两小时备用。

血小板回输模型

上述calcein标记的小鼠血小板分别与对照抗体Rat IgG（2ug/ml）或是R300（2ug/ml）室温下孵育1小时，在抑制实验中，提前5分钟向受体小鼠注射对照溶剂或是AnnexinV（10ug/ml）、GlcNAc（100mM）、GM3（100uM），或是血小板提前在37℃孵育BAPTA-AM（10uM）、Q-VD-Oph（100uM）30分钟；向受体小鼠通过眼眶静脉注射上述R300孵育的血小板1×10⁸个。在回输后0分钟，15分钟，30分钟通过眼眶静脉采血，经3.8%柠檬酸钠抗凝后，全血用PE-小鼠CD41在室温下标记15分钟，1ml PBS稀释后流式检测。所有的血小板（受体小鼠自己的血小板和回输血小板）均能够被PE-小鼠CD41标记，而回输的血小板还被calcein标记，因此用FL1和FL2双阳性血小板/FL2单阳血小板比例绘制回输血小板清除曲线。

图6为磷酯酰丝氨酸受体抑制剂对血小板清除的影响；结果显示提前注射AnnexinV蛋白封闭磷酯酰丝氨酸，能够部分解救R300直接腹腔注射导致的血小板清除（图6A），也能够明显解救R300孵育的回输血小板的清除（图6B）；上述结果已经证明磷酯酰丝氨酸受体抑制剂能够抑制R300诱导血小板的清除；

分别提前注射对照及GPIbα 集簇抑制剂GlcNAc（100mM）和GM3（100uM）5分钟后，回输R300（2ug/ml）在室温处理1小时的血小板（calcein标记），图7为GPIbα 集簇抑制剂对血小板清除的影响；结果显示GlcNAc（7A）和GM3（7B）均能明显减少R300孵育的血小板清除；

提前孵育活化抑制剂BAPTA（10uM）和凋亡抑制剂Q-VD-Oph（100uM）5分钟后，回输R300（2ug/ml）在室温处理1小时的血小板（calcein标记），图8为血小板活化抑制剂（8A）、血小板凋亡抑制剂（8B）对血小板清除的影响；结果显示都能够明显抑制R300诱导的血小板清除。

采用TMEM16抑制剂、葡糖醛酸、GETA、苄氧基羰基-缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-氟甲基酮等也可达到以上近似效果。

现有研究公认抗抗体导致的血小板清除是Fc依赖的，但是也有研究表明IVIG能够缓解抗GPIIb/IIIa抗体导致的血小板减少，对其他抗体引起的血小板减少没有作用，可惜的是具体机制尚未明确。本发明公开了GPIbα集簇抑制剂、血小板活化抑制剂或者血小板凋亡抑制剂、磷酯酰丝氨酸受体抑制剂可以有效的解决自身抗体导致的血小板清除问题，可以用于血小板免疫性减少症的治疗。

Claims

1.血小板相关抑制剂在制备治疗血小板减少症药物中的应用；所述血小板相关抑制剂为BAPTA；所述血小板减少症为抗GPIbα自身抗体的免疫性血小板减少症。