CN108998473B - G四聚体共价偶联dna分子和dna自转染试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种G四聚体共价偶联DNA分子，中间的双链是待转染DNA片段双链，每条链的5’端各由9个胸腺嘧啶（T）链连接的G‑四聚体。本发明还提供了一种DNA自转染试剂盒，包括聚凝胺、5×Annealing buffer和所述的G四聚体共价偶联DNA分子。本发明用于肿瘤细胞的靶向DNA转染，将待定用途的基因或者DNA片段选择性转染进肿瘤细胞。所述转染操作简便、高效低毒、不依赖与细胞周期、操作简单、成本低。

Description

G四聚体共价偶联DNA分子和DNA自转染试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及一种DNA转染技术，尤其是G四聚体共价偶联DNA分子和DNA自转染试剂盒及应用。

背景技术

转染指的是将外源的核酸导入细胞的过程，目前的转染方法主要有三类，分别是物理、化学和生物途径，物理途径主要指电转法，显微注射法，均需要设备才能实现转染，而且电转法细胞存活率低，显微注射法操作复杂，设备昂贵。化学途径主要包括阳离子脂质体，阳离子聚合物和磷酸钙等类型的转染试剂，均需要依赖细胞的内吞作用，阳离子脂质体法虽然应用范围广，但是有一定的细胞毒性，而且对DNA的浓度有要求，DNA浓度过高会影响转染效率，磷酸钙法重复性差，且对DNA的浓度要求高，而且包括阳离子聚合物在内的试剂均依赖于细胞的有丝分裂。生物途径主要包括逆转录病毒法，虽然这种方法转染效率高，但是其有免疫原性，而且只感染分裂的细胞。因此，需要有一种高效低毒、不依赖与细胞周期、操作简单、低成本的转染方法。

核仁素在所有真核细胞均会表达，是细胞核仁中最主要的一种蛋白，主要参与核糖体的成熟装配与转运，可以调控细胞增殖和细胞凋亡，在细胞内也可以作为一种穿梭蛋白，在细胞核和细胞浆之间穿梭，甚至可以表达在某些细胞表面，如肿瘤细胞，免疫细胞，作为某些分子，细菌或者病毒的受体。核仁素还可以特异性的结合鸟嘌呤四聚体（G-四聚体，G-quadruplex,以下简称Gq）。 Gq是由富含鸟嘌呤的DNA 链缠绕折叠形成的，四个鸟嘌呤之间通过 Hoogsteen氢键形成四聚体结构。

发明内容

为了克服现有技术中的一些缺点，本发明提供一种G四聚体共价偶联DNA分子和DNA自转染试剂盒及应用，可以提供一种高效低毒、不依赖于细胞周期、操作简单、低成本的转染方法。

我们利用Gq可以特异性结合核仁素，以及核仁素的穿梭特性，发明了本试剂盒。我们首次发明利用Gq来进行DNA的自转染，并首次开发出线性单链分步PCR法。待转染DNA片段经线性单链分步PCR法扩增后，形成不完全双链DNA—即两端带有富含G的单链，中间是完整的待转染DNA片段双链；之后经退火,富含G的单链与游离富含G的单链形成Gq；最终得到两端是Gq中间是DNA双链的嵌合体。这种嵌合体，因两端的Gq与核仁素的亲和能力促进待转染DNA片段进入细胞并进入细胞核。

本发明提供的技术方案是：一种G四聚体共价偶联DNA分子，中间的双链是待转染DNA片段双链，每条链的5’端各由9个胸腺嘧啶（T）链连接的G-四聚体。

所述G四聚体共价偶联DNA分子的合成方法，首先将要转染的基因构建到真核细胞过表达载体上，然后设计引物1进行常规PCR，得到启动子+待转染基因的DNA线性片段；以片段为模板，用带有前体Gq序列的引物2 5-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGttttttttttNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3的上游引物及下游引物各自单独进行线性单链分步PCR，简称线性PCR,分别得到两端含有前体Gq序列(5-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3)的两条单链，其中N为与模板配对碱基序列，作为PCR的引物，称为PCR靶序列；然后测量两种产物的浓度，并按照1:1的比例混合，然后加入5×Annealing buffer，混匀，95℃ 5min，缓慢降温至常温，退火得到G四聚体共价偶联DNA分子，称为Gq-DNA。

以此方法合成Gq-DNA为技术基础，发明一种DNA自转染试剂盒，包括聚凝胺、5×Annealing buffer和上述DNA分子。

本发明还提供了上述DNA自转染试剂盒在转染肝癌细胞中的用途，将G四聚体共价偶联DNA分子和聚凝胺加入细胞，在使用过程中，通过聚凝胺中和掉DNA和细胞膜上的负电荷之后，Gq-DNA与细胞膜表面的核仁素结合，在核仁素的穿梭运动下被带入细胞核。

本发明设计的自转染DNA结构如附图1（1）所示，是一段特殊的嵌合体DNA分子，中间的双链是转染DNA片段双链，每条链的5’端各由9个胸腺嘧啶（T）链连接的Gq。

Gq-DNA的核酸序列：

链1：

GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttTTTTGCTCACATGTTCTTTC

链2：GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttNNN……NNN

链3：

GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttATTTACGCGTTAAGATA

链4：GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttNNN……NNN

链1或链2的9个胸腺嘧啶（T）前的富鸟嘌呤（G）序列与链3或链4的富鸟嘌呤(G)序列相互结合形成G四聚体。链3和链4的NNN……NNN（待转染DNA）部分互补配对形成双链。（四条链DNA链的排列方式如附图一（1）所示）

本发明利用的Gq如附图1（2）所示，是由2条相同的富含鸟嘌呤G的单链DNA反向自发形成的Gq。

Gq的核酸序列：

链1：GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG

链2：GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG

链1和链2折叠形成G四聚体。（两条条链DNA链的排列方式如附图1（2）所示）

自转染嵌合体DNA前体结构，如附图1（3）所示，DNA双链的每一条链的5’端带有富含G单链序列（Gq前体）。 嵌合体DNA前体与游离的富含G寡核苷酸单链退火，就可以产生我们想要的产物自转染DNA嵌合体。

Gq前体的核酸序列：（两条条链DNA链的排列方式如附图1（3）所示）

链1：GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttNNN……NNN

链2：GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttNNN……NNN

链1和链2的NNN…NNN部分互补配对形成双链，两端则是由9个胸腺嘧啶（T）连接的Gq前体，序列为GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG

线性单链分步PCR法,简称线性PCR法。常规的PCR会产生完全互补配对的双链DNA,包括富含G的单链序列，会形成与其完全互补的富含胞嘧啶C的序列，当前G-四聚体序列与其反义链互补配对时，很难形成Gq结构，因此前Gq序列必须保持单链形态。线性单链分步PCR法制备自转染嵌合体DNA前体的过程如附图1（4）所示。

本发明所利用的引物2序列如下：

5- GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttTTTTGCTCACATGTTCTTTC-3，结构如附图1（5）所示，包括三个部分，前Gq序列，中间用于连接的9个胸腺嘧啶T以及与模板配对的碱基序列，作为PCR的引物，称为PCR靶序列。

为了得到Gq-DNA的单链，我们使用了线性PCR技术，这种技术指的是，在PCR过程中，只加入一条引物，这样每增加一次循坏，对于每一条模板来说，只会多出一条单链，这种PCR的产物量是呈倍数增加，而不是像常规的PCR技术一样，产物的量呈指数增加。具体过程如图1（4）所示，首先将想要转染的基因构建到载体pcmv-tag2a上，然后设计引物1进行常规PCR，将所需基因线性化，并以线性化的基因为模板，用带有前Gq序列的引物（引物2）（引物2的结构如图1（5）所示）进行线性PCR，然后测量两种产物的浓度，并按照1:1的比例混合，若是不按比例，则会引起某一种单链过量，影响产物产量，最终影响转染效率。然后加入5×Annealing buffer，混匀，95℃5min，缓慢降温至常温。

在实验中我们发现，在上述退火过程中，引物2的量对产物的影响比较大，需要保证引物的过量，否则单链与单链之间容易通过前Gq序列的部分互相结合形成多聚物，最终影响转染效率。此时体系中应该含有Gq-DNA以及游离的Gq，其中，前者是我们想要的转染底物，由于游离的Gq也会占据核仁素的结合位点，会降低转染效率，所以我们应该去除游离的Gq。我们首先尝试了使用切胶回收的方法分离出产物，但是回收效率特别低，所以我们又尝试使用PCR纯化试剂盒，利用过柱的方法去除较短的由引物退火而成的游离的G-四聚体，从而得到较纯的Gq-DNA。合成过程中我们主要运用Gq携带了绿色荧光蛋白基因EGFP和荧光素酶基因LUC，其对照组指的是没有Gq结构的线性DNA片段，分别简写为CMV-EGFP, Gq-CMV-EGFP和CMV-LUC,Gq-CMV-LUC。

为了证明退火后转染底物形成了Gq，我们将Gq-DNA和线性对照DNA跑了琼脂糖胶，结果显示无论是CMV-EGFP还是CMV-LUC，Gq-DNA的分子量比线性DNA大得多，而从DNA的碱基数来看，并没有如图2(1)所示如此大的差别，Gq独特的3D结构使得Gq-DNA的电泳速率减慢，正好说明了Gq-DNA合成技术是可行的。然后我们对其稳定性进行了检测，将Gq-DNA和线性DNA与含5%胎牛血清的DMEM混合然后在37℃孵育，并于不同时间点收样跑胶，结果如图2(2)所示，Gq-DNA能够抵抗核酸酶的降解，其稳定性远高于线性DNA。

接下来我们尝试将Gq-DNA直接加入细胞，看是否能通过核仁素与G-四聚体的结合将DNA带入细胞，结果尝试失败，分析原因我们推测是由于细胞表面带负电而DNA也带负电，静电排斥作用使得Gq-DNA无法接近细胞膜表面的核仁素蛋白。因此我们尝试使用聚凝胺,一种阳离子聚合物，溶解之后会产生大量的正电荷，可以中和DNA和细胞表面的负电荷，常用于哺乳动物细胞的DNA转染实验以增强脂质体的转染效率，结果发现，加入聚凝胺之后，如图3所示，Gq-DNA果然可以进入细胞并表达，更重要的是，Gq-DNA组的荧光素酶的表达量显著高于DNA组，在附图3及后面的所有图中，ns表示没有统计学差异，*、**、***分别代表P值小于0.05、0.01、0.001。

接下来我们对这种方法的毒性进行了检测，如图4（1）所示，DNA和Gq-DNA对细胞的活性都没有影响，也就是没有毒性，于是我们对聚凝胺的浓度进行了摸索，如图4（2）所示，5μg/mL的浓度对细胞的活性没有影响。在此浓度下，我们对细胞膜的完整性也做了检测，收集上清检测乳酸脱氢酶LDH来检测细胞膜的完整性，如图4（3）所示，5μg/mL的浓度也不会破坏细胞膜的完整性，于是我们最终确定了5μg/mL为使用浓度。经历以上过程，我们才最终确立了转染方法以及各种细节。

由于之前图三的结果显示Gq-DNA组的荧光素酶的表达量显著高于线性DNA组，因此，我们将此种自转染的方法与商品化的lipo2000进行了转染效率的对比，如图5（1）所示，DNA自转染的方法转染效率显著高于lipo2000。我们又对DNA自转染法的其他特性进行了探索，结果发现如图5（2）（3）所示，在低血清抑制细胞增殖的情况下，DNA自转染法的转染效率与市面上的转染试剂PEI和lipo2000相比仍然是比较好的。不仅如此，我们还发现，DNA自转染法在核仁素高表达的细胞中的应用更加高效，如图5（4）（5）所示，正常肝细胞系L02的核仁素表达量显著低于肝癌细胞系HepG2，相对应的，在L02中，DNA自转染法相对于对照转染效率的提高倍数显著小于HepG2。

总之，如图6（1）所示，在肿瘤细胞中，聚凝胺中和掉DNA和细胞膜上的负电荷之后，Gq-DNA与细胞膜表面的核仁素结合，在核仁素的穿梭运动下被带入细胞核，然后表达出我们需要的基因，而在正常细胞中，由于细胞膜上不表达核仁素，所以，Gq-DNA不能进入细胞。而没有聚凝胺中和电荷的情况下，如图6（2）所示，由于DNA和细胞膜都带负电荷，产生排斥作用，使得Gq-DNA无法靠近细胞，无法与核仁素结合，所以无法进入细胞。

本发明的特点和优势：

1．本发明首次利用G-四聚体DNA与核仁素的亲和力引导DNA进入细胞并入核。

2．本发明开创性地采用DNA单链扩增技术后退火，扩增并获得大量部分双链DNA分子，单链部分退火后自动形成G-四聚体结构，使得Gq与DNA双链以天然DNA链地连接方式偶联在一起。技术手段具有开创性，获得的这种特殊的DNA分子是全新的分子构造。

3.本发明转染技术操作简便，中和细胞表面负电荷后直接将制作好的DNA加入细胞生长体系，即可实现高效转染效果。且具有不依赖于细胞周期、带血清转染等优点。

4.本发明是通过对DNA分子本身进行的精巧设计和改造，使其具有自动进入细胞和入细胞核的能力，不依赖于价格高昂的转染试剂即可实现DNA转染。

5.本发明的转染技术是靶向核仁素，而肿瘤细胞核仁素表达量最高，因此本发明针对肿瘤细胞的靶向DNA转染，将待定用途的基因或者DNA片段选择性转染进肿瘤细胞。

6.本发明涉及的DNA特殊的分子结构，与普通DNA分子相比有良好的血清稳定性，而血清稳定性是DNA体内递送的关键技术障碍，因此本发明具有潜在临床应用价值。

7.本发明经过了大量的实验测试，优化了试剂用量和浓度，几乎没有毒附作用，具有良好的生物安全性。

附图说明

图1为本发明中转染底物的结构、Gq的结构、中间产物的结构、制作流程图以及所需引物的结构简图。

图2为本发明中转染底物Gq-CMV-LUC和Gq-CMV-GFP相对于对照DNA所显示的分子量大小和体外稳定性。

图3为本发明转染底物Gq-CMV-LUC最终的转染效率图

图4为本发明的毒性相关实验。

图5为本发明转染高效、不依赖细胞周期以及靶向核仁素高表达细胞的实验。

图6为本发明的原理图。

图7为本发明转染底物Gq-CMV-GFP最终的转染效率图。

图8为YOYO-1标记随机的DNA检测自转染试剂盒的高效性与普适性。

具体实施方式

本DNA转染试剂盒包括以下试剂：

试剂1 聚凝胺

试剂2 引物1-F

试剂3 引物1-R

试剂4 引物2-F

试剂5 引物2-R

试剂6 待转染基因DNA片段

试剂7 5×Annealing buffer (Tris-HCl 28mM, KCl 200mM, MgCl2 4nM,调节PH值至7.0)

本发明使用的具体步骤如下:

1.模板的构建

将需要转染的基因构建到含有启动子的载体中，使待转染的基因在启动子序列下游。

2.转染底物的制作

普通PCR扩增得到“启动子-待转染基因”线性片段；通过单链PCR扩增得到5’端含有Gq前体序列的两条DNA单链；退火得到Gq-DNA。

3.递送待转染基因进入靶细胞

准备待转染细胞，将转染底物和聚凝胺加入细胞培养体系，6h后换液，24h或48h之后检测转染效果以及基因表达效果。

实施例 1：Gq介导荧光素酶（luciferase）基因自传染

以luciferase基因为例，阐述本DNA自转染试剂盒。

步骤1

将luciferase基因构建到pCMV-tag2A载体上。

步骤2

先设计一对引物（引物1）（引物1上游：5-TTTTGCTCACATGTTCTTTC-3下游：5-ATTTACGCGTTAAGATA-3）将CMV-LUC-polyA扩增出来，进行沉淀回收，作为下一步PCR的模板以及实验对照。

再设计一对引物（引物2）（引物2的上游引物5-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttTTTTGCTCACATGTTCTTTC-3下游引物5-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttATTTACGCGTTAAGATA-3），其5’端带有核仁素亲和适配体AS1411的序列5’-(GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG)-3’，引物2的结构如图1(5)所示，上下游引物分别命名为引物2-F、引物2-R。然后以步骤2中的产物为模板，以引物2-F或者引物2-R为上游引物或者下游引物各自单独进行单链扩增PCR，分别得到两端含有前体Gq序列的两条单链，然后等比例混合两条单链PCR产物，加入5×annealing buffer（28mM Tris-HCl,200mM KCl,4nMMgCl2,调PH至7.0），混匀，95℃5min，缓慢（从95度开始，5度一个阶梯往下降，每个温度5分钟，一直缓慢降温至16度。）降温至常温，然后用DNA纯化试剂盒去除多余的引物，就是纯的转染底物了，我们命名为Gq-CMV-LUC（即Gq-DNA, CMV-LUC为待转染DNA片段的名称，其中CMV是真核细胞高活性启动子DNA序列，LUC是荧光素酶基因DNA序列），过程和产物结构如图1(4)所示。

最后证明我们的转染底物中确实形成了Gq，将Gq-CMV-LUC和线性对照CMV-LUC跑了琼脂糖胶，如图2（2）所示，显示Gq-CMV-LUC的分子量比线性CMV-LUC大得多，而两者的碱基数差别并没有图上显示的那么大，就可以说明我们的Gq-CMV-LUC合成是成功的，此时的产物就是可以用于转染。

步骤3

提前将肝癌细胞HepG2铺进24孔板。

步骤4

将转染底物Gq-LUC和聚凝胺加入细胞，DNA的量为0.5μg每个孔，聚凝胺的浓度为5μg/mL，6h后换液。

步骤5

24小时之后收样检测luciferase活性，同时检测蛋白浓度，用于标准化luciferase活性测量值。结果如图3所示在聚凝胺中和电荷之后，Gq-CMV-LUC确实能够进入细胞并且表达，且Gq-LUC组的荧光素酶的表达量显著高于线性DNA组。

本发明具有毒性低，效率高，不依赖于细胞周期，靶向核仁素高表达细胞等优点，下面是证明上述优点的实验。

我们首先证明了在本发明中DNA的使用浓度下，如图4（1）所示，CMV-LUC和Gq-CMV-LUC对细胞没有毒性。然后证明了在本发明中聚凝胺的使用浓度（5μg/mL）下，聚凝胺对细胞也是没有毒性的，不论是从细胞生长（如图4（2）），还是从细胞培养上清中乳酸脱氢酶（LDH）的量（如图4（3））来看，5μg/mL的聚凝胺对细胞都是没有毒性的。

然后我们用lipo2000作为对照，证明了无论是转线性DNA，还是转质粒DNA，本发明的效率都远高于lipo2000（如图5（1））。

接下来我们使用1%FBS的DMEM培养细胞，阻滞细胞的分裂，再进行本发明的转染，结果发现，在细胞周期被阻滞的情况下，相较于lipo2000和PEI,本发明仍有较好的转染效率（如图5（2）（3）），说明DNA自转染法不依赖与细胞周期。

然后我们检测了人正常肝细胞系L02和肝癌细胞系HepG2的核仁素的mRNA水平，检测引物为5-CCACTTGTCCGCTTCACACT （上游）和 5- AGGAGCCATTTTCTTGGGGT （下游）。结果如图5（4）所示，正常肝细胞系L02的核仁素表达量显著低于肝癌细胞系HepG2，而相对应的，如图5（5）所示，在L02中，DNA自转染法相对于对照转染效率的提高倍数显著小于HepG2。说明DNA自转染法靶向核仁素高表达的细胞。

实施例 2： Gq介导绿色荧光蛋白（EGFP）基因自传染

以GFP基因为例，阐述本DNA自转染试剂盒。

步骤1

先设计一对引物（引物1）（引物1上游：5-TTTTGCTCACATGTTCTTTC-3下游：5-ATTTACGCGTTAAGATA-3）以质粒pEGFPC1为模板，将CMV-GFP-polyA扩增出来，进行沉淀回收，作为下一步PCR的模板以及实验对照。

再设计一对引物（引物2）（引物2的上游引物5-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttTTTTGCTCACATGTTCTTTC-3下游引物5-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttATTTACGCGTTAAGATA-3），其5’端带有核仁素亲和适配体AS1411的序列5’-(GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG)-3’，引物2的结构如图1(5)所示，上下游引物分别命名为引物2-F、引物2-R。然后以上文的线性产物CMV-GFP为模板，以引物2-F或者引物2-R为上游引物或者下游引物各自单独进行PCR，分别得到两端含有前体Gq序列的两条单链，然后等比例混合两条单链PCR产物，加入5×annealing buffer（28mM Tris-HCl,200mM KCl,4nMMgCl2,调PH至7.0），混匀，95℃5min，缓慢降温至常温，然后用DNA纯化试剂盒去除多余的引物，就是纯的转染底物了，我们命名为Gq-CMV-EGFP（即Gq-DNA, CMV- EGFP为待转染DNA片段的名称，其中CMV是真核细胞高活性启动子DNA序列，EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因DNA序列），过程和产物结构如图1(4)所示。

最后证明我们的转染底物中确实形成了Gq，将Gq-CMV-EGFP和线性对照CMV-EGFP进行琼脂糖胶电泳，如图2（2）所示，显示Gq-CMV-EGFP的分子量比线性CMV-EGFP大得多，而两者的碱基数差别并没有图上显示的那么大，就可以说明我们的Gq-CMV-EGFP合成是成功的，此时的产物就是可以用于转染。

步骤2

提前将肝癌细胞HepG2铺进24孔板。

步骤3

将转染底物Gq-GFP和聚凝胺加入细胞，DNA的量为0.5μg每个孔，聚凝胺的浓度为5μg/mL，6h后换液。

步骤4

24小时之后,荧光显微镜下观察GFP的绿色荧光，并拍照，然后将细胞消化下来流式检测GFP的荧光强度。

结果如图7所示，标尺为100微米，在聚凝胺中和电荷之后， Gq-CMV-EGFP组的绿色荧光蛋白的表达量显著高于线性DNA组，说明Gq-CMV-EGFP组的GFP表达效率显著高于CMV-EGFP组。

实施例 3：Gq介导的经染料YOYO-1预染色的随机DNA片段的自传染

以一段长约800bp的随机DNA为例，阐述本DNA自转染试剂盒的高效性与普适性。

步骤1

先设计一对引物（引物1）（引物1上游：5- CATCGCATTGTCTGAGTAGGTG-3下游：5-CGAGAAAGGAAGGGAAGAAAG-3）以质粒px601为模板将此随机片段扩增出来，进行沉淀回收，作为下一步PCR的模板以及实验对照。

再设计一对引物（引物2）（引物2的上游引物5-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTT GATTGGGAAGAGAATAGCAGGCAT-3下游引物5- GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTT GCTACAGGGCGCGTACTATGGTT-3），其5’端带有核仁素亲和Gq前体序列5’-(GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG)-3’，引物2的结构如图1(5)所示。然后以上文中的线性DNA为模板，以引物2-F或者引物2-R为上游引物或下游引物各自单独进行PCR，分别得到两端含有前体Gq序列的两条单链，然后等比例混合两条单链PCR产物，加入5×annealing buffer（28mM Tris-HCl,200mM KCl,4nM MgCl2,调PH至7.0），混匀，95℃5min，缓慢降温至常温，然后用DNA纯化试剂盒去除多余的引物，就是纯的转染底物了，我们命名为Gq-DNA，过程和产物结构如图1(4)所示。

步骤2

提前将肝癌细胞HepG2和黑色素瘤细胞B16F10铺进24孔板。

步骤3

将转染底物Gq-DNA与YOYO-1共孵育15分钟，使得Gq-DNA或DNA带上荧光，然后将染过色的Gq-DNA或DNA及聚凝胺与HepG2细胞共培养6小时，DNA的量为0.5μg每个孔，聚凝胺的浓度为5μg/mL，6h后换液。

步骤4

24小时之后, 收集细胞用流式细胞术的检测YOYO-1的荧光。结果表明，HepG2细胞对Gq-DNA的摄取显著高于线性DNA组，如图8（1）所示，标尺为100微米。我们重复图八（1）的实验，利用荧光显微镜观察，得到了同样的结论，如图8（2）所示，标尺为100微米。我们在鼠黑色素瘤细胞系B16F10中重复了同样的实验，然后延长了收样的时间，在13小时收集样本并固定用DAPI对细胞核进行染色。激光扫描共聚焦图像和定量结果表明，与DNA相比，Gq-DNA在细胞核中有一个显著的积累，我们将细胞核中有明显YOYO-1荧光积累的细胞标记为阳性细胞，结果发现Gq-DNA组阳性细胞百分比显著高于对照，这意味着G四聚体可以促进DNA进入细胞核或增强细胞核中DNA的稳定性，如图8（3）所示，标尺为20微米。我们利用YOYO-1监测Gq-DNA进入细胞膜和细胞核的效率，也证明了本发明的高效性。

Claims (8)

1.一种G四聚体共价偶联DNA分子，中间的双链是待转染DNA片段双链，每条链的5’端各由9个胸腺嘧啶(T)链连接的G-四聚体，Gq-DNA的核酸序列：链1：GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttTTTTGCTCACATGTTCTTTC；

链2：GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttNNN……NNN；

链3：GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttATTTACGCGTTAAGATA；

链4：GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttNNN……NNN；

链1或链2的9个胸腺嘧啶(T)前的富鸟嘌呤(G)序列与链3或链4的富鸟嘌呤(G)序列相互结合形成G四聚体，链3和链4的NNN……NNN部分互补配对形成双链,链3和链4的NNN……NNN为待转染DNA。

2.根据权利要求1所述G四聚体共价偶联DNA分子的合成方法，首先将待转染基因构建到真核细胞过表达载体上，然后设计引物1进行常规PCR，得到启动子+待转染基因的DNA线性片段；以片段为模板，再设计一对引物2，引物2的上游引物5

-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTT GATTGGGAAGAGAATAGCAGGCAT-3下游引物

5-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTT GCTACAGGGCGCGTACTATGGTT-3，其5’端带有核仁素亲和Gq前体序列5’

-(GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG)-3’，用带有前体G q序列的引物2：5-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3单独进行单链分步PCR，分别得到两端含有前体Gq序列的两条单链，其中N为与模板配对碱基序列；然后测量两种产物的浓度，并按照1:1的比例混合，然后加入5×Annealing buffer，混匀，95℃5min，缓慢降温至常温，退火得到G四聚体共价偶联DNA分子。

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：所述基因为DNA片段。

4.根据权利要求2或3所述的合成方法，其特征在于：所述表达载体上为pCMV-tag2A；引物1的上游引物为5-TTTTGCTCACATGTTCTTTC-3，下游引物为5-ATTTACGCGTTAAGATA-3；引物2的上游引物为5-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttTTTTGCTCACATGTTCTTTC-3，下游引物为5-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGtttttttttATTTACGCGTTAAGATA-3。

5.一种DNA自转染试剂盒，其特征在于：包括聚凝胺、5×Annealing buffer和权利要求1所述的G四聚体共价偶联DNA分子。

6.权利要求5所述DNA自转染试剂盒在转染肿瘤细胞中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述肿瘤细胞为肝癌细胞。

8.根据权利要求6或7所述的用途，其特征在于：将G四聚体共价偶联DNA分子和聚凝胺加入肿瘤细胞，在使用过程中，通过聚凝胺中和掉DNA和细胞膜上的负电荷之后，G四聚体共价偶联DNA分子与细胞膜表面的核仁素结合，在核仁素的穿梭运动下被带入细胞核。

Images