CN108949636A - 一种花生壳发酵专用复合菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种花生壳发酵专用复合菌剂及其制备方法和应用，花生壳发酵专用复合菌剂包括复合菌体和辅料，所述复合菌体包括：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。本发明的花生壳发酵专用复合菌剂中，各种微生物间具有高度协同作用，能够形成稳定的生态系统，可以在未经灭菌的花生壳粉中快速生长繁殖，占据优势，迅速产生大量乳酸，降低发酵饲料pH值，改善饲料的发酵品质，提高饲料的营养价值和适口性。

Description

一种花生壳发酵专用复合菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及饲料加工领域，特别涉及一种花生壳发酵专用复合菌剂及其制 备方法和应用。
背景技术
我国花生壳资源非常丰富，2015年全国花生壳总产量为500万吨，可利用 量不足1/3，发展潜力很大。如何合理、充分开发利用花生壳，提高其中和利用 水平，受到国内外学者的重视。
目前，饲料及养殖行业人畜争粮的矛盾突出，大量秸秆资源没有的到合理 的开发利用。
传统上秸秆饲料转化主要是采用化学处理(氨化、碱化、酸化等)以及物 理处理等方式。然而化学试剂处理具有一定的腐蚀性，存在安全隐患；而物理 处理不能达到提到饲料营养的目的。微生物发酵技术是近年来应用较为广泛的 一种生物饲料转化技术。微生物发酵中大多采用单一菌剂或混合菌剂。单一菌 剂发酵中，容易受到有害菌的污染和抑制，发酵效果不佳。混合菌剂各微生物 菌体间协同作用需要待证实。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种花生壳发酵专用复合 菌剂及其制备方法和应用。所述技术方案如下：
一方面，一种花生壳发酵专用复合菌剂，包括复合菌体和辅料，所述复合 菌体包括：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
进一步的，所述复合菌体中，植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌 和枯草芽孢杆菌的体积比为1:1:1:1。
进一步的，所述复合菌体和辅料的体积质量比为，复合菌体(体积)：辅料 (质量)＝5-10:1。
进一步的，所述辅料包括脱脂奶粉和乳糖。
另一方面，一种花生壳发酵专用复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)从-80℃超低温冰箱中，分别取植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳 杆菌和枯草芽孢杆菌，分别接种到2mL活化培养基中，过夜培养得到各菌株活 化培养液；
(2)将步骤(1)所述的各菌株活化培养液，按1％体积比的接种量分别接 种到对应的扩大培养基中，培养得各菌株种母培养液；
(3)将步骤(2)所述的各菌株种母培养液，按2-5％体积比的接种量分别 接种到对应的扩菌培养基中，分别培养至菌液在OD600nm测得的值大于4，然后 分别离心，弃去上清液，重悬沉淀，分别得到植物乳杆菌菌体悬液、鼠李糖乳 杆菌菌体悬液、副干酪乳杆菌菌体悬液、枯草芽孢杆菌菌体悬液；
(4)将所述植物乳杆菌菌体悬液、鼠李糖乳杆菌菌体悬液、副干酪乳杆菌 菌体悬液、枯草芽孢杆菌菌体悬液混合后得到复合菌体，向所述复合菌体中添 加辅料混合均匀，冷冻干燥后得到所述花生壳发酵专用复合菌剂。
进一步的，步骤(1)中所述植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌使 用的活化培养基为MRS液体培养基，30-37℃培养12-16h；所述枯草芽孢杆菌 使用的活化培养基为LB液体培养基，30-37℃培养12-16h；
步骤(2)中植物乳杆菌活化培养液、鼠李糖乳杆菌活化培养液和副干酪乳 杆菌活化培养液使用的扩大培养基为MRS液体培养基，30-37℃厌氧培养 12-18h；枯草芽孢杆菌活化培养液使用的扩大培养基为LB液体培养基，30-37℃ 好氧培养12-18h；
步骤(3)中植物乳杆菌种母培养液、鼠李糖乳杆菌种母培养液和副干酪乳 杆菌种母培养液使用的扩菌培养基为MRS液体培养基，30-37℃厌氧培养；枯 草芽孢杆菌种母培养液使用的扩菌培养基为LB液体培养基，30-37℃好氧培养。
进一步的，步骤(2)中植物乳杆菌种母培养液、鼠李糖乳杆菌种母培养液、 副干酪乳杆菌种母培养液和枯草芽孢杆菌种母培养液的浓度均≥109cfu/ml。
进一步的，步骤(3)中离心条件为5000rpm离心10-20min，使用10％乳 糖溶液重悬沉淀。
进一步的，步骤(4)中所述植物乳杆菌菌体悬液、鼠李糖乳杆菌菌体悬液、 副干酪乳杆菌菌体悬液、枯草芽孢杆菌菌体悬液按体积比1:1:1:1比例混合，得 到复合菌体，所述辅料包括脱脂奶粉和乳糖，所述复合菌体和辅料的体积质量 比为复合菌体(体积)：辅料(质量)＝5-10:1。
再一方面，一种花生壳发酵专用复合菌剂的应用，其包括以下步骤：
向花生壳粉中加入上述的花生壳发酵专用复合菌剂进行发酵，得花生壳粉 发酵饲料。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明的花生壳发酵专 用复合菌剂中，各种微生物间具有高度的协同作用，能够形成稳定的生态系统， 可以在未经灭菌的花生壳粉中快速生长繁殖，占据优势，迅速产生大量乳酸， 降低发酵饲料pH值，改善饲料的发酵品质，提高饲料的营养价值和适口性。本 发明的花生壳发酵专用复合菌剂作为添加剂饲喂动物可以调节肠道微生态系 统，提高动物免疫力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所 需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例5中花生壳发酵过程中pH值变化；
图2是本发明实施例5中花生壳粉发酵30天后细菌属水平相对丰度；
图3是本发明实施例5中花生壳粉发酵30天后真菌属水平相对丰度；
图4是本发明实施例5中花生壳粉发酵30天后细菌香农指数变化；
图5是本发明实施例5中花生壳粉发酵30天后真菌香农指数变化。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施方式作 进一步地详细描述。
实施例1单菌种菌体的制备
1、实验室保存的益生菌包括
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
各菌种采购自工业微生物菌种保藏管理中心及中国普通微生物菌种保藏管 理中心，具体订购信息参见表1和表2。
表1中国工业微生物菌种保藏管理中心订购信息
表2中国普通微生物菌种保藏管理中心订购信息
2、培养基及试剂制备
(1)MRS培养基组成及制备
取葡萄糖20.0g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉膏5.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，乙 酸钠5.0g/L，柠檬酸铵2.0g/L，K2HPO4·7H2O 2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L， MnSO4·4H2O0.05g/L，吐温80 1.0mL/L，pH调至6.2-6.4，115℃灭菌30min。
(2)LB培养基组成及制备
取蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L，用氢氧化钠调节 pH至7.0，定容至1.0L，121℃灭菌30min。
(3)10％乳糖溶液组成及制备
取100g乳糖，用800ml UP水溶解，用氢氧化钠调节pH至7.0，定容至 1.0L，115℃灭菌30min。
3、乳酸菌菌体的制作
(1)菌种的活化、种母的制备及菌体扩培，均使用MRS液体培养基。
(2)菌种活化
将保存于-80℃的乳酸菌(植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和副干酪乳杆菌)分 别接种到2mL活化培养基(MRS液体培养基)上，37℃过夜培养14h，得到 各菌种的活化培养液。
(3)种母培养
取(2)所述的活化培养液，按1％(v/v)的接种量分别接种于扩大培养基 (MRS液体培养基)中，37℃厌氧扩大培养12h，得到各菌株种母培养液，活 菌数达到109cfu/mL。
(4)菌体扩大培养
将(3)所述的各菌株种母培养液，按2-5％(v/v)接种量接种到扩菌培养 基(MRS液体培养基)中，37℃厌氧培养至菌液在OD600nm测得的值大于4， 然后分别离心处理，离心条件为5000rpm，10-20min，充分富集菌体，去除培 养基(上清)，最后利用10％乳糖溶液重悬菌体，得到各菌种的菌体悬液。
4、芽孢杆菌菌体的制作
(1)菌种的活化、种母的制备及菌体扩培，均使用LB液体培养基。
(2)菌种活化
将保存于-80℃的芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌)接种到2mL活化培养基(LB 液体培养基)上，37℃过夜培养14h，得到枯草芽孢杆菌菌种的活化培养液。
(3)种母培养
取(2)所述的活化培养液，按1％(v/v)的接种量接种于扩大培养基(LB 液体培养基)中，37℃好氧扩大培养18h，得到枯草芽孢杆菌菌株种母培养液， 活菌数达到109cfu/mL。
(4)菌体扩大培养
将(3)所述的枯草芽孢杆菌菌株种母培养液，按2-5％(v/v)接种量接种 到扩菌培养基(LB液体培养基)中，37℃好氧培养至菌液在OD600nm测得的值 大于4，然后离心处理，离心条件为5000rpm，10-20min，充分富集菌体，去 除培养基(上清)，最后利用10％乳糖溶液重悬菌体，得到枯草芽孢杆菌的菌体 悬液。
实施例2花生壳发酵专用复合菌剂的制备
花生壳发酵专用复合菌剂包括：复合菌体和辅料。
复合菌体包括：乳酸菌菌体(植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和副干酪乳杆菌) 和芽孢杆菌菌体(枯草芽孢杆菌)。
辅料包括：脱脂奶粉和乳糖。
将实施例1制备得到的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌和枯草 芽孢杆菌的菌体悬液按照1:1:1:1的体积比混合，制成复合菌体，然后与辅料(脱 脂奶粉和乳糖)按5-10:1(v/m)混合均匀，冷冻干燥后得到花生壳发酵专用复 合菌剂。
实施例3花生壳发酵专用复合菌剂的应用
1、花生壳粉的准备
取没有霉变的花生壳，经齿轮粉碎机进行预粉碎，然后再经锤式粉碎机粉 碎。粉碎机筛网直径为1毫米。粉碎后的花生壳粉全部过40目筛网。
2、取实施例1制备得到的花生壳发酵专用复合菌剂。
以花生壳发酵专用复合菌剂占花生壳粉的质量比为0.5％添加到花生壳粉 中，调好料水比后，在常温下厌氧发酵30天，即得到花生壳粉生物发酵饲料。 发酵完成后，测定花生壳粉生物发酵饲料的pH、乳酸、粗蛋白、铵态氮等成分 变化。
具体实施工艺如下：
首先将1.75公斤花生壳发酵专用复合菌剂悬浮在100公斤水中，于室温下 缓慢搅拌20分钟。之后，继续向花生壳发酵专用复合菌剂悬浮液中加入550公 斤水，待用。
取350公斤花生壳粉放入混料机中，开启混料机搅拌；随后将上述花生壳 发酵专用复合菌剂悬浮液在不断搅拌的同时向混料机中的花生壳粉中添加；将 上述650公斤花生壳发酵专用复合菌剂悬浮液全部加到350公斤花生壳粉中后， 继续搅拌10分钟，使花生壳发酵专用复合菌剂、水分同花生壳粉充分混匀。
将上述与花生壳发酵专用复合菌剂混合后的花生壳粉分装到厌氧发酵袋 中，每袋装100公斤，封口后堆放，进行发酵。在常温下厌氧发酵30天，即得 到花生壳粉生物发酵饲料。
实施例4花生壳发酵专用复合菌剂的应用
1、花生壳粉的准备
取没有霉变的花生壳，经齿轮粉碎机进行预粉碎，然后再经锤式粉碎机粉 碎。粉碎机筛网直径为1毫米。粉碎后的花生壳粉全部过40目筛网。
2、取实施例1制备得到的花生壳发酵专用复合菌剂。
以花生壳发酵专用复合菌剂占花生壳粉的质量比为1.0％添加到花生壳粉 中，调好料水比后，在常温下厌氧发酵30天，即得到花生壳粉生物发酵饲料。 发酵完成后，测定花生壳粉生物发酵饲料的pH、乳酸、粗蛋白、铵态氮等成分 变化。
具体实施工艺如下：
首先将3.5公斤花生壳发酵专用复合菌剂悬浮在100公斤水中，于室温下缓 慢搅拌20分钟。之后，继续向花生壳发酵专用复合菌剂悬浮液中加入550公斤 水，待用。
取350公斤花生壳粉放入混料机中，开启混料机搅拌；随后将上述花生壳 发酵专用复合菌剂悬浮液在不断搅拌的同时向混料机中的花生壳粉中添加；将 上述650公斤花生壳发酵专用复合菌剂悬浮液全部加到350公斤花生壳粉中后， 继续搅拌10分钟，使花生壳发酵专用复合菌剂、水分同花生壳粉充分混匀。
将上述与花生壳发酵专用复合菌剂混合后的花生壳粉分装到厌氧发酵袋 中，每袋装100公斤，封口后堆放，进行发酵。在常温下厌氧发酵30天，即得 到花生壳粉生物发酵饲料。
实施例5花生壳发酵专用复合菌剂的应用
1、花生壳粉的准备
取没有霉变的花生壳，经齿轮粉碎机进行预粉碎，然后再经锤式粉碎机粉 碎。粉碎机筛网直径为1毫米。粉碎后的花生壳粉全部过40目筛网。
2、取实施例1制备得到的花生壳发酵专用复合菌剂。
以花生壳发酵专用复合菌剂占花生壳粉的质量比为1.5％添加到花生壳粉 中，调好料水比后，在常温下厌氧发酵30天，即得到花生壳粉生物发酵饲料。 发酵完成后，测定花生壳粉生物发酵饲料的pH、乳酸、粗蛋白、铵态氮等成分 变化。
具体实施工艺如下：
首先将2.625公斤花生壳发酵专用复合菌剂悬浮在100公斤水中，于室温下 缓慢搅拌20分钟。之后，继续向花生壳发酵专用复合菌剂悬浮液中加入550公 斤水，待用。
取350公斤花生壳粉放入混料机中，开启混料机搅拌；随后将上述花生壳 发酵专用复合菌剂悬浮液在不断搅拌的同时向混料机中的花生壳粉中添加；将 上述650公斤花生壳发酵专用复合菌剂悬浮液全部加到350公斤花生壳粉中后， 继续搅拌10分钟，使花生壳发酵专用复合菌剂、水分同花生壳粉充分混匀。
将上述与花生壳发酵专用复合菌剂混合后的花生壳粉分装到厌氧发酵袋 中，每袋装100公斤，封口后堆放，进行发酵。在常温下厌氧发酵30天，即得 到花生壳粉生物发酵饲料。
实施例6育肥猪饲喂效果试验
1、试验对象及地点：选择120头健康松辽黑猪为试验对象，体重在45-50 公斤，随机分为四组，即对照组(饲喂育肥饲料)，试验组(在育肥饲料中分别 混入实施例2、实施例3和实施例4的花生壳粉发酵饲料)，分组情况见表4， 每组30头猪；本实验在吉林省农业科学院畜牧科学分院畜牧研究所进行。
2、育肥猪基础饲料组成：见表3。
表3育肥猪饲料配比表
序号 组成 比例(％)
1 玉米 63.0
2 豆粕 7.5
3 玉米蛋白粉 9.0
4 麸皮 15.0
5 鱼粉 2.0
6 骨粉 0.5
7 石粉 1.0
8 食盐 0.5
9 预混料 1.5
3、分组及各组饲料组成：见表4。
表4各试验组饲料组成表
4、试验方式及时间：
按正常饲喂、自由觅食；实验期为35天。
5、检测项目及指标：
试验指标：记录每组采食量、体重增加量、粪便情况。计算平均日增重、 平均日采食量和饲料转化率。
平均日增重：分别于正式试验的第一天和试验最后一天早晨，逐头空腹称 重，由末重与始重之差除以实验天数，计算各组猪的平均日增重。
平均日采食量：记录各组的投料量和剩料量，投料量减去剩料量再除以实 验天数，算出平均日采食量。
饲料转化率：用各组猪的平均日采食量除以各组猪的平均日增重，即得出 个各组猪饲料转化率。
粪便情况观察：观察粪便是否正常，如：有形(圆柱形)，有形(软便)， 不成形(粘稠)等。
6、结果及分析
(1)花生壳发酵专用复合菌剂对花生壳粉的发酵效果
考察了花生壳发酵专用复合菌剂的不同添加量对花生壳粉发酵的影响。实 施例3添加花生壳发酵专用复合菌剂的量为花生壳粉干物质的0.5％；实施例4 添加花生壳发酵专用复合菌剂的量为花生壳粉干物质的1.0％；实施例5添加花 生壳发酵专用复合菌剂的量为花生壳粉干物质的1.5％。在发酵过程中，抽检了 发酵第0天、第3天、第10天、第20天、第30天的花生壳粉发酵产物的pH 值；并对发酵30天后，花生壳粉发酵饲料的氨态氮/总氮、粗蛋白含量、中性洗 涤纤维和酸性洗涤纤维等指标进行了检测。各指标检测方法如下：
pH值采用pH计测定，氨态氮采用蒸馏法，粗蛋白采用凯氏定氮法，中性 洗涤纤维和酸性洗涤纤维采用改良范式纤维素测定法。
以未添加花生壳发酵专用复合菌剂的花生壳粉发酵作为对照组。
上述试验结果见图1和表5。
表5花生壳粉发酵30天后发酵饲料质量
对照 实施例3 实施例4 实施例5
pH值 3.89 3.54 3.5 3.48
乳酸(mg/g) 96.46 113.25 116.65 118.9
乙酸(mg/g) 1.01 2.43 2.43 2.43
氨态氮/总氮 7.35 5.92 5.9 5.89
乳酸菌(cfu/g) 4.1×107 2.0×108 2.1×108 2.2×108
酵母菌(cfu/g) 1.7×105 4.7×103 4.7×103 4.7×103
干物质(％) 38.05 37.73 37.73 37.73
粗蛋白(％) 8.45 8.74 8.76 8.84
可溶性碳水化合物(mg/g) 15.73 9.72 9.7 9.67
中性洗涤纤维(％) 68.77 61.61 61.56 61.59
酸性洗涤纤维(％) 59.41 55.91 55.89 55.87
图1是花生壳发酵过程中pH值变化结果。实验设3个平行，以平均值进行 分析，结果表明：使用本发明的花生壳发酵专用复合菌剂，花生壳粉pH值下降 快，在发酵第3天pH值降低至3.51，乳酸含量达到89.74mg/g，之后维持稳定。
表5为花生壳粉发酵30天后发酵饲料质量的分析结果。实验设3个平行， 以平均值进行分析，结果表明，与对照组相比，使用本发明的花生壳发酵专用 复合菌剂时，pH值降低了3.54％；氨态氮/总氮降低了19.46％；粗蛋白含量了增 加了3.49％；中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维分别减少了10.41％和5.89％。
(2)花生壳发酵专用复合菌剂对花生壳粉发酵后的微生物群落机构影响
利用高通量测序技术考察了发酵后的花生壳发酵饲料中微生物多样性。取 发酵30天后的对照组、实施例3、实施例4和实施例5样品，利用天根土壤基 因组提取试剂盒提取样品中的总DNA，之后，利用16S rRNA V3-V4区引物 (Forword：5’-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3’；Reverse 5’-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3’)以及ITSrDNA引物(forword: 5’-GTGAATCATCGARTC-3’；reverse 5’-TCCTCCGCTTATTGAT-3’)建立DNA 文库，并利用高通量测序仪(Illumina MiSeq)对样品中的微生物群系进行了测 定和分析。结果见图2-5和表6-7。
表6花生壳粉发酵30天后细菌菌群α多样性
表7花生壳粉发酵30天后真菌菌群α多样性
图2是花生壳粉发酵30天后细菌属水平相对丰度结果。高通量测序分析显 示，接种花生壳发酵专用复合菌剂后，益生菌乳酸杆菌和双歧杆菌的相对丰度 显著升高，而一些致病菌如肠杆菌、泛生菌和梭菌多数已检测不到。
图3是花生壳粉发酵30天后真菌属水平相对丰度结果。分析结果表明，接 种花生壳发酵专用复合菌剂后，一些酵母菌属如假丝酵母和接合酵母丰度显著 上升，同样显著上升还有一些丝状真菌，如根霉菌和毛霉菌。这些真菌被经常 用于添加到发酵食品中，是良好的糖解酶生产者，可以产生多酚等营养物质。 而像镰刀菌这类有害菌真菌被明显抑制。
图4和图5分别为花生壳粉发酵30天后细菌、真菌的香农指数变化情况。 香农指数通常用来估计微生物群落的多样性，其值越大，多样性越高。从图中 可见，花生壳发酵专用复合菌剂的接种降低了花生壳细菌和真菌的菌群多样性， 说明接种菌抑制了杂菌的生长并成为优势菌群。
表6和表7分别为花生壳粉发酵30天后细菌、真菌菌群的α多样性情况。 分类单元(OTU)即操作分类单元，将序列相似性大于97％的定义为一个分类 单元，每个分类单元对应于一个不同的细菌(微生物)种群。测序深度(Coverage) 是指各样品文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列没有被测出的概率越低。ACE指数(ACE)和乔1指数(Chao1)是用来估计群落中含有分类单元数目的 指数，其值越大，代表菌群丰度越高。除香农指数(Shannon)外，辛普森指数 (Simpson)也是用来估算微生物群落多样性的指标，虽算法不一，但都是值越 大，代表多样性越高。由表可知，接种花生壳发酵专用复合菌剂后，花生壳的 细菌和真菌的丰度以及多样性在测序深度足够的情况下，都表现出显著下降的 趋势。
(3)实验结果表明：使用本发明的花生壳发酵专用复合菌剂，花生壳粉pH 值下降快，在发酵第3天pH值降低至3.51，乳酸含量达到89.74mg/g。通过生 物学检测方法检测结果表明，使用本发明的花生壳发酵专用复合菌剂时，接种 菌很快占主要优势，成为其中优势菌，抑制有害菌的生长。
(4)花生壳粉饲料发酵特征和营养成分检测
检测指标如下pH值、氨态氮/总氮，粗蛋白含量中性洗涤纤维和酸性洗涤 纤维。各指标检测方法如下：
pH值采用pH计测定，氨态氮采用蒸馏法，粗蛋白采用凯氏定氮法，中性 洗涤纤维和酸性洗涤纤维采用改良范式纤维素测定法。
实验结果表明，与对照组相比，使用本发明的花生壳发酵专用复合菌剂时， pH值降低了3.54％；氨态氮/总氮降低了19.46％；粗蛋白含量了增加了3.49％； 中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维分别减少了10.41％和5.89％。
本发明的花生壳发酵专用复合菌剂中，各种微生物间具有高度的协同作用， 能够形成稳定的生态系统，可以在未经灭菌的花生壳粉中快速生长繁殖，占据 优势，迅速产生大量乳酸，降低发酵饲料pH值，改善饲料的发酵品质，提高饲 料的营养价值和适口性。本发明的花生壳发酵专用复合菌剂作为添加剂饲喂动 物可以调节肠道微生态系统，提高动物免疫力。
上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的 精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。

Claims (10)

1.花生壳发酵专用复合菌剂，其特征在于，包括复合菌体和辅料，所述复合菌体包括：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
2.如权利要求1所述的花生壳发酵专用复合菌剂，其特征在于，所述复合菌体中，植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌的体积比为1:1:1:1。
3.如权利要求2所述的花生壳发酵专用复合菌剂，其特征在于，所述复合菌体和辅料的体积质量比为，复合菌体：辅料＝5-10:1。
4.如权利要求3所述的花生壳发酵专用复合菌剂，其特征在于，述辅料包括脱脂奶粉和乳糖。
5.一种花生壳发酵专用复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌，分别接种到活化培养基中，过夜培养得到各菌株活化培养液；
(2)将步骤(1)所述的各菌株活化培养液，按1％体积比的接种量分别接种到对应的扩大培养基中，培养得各菌株种母培养液；
(3)将步骤(2)所述的各菌株种母培养液，按2-5％体积比的接种量分别接种到对应的扩菌培养基中，分别培养至菌液在OD600nm测得的值大于4，然后分别离心，弃去上清液，重悬沉淀，分别得到植物乳杆菌菌体悬液、鼠李糖乳杆菌菌体悬液、副干酪乳杆菌菌体悬液、枯草芽孢杆菌菌体悬液；
(4)将所述植物乳杆菌菌体悬液、鼠李糖乳杆菌菌体悬液、副干酪乳杆菌菌体悬液、枯草芽孢杆菌菌体悬液混合后得到复合菌体，向所述复合菌体中添加辅料混合均匀，冷冻干燥后得到所述花生壳发酵专用复合菌剂。
6.如权利要求5所述的花生壳发酵专用复合菌剂的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中所述植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌使用的活化培养基为MRS液体培养基，30-37℃培养12-16h；所述枯草芽孢杆菌使用的活化培养基为LB液体培养基，30-37℃培养12-16h；
步骤(2)中植物乳杆菌活化培养液、鼠李糖乳杆菌活化培养液和副干酪乳杆菌活化培养液使用的扩大培养基为MRS液体培养基，30-37℃厌氧培养12-18h；枯草芽孢杆菌活化培养液使用的扩大培养基为LB液体培养基，30-37℃好氧培养12-18h；
步骤(3)中植物乳杆菌种母培养液、鼠李糖乳杆菌种母培养液和副干酪乳杆菌种母培养液使用的扩菌培养基为MRS液体培养基，30-37℃厌氧培养；枯草芽孢杆菌种母培养液使用的扩菌培养基为LB液体培养基，30-37℃好氧培养。
7.如权利要求6所述的花生壳发酵专用复合菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中植物乳杆菌种母培养液、鼠李糖乳杆菌种母培养液、副干酪乳杆菌种母培养液和枯草芽孢杆菌种母培养液的浓度均≥109cfu/ml。
8.如权利要求7所述的花生壳发酵专用复合菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中离心条件为5000rpm离心10-20min，使用10％乳糖溶液重悬沉淀。
9.如权利要求8所述的花生壳发酵专用复合菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述植物乳杆菌菌体悬液、鼠李糖乳杆菌菌体悬液、副干酪乳杆菌菌体悬液、枯草芽孢杆菌菌体悬液按体积比1:1:1:1比例混合，得到复合菌体，所述辅料包括脱脂奶粉和乳糖，所述复合菌体和辅料的体积质量比为复合菌体：辅料＝5-10:1。
10.一种花生壳发酵专用复合菌剂的应用，其特征在于，包括以下步骤：
向花生壳粉中加入权利要求1-4任一项所述的花生壳发酵专用复合菌剂进行发酵，得花生壳粉发酵饲料。
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