CN108938622A - 一种组合物及其在制备抗炎药物中的应用 - Google Patents

一种组合物及其在制备抗炎药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种组合物及其在制备抗炎药物中的应用，所述组合物包括水飞蓟宾和二苯甲酰甲烷。本发明提供的组合物包括水飞蓟宾和二苯甲酰甲烷，将水飞蓟宾和二苯甲酰甲烷联合使用，对脂多糖诱导巨噬细胞建立的炎症模型有良好的抑制效果，药效明显优于单独用药；而且，提供的组合物在炎症中给药剂量低，明显降低单独用药的浓度，从而减少单独药物的毒副作用，减少对人体的伤害。另外，该组合物使用的组分价格相对便宜。

Description

一种组合物及其在制备抗炎药物中的应用
技术领域
本发明涉及抗炎药物技术领域，更具体地，涉及一种组合物及其在制备抗炎药物中的应用。
背景技术
炎症是身体组织对病原体、受损细胞或刺激物等有害刺激物的复杂生物反应，是一种涉及免疫细胞、血管和分子介质的保护性应答。炎症的功能是清除从原始损伤和炎症过程中受损坏死的细胞和组织，并启动组织修复。
在炎症过程中，一方面损伤因子直接和间接造成组织和细胞的破坏，另一方面通过炎症充血和渗出反应，以稀释、杀伤和包围损伤因子。同时通过实质和间质细胞的再生使受损伤的组织得以修复和愈合。因此可以说炎症是损伤的抗损伤的统一过程。
炎症可分为急性炎症和慢性炎症。急性炎症持续时间短，是由先天性免疫系统引起的，以渗出病变为其特征，炎症细胞浸润以粒细胞为主。而慢性炎症的病程较长，可由急性炎症迁延而来，或者由于致炎因子的刺激较轻，持续时间较长，一开始即呈慢性经过。炎细胞浸润多以淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞为主，常伴有成纤维细胞和血管内皮细胞的增生。当机体抵抗力降低，病原体大量繁殖时，慢性炎症可转化为急性炎症，称为慢性炎症急性发作。
研究发现，很多疾病如动脉粥样硬化、糖尿病、高血压、类风湿性关节炎、骨关节炎、克罗恩病、肿瘤等都在一定程度上存在慢性炎症状态，如促炎细胞因子的升高、依附分子表达的增加等。这种持续低度的慢性炎症反应促进此类疾病的病理反应以及二者的相互作用，从而导致疾病的加重或者并发症的产生。
现有技术中，针对炎症相关疾病的药物治疗方法存在着用药量大、毒副作用大以及价格昂贵的缺陷，因此，急需开发出抗炎效果好且用药量较低、毒副作用较小、价格相对便宜的抗炎药物。
发明内容
本发明为克服上述现有技术所述的用药量大、毒副作用大以及价格昂贵的缺陷，提供一种组合物，提供的组合物将水飞蓟宾和二苯甲酰甲烷联合使用，抗炎效果好，药效明显优于单独用药，且用药量低、有效减少单独药物的毒副作用、价格相对便宜。
本发明的另一目的在于提供上述组合物在制备抗炎药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种组合物，包括水飞蓟宾和二苯甲酰甲烷。所述水飞蓟宾与二苯甲酰甲烷的摩尔比为0.5~2:1。
所述水飞蓟宾和二苯甲酰甲烷均为天然产物，可通过市售得到；也可由本领域技术人员根据现有技术提取得到。
所述水飞蓟宾的英文名为Silibinin，分子结构为：
。
所述二苯甲酰甲烷的英文名为dibenzoyl methane，英文简称为DBM，分子结构为：
。
发明人经过大量的研究工作，偶然发现水飞蓟宾和二苯甲酰甲烷联合使用，对LPS（脂多糖）诱导巨噬细胞建立的炎症模型有良好的抑制效果，药效明显优于单独用药。水飞蓟宾和二苯甲酰甲烷的毒性作用较小，而且，该组合物在炎症中给药剂量低，明显降低单独用药的浓度，从而减少单独药物的毒副作用，减少对人体的伤害。另外，该组合物使用的组分价格相对便宜，能够有效减轻患者的经济负担。
优选地，所述水飞蓟宾与二苯甲酰甲烷的摩尔比为1:1。
优选地，所述水飞蓟宾的浓度为20µM。
优选地，所述二苯甲酰甲烷的浓度为20µM。
本发明同时保护上述组合物在制备抗炎药物中的应用。
本发明还保护上述组合物在制备用于抑制脂多糖诱导RAW264.7巨噬细胞产生炎症因子IL-1β的药物中的应用。
本发明还保护上述组合物在制备用于抑制脂多糖诱导RAW264.7巨噬细胞产生炎症因子TNF-α的药物中的应用。
本发明还保护一种药物制剂，所述药物制剂的活性成分为上述组合物。
优选地，所述药物制剂还包括药学上可接受的辅料。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的组合物包括水飞蓟宾和二苯甲酰甲烷，将水飞蓟宾和二苯甲酰甲烷联合使用，对LPS（脂多糖）诱导巨噬细胞建立的炎症模型有良好的抑制效果，药效明显优于单独用药；而且，提供的组合物在炎症中给药剂量低，明显降低单独用药的浓度，从而减少单独药物的毒副作用，减少对人体的伤害。另外，该组合物使用的组分价格相对便宜。
附图说明
图1为MTT实验的水飞蓟宾的实验结果数据图。
图2为MTT实验的二苯甲酰甲烷的实验结果数据图。
图3为Griess实验的水飞蓟宾单独用药的实验结果数据图。
图4为Griess实验的二苯甲酰甲烷单独用药的实验结果数据图。
图5为Griess实验的水飞蓟宾和二苯甲酰甲烷联合用药的实验结果数据图。
图6为ELISA实验的水飞蓟宾和二苯甲酰甲烷分别单独用药与联合用药对炎症因子IL-1β的抑制影响。
图7为ELISA实验的水飞蓟宾和二苯甲酰甲烷分别单独用药与联合用药对炎症因子TNF-α的抑制影响。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。
实施例1
（1）MTT实验
用MTT实验测定不同浓度的水飞蓟宾、二苯甲酰甲烷以及两者联用对RAW264.7细胞的生长影响，具体实施方案如下：
用胰蛋白酶将RAW264.7细胞从培养瓶中消化下来，离心5分钟，加入含有10% FBS的DMEM培养基中制成细胞悬浮液，以接种浓度5×104个/mL的浓度接种于96孔板（100 μL/孔），置于5% CO2，37℃培养24小时。设置水飞蓟宾和二苯甲酰甲烷的浓度为80µM、40µM、20µM、10µM、5µM和2.5µM，每个浓度设置6个复孔。5% CO2，37℃培养24 h后小心吸出培养液，每孔加入150 µL无血清培养基配制的MTT溶液（0.5 mg/mL)； 继续培养4 h后，小心吸去孔内培养液。每孔加入150µL DMSO，在培养箱静置十分钟；用酶标仪测量570 nm处各孔的吸光值。
实验结果
实验结果如图1~2所示，从图1~2中可以看出，水飞蓟宾和二苯甲酰甲烷对RAW264.7细胞的生长没有太大影响。最高浓度为80µM时，两者对RAW264.7细胞的抑制率均小于10%，说明两者对RAW264.7细胞的毒性不大。
（2）Griess实验
给出相同浓度配比的水飞蓟宾和二苯甲酰甲烷单独或者联合用药对RAW264.7产生NO含量的影响。通过Griess实验，具体实施方案如下：
用胰蛋白酶将RAW264.7细胞从培养瓶中消化下来，离心5分钟，加入含有10% FBS的DMEM培养基中制成细胞悬浮液，以接种浓度1×106个/mL的浓度接种于96孔板（100 μL/孔），置于5% CO2，37℃培养。24小时后，弃去培养基，空白组和LPS（脂多糖）组加入100µLDMEM基础培养基，实验组加入水飞蓟宾（80µM、40µM、20µM、10µM、5µM和2.5µM），二苯甲酰甲烷（80µM、40µM、20µM、10µM、5µM和2.5µM）以及它们1:1的组合物进行预处理，每个浓度设置3个复孔。1小时后，每孔加入1µL含LPS（100µg/mL）的DMEM基础培养基，然后置于37℃、5% CO2培养箱内培养。24 h后，每孔取50 µL上清液加入另一个96孔培养板中，再往每孔加入50 µLGriessA试剂和50 µL GriessB试剂，轻轻摇动培养板混匀，置于室温孵育。10 min后，用酶标光度计检测 540nm 波长处的吸光光度值，NO的浓度依据NaNO2标准曲线进行计算。
实验结果
实验结果如图3~5所示，从图3~5中可以看出，随着浓度的升高，水飞蓟宾或二苯甲酰甲烷单独用药对LPS诱导的RAW264.7产生NO的抑制效果越明显；而当两者以1:1配比进行组合用药时，对LPS诱导的RAW264.7产生NO的抑制效果明显优于单独用药，特别是在20µM时，两者联合具有显著的协同作用。同时，结合实施例1的MTT实验结果，可知其在该浓度下对RAW264.7的毒性作用很小。
（3）ELISA实验
调整小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7密度为50万个/ml，接种于35mm小皿内，每皿加2 mL细胞悬液，置于37℃、5% CO2培养箱内孵育。24h后，弃去培养基，空白组加入1mL基础培养基，LPS组和实验组加入水飞蓟宾20µM, ，二苯甲酰甲烷20µM以及它们的组合物，预处理1小时后，LPS对照组和实验组分别加入LPS（最终浓度为1µg/mL）进行刺激. 每种用药浓度均有3孔重复。然后置于37℃、5% CO2培养箱内孵育。
24 h后，每孔取100 µL上清液，-80℃冷冻保存。从4℃冰箱取出TNF-α（肿瘤坏死因子） ELISA试剂盒和IL-1β试剂盒，室温平衡30min，准备好实验所需的试剂。
加样，分别设标准孔、待测样品孔。每孔分别加标准品或待测样品100µL，轻轻摇晃，覆上板贴，37℃孵育2小时。
弃去液体，甩干，不用洗涤。
每孔加生物素标记抗体工作液100µL，覆上新的板贴，37℃孵育1小时。
弃去液体，甩干，洗板3次。每次浸泡二分钟，200µL/每孔，甩干。
每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100µL，覆上新的板贴，37℃温育1小时。
弃去液体，甩干，洗板5次。每次浸泡二分钟，200µL/每孔，甩干。
依序每孔加底物溶液90µL，37℃避光显色15~30分钟。
依序每孔加入终止液50µL，终止反应。
在反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。
实验结果
实验结果如图6~7所示，由图6~7实验结果表明，20µM水飞蓟宾和20µM 二苯甲酰甲烷单独用药对LPS诱导的RAW264.7细胞产生的炎症因子IL-1β和TNF-α的抑制影响较小，而在该浓度1:1联合用药时显著抑制了IL-1β和TNF-α的产生。
实施例的Griess实验和ELISA实验均证明了水飞蓟宾和二苯甲酰甲烷联合用药的抗炎效果优于单独用药。
综上，本发明将水飞蓟宾和二苯甲酰甲烷联合使用，对LPS（脂多糖）诱导巨噬细胞建立的炎症模型有良好的抑制效果，药效明显优于单独用药；而且，提供的组合物在炎症中给药剂量低，明显降低单独用药的浓度，从而减少单独药物的毒副作用，减少对人体的伤害。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种组合物，其特征在于，包括水飞蓟宾和二苯甲酰甲烷，所述水飞蓟宾与二苯甲酰甲烷的摩尔比为0.5~2:1。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述水飞蓟宾与二苯甲酰甲烷的摩尔比为1:1。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述水飞蓟宾的浓度为20µM。
4.权利要求1至3任一项所述的组合物在制备抗炎药物中的应用。
5.权利要求1至3任一项所述的组合物在制备用于抑制脂多糖诱导RAW264.7巨噬细胞产生炎症因子IL-1β的药物中的应用。
6.权利要求1至3任一项所述的组合物在制备用于抑制脂多糖诱导RAW264.7巨噬细胞产生炎症因子TNF-α的药物中的应用。
7.一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的活性成分为权利要求1至3任一项所述组合物。
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