CN108913668A - 水稻白化转绿叶基因val1及其编码的蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水稻白化转绿叶基因VAL1及其编码的蛋白和应用，水稻白化转绿叶基因VAL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，与野生型相比，水稻白化转绿叶基因VAL1在第3个外显子上的T碱基转换为C碱基，从而导致突变体中氨基酸由苯丙氨酸变为丝氨酸。该基因突变后，val1突变体在幼苗早期出现白化叶片；从幼苗后期至分蘖期，叶片逐渐转绿且叶片边缘白化，表现出混合表型；在抽穗期，叶片几乎呈灰绿色，只有少数叶片表现出边缘白化。通过杂交发现该性状为隐性性状，因此能够利用此性状进行新品种的选育和种子纯度鉴定，对水稻的遗传育种具有重要意义。

Description

水稻白化转绿叶基因VAL1及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明属于遗传学技术领域，涉及水稻白化转绿叶基因VAL1及其编码的蛋白和应用。

背景技术

叶色突变是高等植物表现出的较为直观的一类突变形式，通常由光合色素组成和含量改变引起，表现出叶片颜色存在差异。叶色变异类型丰富，按照苗期叶色表现，可以将叶色突变体分为黄化、白化、浅绿、深绿、常绿、条纹和斑点等类型，而按照叶色突变后能否恢复正常可分为转绿和非转绿类型(Yoo et al.,2009)。

迄今为止，水稻叶色突变体已得到大量的研究和应用。其中，已有170个左右的叶色突变基因定位于水稻12条染色体上，约有60个左右叶色突变体基因被成功克隆。水稻叶色突变体的挖掘和研究具有重要的理论研究和应用价值。在基础研究上，水稻叶色突变体是解析叶绿素合成、叶绿体发育等光合作用机理研究的理想材料。因此，通过利用叶色突变体克隆相关基因，研究基因突变的遗传和调控机制，是深入认识光合作用机理，服务育种实践的重要基础。如郭春爱等利用水稻低叶绿素b突变体研究了低叶绿素b对突变体光系统II热稳定性的影响。结果表明，低叶绿素b突变体对高温更敏感，PSII捕光色素蛋白复合体(LHCII)中叶绿素b减少可能降低了PSII结构与功能的热稳定性(郭春爱等，2007)。Jung等鉴定分离出水稻中编码镁－整合酶H亚基的基因OsCHLH，该基因突变后，酶活性降低，突变体表现为苗期叶片失绿发白，叶绿体的类囊体膜发育不全，且叶绿素含量很低(Jung etal.,2003)。另一个关键酶是叶绿素a氧化酶，是合成叶绿素b所必需的酶，Lee等研究发现，OsCAO1基因突变后，突变体叶绿素b合成受阻，导致叶绿素b的含量几乎为零(Lee et al.,2005)。在育种应用上，水稻叶色突变体不仅可以作为形态标记，用于培育携带叶色标记的三系或两系不育系，提高杂交种子纯度，而且还可以作为高光效资源(如常绿突变体)应用于超高产育种。

目前，我国已利用叶色突变体育成了多个携带叶色标记的不育系。由于叶色变异多为隐性单基因控制，极易被转育成不同遗传背景的不育系，且不会对其杂交组合的叶色和产量造成影响，因而在杂交稻遗传育种上具有重要的利用价值。目前，已培育出标1A、M2S、安农810S等淡绿叶不育系，以及玉兔S、NHR111S、白丰A、全龙A等白化转绿型不育系(李云，2007；吴伟，2006；赵海军，2004)。然而，在生产实践中，也经常发现，某些黄叶不育系在全生育期表达，影响了不育系的繁殖和制种产量；而某些白化转绿不育系因叶色转化时间过早(多在三叶期后转色)，使除杂期缩短，亦不便于后期除杂。此外，多数苗期标记性状单系本身性状不优良、常导致其它重要农艺性状显著降低，利用时都需进行一个杂交转育过程以克服不良性状的遗传累赘，实现优异性状的聚合，这个过程往往非常困难，都要通过大量长期的转育才能实现。因此，到目前为止，具有育种价值的水稻叶色变异材料仍然非常匮乏，急待挖掘和利用一些兼顾产量及叶色表达时期，中后期转绿型资源或非生理损伤型叶色基因及其突变体。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供水稻白化转绿叶基因VAL1，该基因为苗期标记性状，并且对其他主要农艺性状无显著影响，为水稻转基因研究提供有力的工具，促进杂交稻育种研究；

本发明的目的之二在于提供水稻白化转绿叶基因VAL1编码的蛋白质；

本发明的目的之三在于提供水稻白化转绿叶基因VAL1的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

水稻白化转绿叶基因VAL1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述水稻白化转绿叶基因VAL1编码的蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述水稻白化转绿叶基因VAL1在水稻叶色性状的分子育种中的应用。

优选的，所述水稻品种为缙恢10号。

本发明利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变自育优良恢复系缙恢10号获得一个遗传稳定的水稻“白化转绿叶”突变体，在遗传分析和基因定位的基础上，先通过基因预测、同源搜索及基因序列差异比较，确定了水稻白化转绿叶突变性状为VAL1隐性基因控制，VAL1基因编码一个磷酸核糖胺甘氨酸连接酶(LOC_Os08g09210)，是嘌呤核苷酸从头合成途径的第二个酶。随后，本发明以水稻白化转绿叶突变体val1为材料，克隆了水稻白化转绿叶基因VAL1，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，开放阅读框为1584bp，编码527个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。与野生型缙恢10号相比，突变基因VAL1在第3个外显子上的T碱基转换为C碱基，从而导致突变体中氨基酸由苯丙氨酸变为丝氨酸。

将含有野生型基因LOC_Os08g09210的7198bp DNA片段转化到val1突变体中进行互补验证。在转基因植株中，突变表型完全恢复(图2B)。随后，构建了RNAi干涉载体并转化野生型缙恢10号。在转基因植株中，VAL1的转录水平显著降低(图2D)，且植株叶片出现和val1相似的白化转绿表型(图2B)。进一步确定水稻白化转绿叶突变性状由VAL1基因突变引起，因此，水稻白化转绿叶基因VAL1可用于水稻叶色性状的分子育种。

本发明的有益效果在于：

本发明公开了水稻白化转绿叶基因VAL1及其编码的蛋白和应用，水稻白化转绿叶基因VAL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，与野生型相比，水稻白化转绿叶基因VAL1在第3个外显子上的T碱基转换为C碱基，从而导致突变体中氨基酸由苯丙氨酸变为丝氨酸。该基因突变后，val1突变体在幼苗早期出现白化叶片；从幼苗后期至分蘖期，叶片逐渐转绿且叶片边缘白化，表现为混合表型；在抽穗期，叶片几乎呈灰绿色，只有少数叶片表现出边缘白化。通过杂交发现该性状为隐性性状，因此能够利用此性状选育新品种和种子纯度鉴定，对水稻的遗传育种具有重要意义。

本发明的水稻白化转绿叶基因VAL1为苗期标记性状，对其他主要农艺性状无显著影响，为水稻遗传育种研究提供了有力的工具，为选育纯种不育系奠定基础。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为野生型(WT)和val1突变体的表型特征。(A-C)WT和val1在幼苗期(A)、分蘖期(B)和抽穗期(C)的表型。右上方为WT和val1叶片的放大图像。(D-F)WT和val1在幼苗期(D)、分蘖期(E)和抽穗期(F)的叶片叶绿素含量。

图2为VAL1基因的分子鉴定。(A)VAL1基因的图位克隆。(B)野生型、互补植株、val1突变体和VAL1-RNAi植物的表型。标尺为5μm。(C)分蘖阶段野生型、互补植株和VAL1-RNAi植株的叶绿素含量。(D)VAL1在野生型和3个RNAi株系叶片中的表达分析。(E-H)抽穗期野生型、互补植株和VAL1-RNAi植株的净光合速率(E)，气孔导度(F)，胞间CO₂浓度(G)和蒸腾速率(H)。

图3为VAL1基因的表达模式和VAL1蛋白的亚细胞定位。(A)实时PCR检测不同组织中VAL1的表达模式。(B,C)实时PCR检测叶片中VAL1的表达模式。(D)原位杂交检测VAL1的表达模式。(E)VAL1蛋白的亚细胞定位。标尺为50μm。SB，茎基部；L4，第四片叶子；L2，第二叶；L3L，第三叶的下半部分；L3U，第三叶的上半部分。

图4为VAL1编码蛋白的序列比对分析。

图5为VAL1编码蛋白的进化树分析。

图6为VAL1参考嘌呤从头生物合成途径。(A)野生型和val1突变体中的AMP和GMP含量。(B)外施不同浓度(0，1，5，或10mM)的AMP，GMP，或AMP和GMP后，野生型和val1突变体的叶片形态学分析。(C)B图中野生型和val1的突变体叶绿素含量。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明实施例中使用的材料：野生型水稻材料缙恢10号(WT)和水稻白化转绿叶突变体val1，均由西南大学生物学创新团队培育(王峰等，核农学报，2011，25(2)：0197-0201)；本发明使用的各种限制性内切酶和T4连接酶(D2011A)均购自大连TaKaRa生物工程有限公司；各种快速限制性内切酶、DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；其他的化学试剂，如蔗糖、蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、氯化钙、CTAB、Tris-HCl、EDTA、氯化钠、丙烯酰胺、TEMED、琼脂粉、X-Glu主要购自于美国SIGMA公司和上海生工生物工程股份有限公司；通用型DNA纯化回收试剂盒(Universal DNA Purification Kit)，质粒提取试剂盒(TIANprep Mini Plasmid Kit)均购自天根生化科技(北京)有限公司，RNA提取试剂盒(Eastep Super总RNA提取试剂盒)和RNA反转录试剂盒(GoScript逆转录Mix,Oligo(dT))均购自美国Promega公司；实时定量PCR(SYBR Premix Dimer Eraser试剂盒)购自大连TaKaRa生物工程有限公司；引物合成和DNA测序由上海英俊生物技术有限公司完成；其它化学试剂购自北京鼎国生物技术有限责任公司；大肠杆菌DH5α、农杆菌LBA4404均购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心。

实施例1、水稻白化转绿叶突变体val1的获得和形态学观察

利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变自育优良恢复系缙恢10号获得一个遗传稳定的水稻叶色白化转绿叶突变体，命名为val1。

在野生型(WT)中，除了成熟后期以外，植株叶片在整个生长期都呈现绿色。而在突变体val1中，在幼苗早期出现白化叶片(图1中的A)。从幼苗后期至分蘖期，叶片逐渐转绿且叶片边缘白化，表现为混合表型(图1中的B)。在抽穗期，叶片几乎呈灰绿色，只有少数叶片表现出边缘白化(图1中的C)。因此，叶片越老，白化面积越小。这些结果表明val1的表型受生育进程的调控。此外，在幼苗期和分蘖期，与野生型相比，与val1突变体的白化表型一致，其叶片叶绿素含量极显著降低(图1中的D和E)，在成熟期略有降低(图1中的F)。综上所述val1突变体是一个受生育进程调控的白化转绿叶突变体。

实施例2、VAL1基因的分子鉴定

以val1突变体为父本，籼稻品种西农1A(Xinong1A)为母本杂交获得的F₁代植株，叶片全部表现为正常绿色，然后通过自交获得3853株F₂代群体中，依据白化转绿叶性状分离出了突变叶片和正常叶片两种表型，分离出了2885株正常单株和968株突变单株株，卡方验证结果表明，正常株与突变株符合3：1的分离比例，表明该突变性状由一对隐性单基因控制。

精细定位：VAL1基因之前被初步定位在第8染色体M22和ID27之间171kb范围内。根据已公布的籼稻品种93-11序列，在此区间内进一步筛选和开发标记，最终将VAL1基因精细定位至简单重复标记SSR8-1和插入/缺失标记ID30(序列如表1)之间，物理距离为29.69kb。此区间有4个注释基因(http://www.gramene.org/)。

表1、2对具有多态性的SSR标记序列

引物	正向序列(5′→3′)	反向序列(5′→3′)
			SSR8-1	attgctaaagatgatttggaacta(SEQ ID NO.3)	gggacctagaaacatcatctcc(SEQ ID NO.4)
ID30	cgccagcaatgtaggtttat(SEQ ID NO.5)	catgcttgctaaacagatacagac(SEQ ID NO.6)

测序分析发现LOC_Os08g09210基因的第三个外显子上T碱基突变为C碱基，导致突变体中氨基酸由苯丙氨酸转变为色氨酸(图2中的A)。为了证明是否LOC_Os08g09210突变导致突变表型，通过将含有野生型基因LOC_Os08g09210的7198bp DNA片段转化到val1突变体中进行互补验证。具体方法为：以VAL1C-F：5′-GCCgaattcGTTGGGTTCAAATCCCACCTTTCT-3′(SEQ ID NO.7)和VAL1C-R：5′-GCCggatccCTCGGCCCAGTTAAGGCCAGCT-3′(SEQ ID NO.8)为引物，扩增野生型基因LOC_Os08g09210的7198bp DNA片段，扩增产物经纯化后分别用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，然后连入pCAMBIA1301载体(BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买)，获得互补重组表达载体，将获得的互补重组表达载体pCAMBIA1301-LOC_Os08g09210转化val1突变体，获得转基因植株，然后观察转基因植株的叶片性状，结果如图2中所示。结果显示，转基因植株的叶片颜色表现为正常绿色(图2中的B)，且叶绿素、类胡萝卜素及光合速率和野生型类似(图2中的C、E-H)。此外，透射电镜显示，互补植株叶片叶绿体超微结构与野生型相似，具有发育良好的片层结构、正常的类囊体膜及堆积的基粒(图2中的B)。此外，构建了VAL1基因的RNAi干涉载体并转化野生型缙恢10号。具体方法为：分别以VAL1RiF1：5′-gccggatccGAATCCGATCTAGCACAGGTTCTGAT-3′(SEQ ID NO.9)与VAL1RiR1，5′-gccggtaccGCCAGTCAACAACATCTACTGCATCAT-3′(SEQ ID NO.10)和VAL1RiF2：5′-gccgagctcGAATCCGATCTAGCACAGGTTCTGAT-3′(SEQ ID NO.11)和VAL1RiR2：5′-gccactagtGCCAGTCAACAACATCTACTGCATCAT-3′(SEQ ID NO.12)为引物，扩增野生型缙恢10号cDNA，扩增产物经纯化后分别用KpnⅠ和BamHⅠ与SacⅠ和SpeⅠ酶切，然后先后连入pTCK303载体(BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买)，获得RNAi重组表达载体，命名为PTCK303-VAL1Ri。将获得的RNAi重组表达载体PTCK303-VAL1Ri转化野生型缙恢10号，获得转基因植株，然后观察转基因植株的叶片性状，结果如图2中所示。结果显示，在转基因植株中，VAL1的转录水平显著降低(图2中的D)，且出现和val1相似的白化转绿表型(图2中的B)。与野生型相比，转基因植株叶片叶绿素、类胡萝卜素含量及光合速率显著减少(图2中的C、E-H)。透射电镜显示，转基因植株叶片叶肉细胞几乎是中空的，缺乏完整的细胞器，叶绿体完全降解，与突变体val1相似(图2中的B)。综上所述，以上结果证明了LOC_Os08g09210就是VAL1基因。

实施例3、VAL1的表达模式和VAL1蛋白的亚细胞定位

为了确定VAL1的表达模式，利用表2的引物进行实时荧光定量分析。以Actin为内参，反应体系为：在25μL的反应体系中加入2μL的cDNA模板，2μL引物，12.5μL SYBR Green荧光染料和8.5μL RNase-free H₂O，在Bio-rad荧光定量PCR仪上进行荧光定量扩增；扩增条件为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸1分钟，40个循环；最后72℃延伸10分钟，然后利用CFX-Manager软件进行数据的收集与处理，结果如图3所示。由图3可知，VAL1在各组织均表达，包括根、茎、叶、鞘、穗，且在叶片中表达最高(图3中的A)。此外，我们详细分析了VAL1在叶片各部位的表达模式，结果显示VAL1在SB、L4、L2、L3L和L3U中均表达，且在L3L中表达水平最高(图3中的C)。

为了更详细的分析VAL1的表达模式，通过原位杂交检测了VAL1的表达模式(图3中的D)。具体方法为：以VAL1-F：5′-CGATGCCGTTATCGCGTTCT-3′(SEQ ID NO.13)和VAL1SP6-R：5′-agatttaggtgacactatagCTTCAAATGCCTCATCCAAAGTC-3′(SEQ ID NO.14)为引物，扩增VAL1基因CDS上一段保守片段，经体外转录合成原位杂交所需探针，经过杂交后，结果表明，VAL1在SAM中强烈表达(图3中的D1)；随后在P2原基中分散表达(图3中的D2)；在P3原基中，VAL1集中在P3原基的边缘和原形成层细胞中表达(图3中的D2)；在P4原基中，VAL1主要集中在维管束表达(图3中的D3、D4)。

表2、引物序列

引物	正向序列(5′→3′)	反向序列(5′→3′)
			Actin	tgctatgtacgtcgccatccag(SEQ ID NO.15)	aatgagtaaccacgctccgtca(SEQ ID NO.16)
VAL1	cctgcaccaatagtgacagaagagct(SEQ ID NO.17)	cgcatcataagaacctggcattct(SEQ ID NO.18)

为了确定VAL1蛋白的定位，利用水稻原生质体瞬时表达系统来研究VAL1蛋白的定位。具体方法为：以VAL1pAN-F：5′-gccactagtatggcgtctgctgctgccgct-3′(SEQ ID NO.19)和VAL1pAN-R：5′-gccggatccgtaattggccacttgcttgtgcttcagtg-3′(SEQ ID NO.20)为引物，扩增野生型基因LOC_Os08g09210的CDS片段，扩增产物经纯化后分别用SpeⅠ和BamHⅠ酶切，并连接到了35S-GFP-NOS(pA7)表达载体(BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买)中，构建GFP-VAL1融合表达蛋白。然后将GFP和GFP-VAL1的质粒转入水稻原生质体中，28℃过夜孵化，用奥林巴斯激光扫描共焦显微镜来观察GFP的荧光。

GFP-VAL1融合蛋白和单独GFP蛋白在水稻原生质体中瞬时表达后，表达GFP-VAL1融合蛋白的细胞在叶绿体检测到绿色荧光，表达GFP蛋白的细胞在整个细胞中均检测到绿色荧光。此结果暗示VAL1定位于叶绿体(图3中的E)。

实施例4、VAL1编码蛋白的序列和生物信息学分析

蛋白序列在PHYTOZOME网站通过BLAST获得，使用10^-5阈值(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！search？show＝BLAST)。利用MEGA 5.0进行进化分析。进化树的构建使用最大似然法，采用Jones–Taylor–Thornton matrix-basedmodel，Bootstrap值为500次重复。

VAL1蛋白被预测为磷酸核糖胺-甘氨酸连接酶(PurD)，属于ATP-grasp超家族。将VAL1氨基酸序列和其它磷酸核糖胺-甘氨酸连接酶家族成员的氨基酸序列比对，发现VAL1序列高度保守。蛋白结构用PSIPRED进行预测(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)。VAL1包含三个保守结构域，命名为GARS_N,GARS_A,GRAS_C，其中GARS_A结构域含有ATP结合位点。此外，用ChloroP(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)进行预测，VAL1在N末端含有叶绿体转运肽(氨基酸残基1-68)(图4)。

进化树分析表明，VAL1广泛存在于光合生物中(图5)，包括低等藻类、陆生蕨类植物、裸子植物和被子植物，并且它表现出高度的同源性，这表明水稻中的VAL1可能来源于藻类。此外，水稻基因组含有一个VAL1的同源基因LOC_Os12g09540，后者也被预测为一个磷酸核糖胺-甘氨酸连接酶，但LOC_Os12g09540和VAL1不属于相同的进化谱系，这表明两者的分子功能可能存在一定程度的差异。

实施例5、VAL1参考嘌呤从头生物合成途径

为了验证VAL1参与参考嘌呤的从头合成途径，本研究检测了野生型和突变体幼苗中嘌呤从头合成途径产物AMP和GMG的含量，具体方法为：称取约0.1g样本，放入研钵中磨碎，利用三氯乙酸萃取核苷酸，利用Rigol L3000高效液相色谱仪，Kromasil C18反相色谱柱(250mm*4.6mm,5μm)，检测254nm波长处的吸收峰，结果显示，相较于野生型，突变体中AMP和GMG的含量均低于野生型(图6中的A)。

随后，本研究分析了外施不同浓度的ANP和GMP后，野生型和突变体植株的表型。具体方法为：将野生型和突变体种子表面消毒后，置于加入不同浓度的AMP、GMP和AMP与GMP的混合物的MS培养基中培养，待培养7-10天后，观察植株表型并检测色素含量。结果显示，外施AMP、GMP和AMP与GMP的混合物后，可部分恢复VAL1突变体叶片的绿色表型(图6中的B)。在野生型中，低浓度(1和5mM)AMP、GMP和AMP、GMP可促进叶片中的叶绿素积累，而高浓度(10mM)则抑制叶绿素积累，并抑制植株的生长(图6中的C)。在突变体val1中，随着AMP、GMP和AMP、GMP浓度升高，叶绿素含量升高(图6中的C)。因此，外源使用AMP、GMP和AMP、GMP可部分恢复val1突变体叶片表型。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 水稻白化转绿叶基因VAL1及其编码的蛋白和应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3992

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcgctgctt tactccccca tcaacgccgc tcgctcacta ctcgcgccgc cgcttccgcc 60

gccgctccgc tccagtcgcg tcggcttccc gcctcctcgc cggcgagccg tgcctcgacg 120

ctctccctct gttgctccgc cggccagcag catgccgcgc ttctgctccc actagctccc 180

gccaccgccg cccctactga gcccggtgag accgtgaggc ggtggtgtgc accagtccgg 240

cagttcgccc ccctcctcct cccaatccgg ccgccgcttc atcaccgccg gcgaggctcc 300

gcgtctcctc ctaggtcgcg ctgcttcgta tcacagagag aggtgagccc cttgcaactt 360

gttgccagag ttgccagaaa caaaaaagat cgatgttctt ggactgaatc gattgtttct 420

tggtaggcca gctcggtctc cggataagca agaaccatgg cgtctgctgc tgccgcttac 480

ggcgtcgggg ctccactcaa gctcgctgca aggcggcatg gggcactcgc gctggccggt 540

agccatcgct gcagtggatg gaagtcttca gtgtcttgcc ctgttcctca ggcttggatg 600

ggcagttgct cttctgtcgc aatgcgccgt gtcgcctccg gttctcgatt gattgttcag 660

gcttcaaaca gcgggggctc aagcttgaag gcatcattgg ctgatgctag cctgcttact 720

ggtaaagtag tattagatta gctcagctta ttttgttctt tcttcaggtg gtttatgttt 780

atggaaaaga aaaatccaaa gtcccaatgc gctatgagat gaaactttgt cgttgagtta 840

gtcgagagaa cttgttatta gatgcaaagt ctggggcaat ggtttaattt cctgtttcct 900

gtttcatttc agaagagagg ataactgttt tggtgattgg aggtggagga agggagcacg 960

ctctctgtta cgccttgaat cgctctccgt cttgtgatgc ggtcctatgt gcccctggga 1020

acgcaggtat tgctcagtct ggagatgcga cctgtatatc ggacttagac gtctccgata 1080

gcgatgccgt tatcgcgttc tgctgcaaga ggggagtggg aatggttgta gtaggtcctg 1140

aagctcctct tgttgccggt cttgtgaatg accttgtgaa agctgagata ccagcatttg 1200

gtccttcctc agaagctgcg gctttagaag gatcgaagga ctttatgaag aaattatgcg 1260

ataagtacaa tattcctaca gctaaggtac cttcttttta cattagtttt cagccctata 1320

agtttaatct ttctgggaca atgaacattt gctccaatga gagtacgggg tgcctaaatt 1380

tggttgatgt gatatccatg tttaagaaag aaccaaagat gcatcatttc aggcataatc 1440

acactgatat ttcctttgta ttgttacaag gttgctaacc aagttcatat ttgacttgct 1500

tgatagtata tcagttatag acaatataag taatcatctc agagttaatg atatatcttc 1560

agctttctag gtgaactgta cttaagcatt gcccatatgt cctgaaattt cccttgggat 1620

tgcctgagtt ttgaaataaa gtcattgtgt tgtactgtaa acgttctaga aaagataggg 1680

aaaaacagag ctcctctaca taagtctata tgtataattt gagatgttaa taataatggt 1740

aacataagtg cttatatttc ttttatagta tcgcacattc acagatcctg cagaagctaa 1800

acaatatgtc aaagatcaag gcgcccctat tgttgtcaaa gctgatggat tggcagctgg 1860

aaaaggcgtg gttgttgcta tgactttgga tgaggcattt gaagccatag actctatgct 1920

ggttcaaggg tcatttggtt ctgctggttc acgggttatc attgaagaat atctggaggg 1980

tgaagaagcc tctttctttg cattagtgga tggtgaaaat gcattgccac ttgaatcggc 2040

acaagatcac aaaagggttg gtgatggtga tgtaggccca aatactggtg gtatgggtgc 2100

atattcccct gcaccaatag tgacagaaga gcttaagcac acaattatgg atagtataat 2160

aatcccaaca gttcaaggta tggcagctga aggatgcaag tttgttggtg tattatatgc 2220

tggacttatg attgagaaga aatctggtct gcctaagctt atcgagtaca acgtacgatt 2280

cggtgaccca gaatgccagg ttagtgattc tctatctata aactctaacc ttcaatgatg 2340

cactatctat taggaaacta tgtatatcta ttataattta gattttggtt tatctgatca 2400

tgctttggcc aaggtgttct tgttggacat tatagtaaaa caaaattgca tgactatttt 2460

ggattctggt tcctctgatc acactatggc taagatgttc ttgttggaca atagaatgaa 2520

acaaacatgc gtgtcttatc atcagaattt ttctcgttct acagttttga caccctggtc 2580

tgcatctagc aggtcaaact ctacaggggg tctagtaaga agctgagtag atttcattcc 2640

tgtagtgcaa tgagtggtgc atttttgtgt cattttagtg atggtcaaat ttcaaatttt 2700

atctactttt gcatatttgt tagtgatggc caaccgtttg atgtatgaaa ttttcgaatt 2760

tataccagtg cagattaaac aattctgact ggctactaaa atgtttatct ttgaagtaaa 2820

attgctttta gagtatagac ttttaaaatt atgcatatta ttggcaaata acaaaggcaa 2880

aatgttaaaa tcatgaagat tgtcaattga aaaggtatat tatattttta tggccagagg 2940

tagtagttgt ttatctcagc ctgaattgtt catccagcat ctggcccaat tatccaagat 3000

tcccttgtgg gctgcatttt catgaataga ttgatagtcc tgtggcatat tcgttctgct 3060

tgtctggtac gtatcccaac tatagatttt ccagataaga tcgggttttt gttcttttgc 3120

tgctaagcaa tctagttgaa ctgttcacta tttttaccat caaatttcga ttatactttt 3180

ctctactgat atatacttct tttttgcacc tcaggttctt atgatgcgat tagaatccga 3240

tctagcacag gttctgatgt ctgcgtgcag aggggaactg ggcgatgttt cactaacctg 3300

gtcacctgaa atggcaatgg tggttgtgat ggcaagcgaa ggataccccg gatcttataa 3360

gaaggggact gtaataagaa atctcgagaa ggccgagcag gtctcgcccg cggtaaaaat 3420

attccatgct ggaacagcac tggatgggga tggaaatctt gtcgctgtcg gaggccgggt 3480

gctcgggatc acggctaagg gcaaagacat tgaggaagca cgggcaagag catatgatgc 3540

agtagatgtt gttgactggc ctgaaggatt cttcaggcgc gatattggtt ggagagcact 3600

gaagcacaag caagtggcca attactgatg cggattttcc tgagcacacc acaactatgg 3660

tgagcatgta atgttaagag caataaagag aaaatttgtc acttctgtgg ttgaggaaag 3720

gcaaaaccat agctcaaatt tgagtttttt tttttgtacc aactgttaaa tttgagttgg 3780

gcttgcattt tgaggaacag ccagatgaac aatgaccgag ttttgacttc cacaagtaga 3840

gagagagcat tgttcggtgc ttaatatcta cttccgttgg ttagtggtat taagggattc 3900

catatgtaag tcgttttaga cttgtgcaca agaattaaga taacaatctc aatgattttg 3960

ttacccttca tttaaactac atcagaaaaa ga 3992

<210> 2

<211> 527

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Ser Ala Ala Ala Ala Tyr Gly Val Gly Ala Pro Leu Lys Leu

1 5 10 15

Ala Ala Arg Arg His Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Ser His Arg Cys

20 25 30

Ser Gly Trp Lys Ser Ser Val Ser Cys Pro Val Pro Gln Ala Trp Met

35 40 45

Gly Ser Cys Ser Ser Val Ala Met Arg Arg Val Ala Ser Gly Ser Arg

50 55 60

Leu Ile Val Gln Ala Ser Asn Ser Gly Gly Ser Ser Leu Lys Ala Ser

65 70 75 80

Leu Ala Asp Ala Ser Leu Leu Thr Glu Glu Arg Ile Thr Val Leu Val

85 90 95

Ile Gly Gly Gly Gly Arg Glu His Ala Leu Cys Tyr Ala Leu Asn Arg

100 105 110

Ser Pro Ser Cys Asp Ala Val Leu Cys Ala Pro Gly Asn Ala Gly Ile

115 120 125

Ala Gln Ser Gly Asp Ala Thr Cys Ile Ser Asp Leu Asp Val Ser Asp

130 135 140

Ser Asp Ala Val Ile Ala Phe Cys Cys Lys Arg Gly Val Gly Met Val

145 150 155 160

Val Val Gly Pro Glu Ala Pro Leu Val Ala Gly Leu Val Asn Asp Leu

165 170 175

Val Lys Ala Glu Ile Pro Ala Phe Gly Pro Ser Ser Glu Ala Ala Ala

180 185 190

Leu Glu Gly Ser Lys Asp Phe Met Lys Lys Leu Cys Asp Lys Tyr Asn

195 200 205

Ile Pro Thr Ala Lys Tyr Arg Thr Phe Thr Asp Pro Ala Glu Ala Lys

210 215 220

Gln Tyr Val Lys Asp Gln Gly Ala Pro Ile Val Val Lys Ala Asp Gly

225 230 235 240

Leu Ala Ala Gly Lys Gly Val Val Val Ala Met Thr Leu Asp Glu Ala

245 250 255

Phe Glu Ala Ile Asp Ser Met Leu Val Gln Gly Ser Phe Gly Ser Ala

260 265 270

Gly Ser Arg Val Ile Ile Glu Glu Tyr Leu Glu Gly Glu Glu Ala Ser

275 280 285

Phe Phe Ala Leu Val Asp Gly Glu Asn Ala Leu Pro Leu Glu Ser Ala

290 295 300

Gln Asp His Lys Arg Val Gly Asp Gly Asp Val Gly Pro Asn Thr Gly

305 310 315 320

Gly Met Gly Ala Tyr Ser Pro Ala Pro Ile Val Thr Glu Glu Leu Lys

325 330 335

His Thr Ile Met Asp Ser Ile Ile Ile Pro Thr Val Gln Gly Met Ala

340 345 350

Ala Glu Gly Cys Lys Phe Val Gly Val Leu Tyr Ala Gly Leu Met Ile

355 360 365

Glu Lys Lys Ser Gly Leu Pro Lys Leu Ile Glu Tyr Asn Val Arg Phe

370 375 380

Gly Asp Pro Glu Cys Gln Val Leu Met Met Arg Leu Glu Ser Asp Leu

385 390 395 400

Ala Gln Val Leu Met Ser Ala Cys Arg Gly Glu Leu Gly Asp Val Ser

405 410 415

Leu Thr Trp Ser Pro Glu Met Ala Met Val Val Val Met Ala Ser Glu

420 425 430

Gly Tyr Pro Gly Ser Tyr Lys Lys Gly Thr Val Ile Arg Asn Leu Glu

435 440 445

Lys Ala Glu Gln Val Ser Pro Ala Val Lys Ile Phe His Ala Gly Thr

450 455 460

Ala Leu Asp Gly Asp Gly Asn Leu Val Ala Val Gly Gly Arg Val Leu

465 470 475 480

Gly Ile Thr Ala Lys Gly Lys Asp Ile Glu Glu Ala Arg Ala Arg Ala

485 490 495

Tyr Asp Ala Val Asp Val Val Asp Trp Pro Glu Gly Phe Phe Arg Arg

500 505 510

Asp Ile Gly Trp Arg Ala Leu Lys His Lys Gln Val Ala Asn Tyr

515 520 525

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attgctaaag atgatttgga acta 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gggacctaga aacatcatct cc 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgccagcaat gtaggtttat 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catgcttgct aaacagatac agac 24

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gccgaattcg ttgggttcaa atcccacctt tct 33

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gccggatccc tcggcccagt taaggccagc t 31

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gccggatccg aatccgatct agcacaggtt ctgat 35

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gccggtaccg ccagtcaaca acatctactg catcat 36

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gccgagctcg aatccgatct agcacaggtt ctgat 35

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gccactagtg ccagtcaaca acatctactg catcat 36

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgatgccgtt atcgcgttct 20

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agatttaggt gacactatag cttcaaatgc ctcatccaaa gtc 43

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgctatgtac gtcgccatcc ag 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aatgagtaac cacgctccgt ca 22

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cctgcaccaa tagtgacaga agagct 26

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cgcatcataa gaacctggca ttct 24

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gccactagta tggcgtctgc tgctgccgct 30

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gccggatccg taattggcca cttgcttgtg cttcagtg 38

Claims (4)

1.水稻白化转绿叶基因VAL1，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述水稻白化转绿叶基因VAL1编码的蛋白质，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述水稻白化转绿叶基因VAL1在水稻叶色性状的分子育种中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述水稻品种为缙恢10号。