CN108892716A

CN108892716A - 屋尘螨变应原Der p 29及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN108892716A
Application number: CN201810602155.0A
Authority: CN
Inventors: 刘志刚; 刘晓宇; 肖小军
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-06-12
Filing date: 2018-06-12
Publication date: 2018-11-27
Anticipated expiration: 2038-06-12
Also published as: CN108892716B

Abstract

本发明提供了一种屋尘螨变应原Der p 29，所述屋尘螨变应原Der p 29包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少95％同源性的氨基酸序列中的至少一种，屋尘螨变应原Der p 29在尘螨变应原疫苗以及预防、诊断和治疗尘螨引起的过敏性疾病，尤其是屋尘螨第29组分引起的过敏性疾病的药物中具有广泛的应用前景。本发明通过基因克隆、蛋白表达和纯化，得到重组的屋尘螨变应原Der p 29，蛋白纯度高、产量丰富，有利于后续科研使用和大量制备应用，尤其在尘螨变应原疫苗以及制备预防、诊断和治疗尘螨引起的过敏性疾病的药物中的应用。

Description

屋尘螨变应原Der p 29及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，特别涉及屋尘螨变应原Der p 29及其制备方法和应用。

背景技术

变态反应疾病(过敏性疾病)被世界卫生组织认为是当前世界性的重大卫生学问题，世界各国变态反应性疾病的总发病率高达10-30％。近些年来其发病率在逐步增高。在引起过敏性疾病众多吸入性变应原中，尘螨是导致变态反应性疾病的最重要因素。目前发现粉尘螨(Der-matophagoides farinae，Der f)、屋尘螨(Dermato-phayoidespteronyssinus，Der p)是世界范围内广泛分布的室内优势致敏螨类。

由于尘螨系医学节肢动物，结构和成分复杂，尽管人们从数百种蛋白中已初步鉴定出数种过敏原成分，而研究显示尘螨还含有其他多种过敏原成分；且这些过敏原成分对于研究尘螨过敏之免疫发病机制，以及研发用以诊断及治疗尘螨过敏的试剂具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了屋尘螨变应原Der p 29，通过基因克隆、蛋白表达和纯化，得到重组的屋尘螨变应原Der p 29，屋尘螨变应原Der p 29在尘螨变应原疫苗以及预防、诊断和治疗尘螨引起的过敏性疾病，尤其涉及屋尘螨第29组分引起的过敏性疾病的药物中具有广泛的应用前景。

第一方面，本发明提供了一种屋尘螨变应原Der p 29，所述屋尘螨变应原Der p29包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少95％同源性的氨基酸序列中的至少一种。

在本发明中，所述屋尘螨变应原Der p 29为屋尘螨变应原第29组分。

在本发明中，术语“同源性”表明任何两个(或两个以上)肽、多肽或蛋白质序列具有一定程度上(“％同源”)与彼此“相同”的氨基酸序列。这种同源性程度可以使用已知的计算机程序来确定。具体的，可以但不限于NCBI数据库中的BLAST工具可被用于确定同源性。在本发明中，所述同源性至少为95％。进一步可选的，所述同源性至少为96％、97％、98％或99％。

可选的，所述屋尘螨变应原Der p 29还包括与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有免疫交叉反应性的屋尘螨变应原。如本发明所述的，术语“免疫交叉反应性”为行业内常规理解，当一种抗体可以与分子结构并不完全相同但具有类似抗原决定簇的不同抗原起反应，称为免疫交叉反应；不同抗原之间具有免疫交叉反应性。

可选的，所述屋尘螨变应原Der p 29的编码基因包括编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

进一步可选的，所述屋尘螨变应原Der p 29的编码基因包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

可选的，所述屋尘螨变应原Der p 29的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:2具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:1。

本发明第一方面提供的屋尘螨变应原Der p 29在尘螨变应原疫苗以及预防、诊断和治疗尘螨引起的过敏性疾病的药物中具有广泛的应用前景。

第二方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体包括如第一方面所述的屋尘螨变应原Der p 29的编码基因。

可选的，所述重组载体包括重组表达载体和重组克隆载体中的至少一种。进一步可选的，所述重组载体中含有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，具体的，所述屋尘螨变应原Der p 29的编码基因插入至BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间。可选的，所述屋尘螨变应原Der p 29的编码基因插入到载体时，所述屋尘螨变应原Der p 29的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)，3’端可加入终止密码子(如TAA)。

可选的，所述重组载体中含有纯化标签，具体的可以但不限于为His标签、GST标签、SUMO标签。

可选的，所述重组载体可以但不限于为pET-32a、pGEX-6P-1、pPIC-9K、pPIC-Zα中的至少一种。

第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如第二方面所述的重组载体。

可选的，所述宿主细胞包括克隆宿主细胞和表达宿主细胞中的至少一种。具体的，所述宿主细胞可以但不限于为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、动物细胞、植物细胞。具体的，可以但不限于为大肠杆菌DH5α、大肠杆菌Top10、大肠杆菌Orgami(DE3)、毕赤酵母GS115、毕赤酵母SMD1168。

第四方面，本发明提供了一种屋尘螨变应原Der p 29的制备方法，包括：

(1)制备并获得屋尘螨变应原Der p 29的编码基因，所述屋尘螨变应原Der p 29的编码基因包括编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)将所述屋尘螨变应原Der p 29的编码基因插入到表达载体中，得到重组质粒；

(3)将所述重组质粒转至表达宿主细胞中，进行蛋白质表达和纯化，获得屋尘螨变应原Der p 29。

可选的，所述制备并获得屋尘螨变应原Der p 29的编码基因包括：提取屋尘螨总蛋白，分离并鉴定得到所述屋尘螨变应原Der p 29，通过PCR扩增得到所述屋尘螨变应原Der p 29的编码基因。

可选的，如第四方面所述的宿主细胞为表达宿主细胞时，所述制备屋尘螨变应原Der p 29的方法，还可以为：培养如第五方面所述的宿主细胞，经过蛋白质的表达和纯化，得到所述屋尘螨变应原Der p 29。具体的，可以但不限于当所述宿主细胞为大肠杆菌表达宿主细胞时，将所述大肠杆菌在LB培养基中培养，并在培养过程中加入异丙基硫代半乳糖苷进行屋尘螨变应原Der p 29诱导表达，经离心、裂解、溶菌、超声后，经过镍柱进行分离纯化，得到屋尘螨变应原Der p 29。

本发明第四方面提供的屋尘螨变应原Der p 29的制备方法操作简单，易于实现，成本低，可用于大规模工业化生产；与天然屋尘螨变应原相比，该制备方法制得的屋尘螨变应原Der p 29纯度高、产量好，生物活性强，同时不易受到外源性有毒物质的污染，稳定性好，可用于研究尘螨过敏之免疫发病机制，特别是屋尘螨变应原第29组分引起的过敏反应；在尘螨变应原疫苗以及研发用以诊断及治疗尘螨过敏的药物具有重要意义。

第五方面，本发明提供了一种组合物，包括如第一方面所述的或如第四方面所述的制备方法制得的屋尘螨变应原Der p 29。

可选的，所述组合物还包括药学上可接受的载体。进一步可选的，所述药学上可接受的载体包括溶剂、聚合物和脂质体中的至少一种，但不限于此。更进一步可选的，所述溶剂包括但不限于水、生理盐水，以及其他非水性溶剂。具体的，所述聚合物可以但不限于为聚赖氨酸、聚乙烯亚胺及其改性物、壳聚糖、聚乳酸、明胶、环糊精。具体的，所述脂质体可以但不限于为胆固醇、豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂。更进一步可选的，所述药学上可接受的载体还包括稀释剂和赋形剂中的一种或多种。可选的，所述稀释剂包括淀粉类、糖类、纤维素类和无机盐中的一种或多种。所述赋形剂包括片剂中的黏合剂、填充剂、润滑剂，半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分，液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、着色剂中的至少一种。

在本发明中，所述组合物还可以包括其他活性成分，所述活性成分根据所述组合物的用途进行选择，在此不作限定。

第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述的屋尘螨变应原Der p 29、如第二方面所述的重组载体、如第三方面所述的宿主细胞、如第四方面所述的制备方法制得的屋尘螨变应原Der p 29、或如第五方面所述的组合物在尘螨变应原疫苗以及预防、诊断和治疗尘螨引起的过敏性疾病的药物中的应用。

尤其是在预防、诊断和治疗屋尘螨第29组分引起的过敏性疾病的药物中的应用。进一步可选的，在预防、诊断和治疗过敏性哮喘、鼻炎、慢性荨麻疹的药物中的应用。

可选的，所述药物为化学类药物和生物药物中的至少一种。进一步可选的，所述生物药物为多肽类药物、蛋白药物和基因药物中的一种或多种。

可选的，所述药物还包括其他药学上可接受的预防、诊断和治疗尘螨引起的过敏性疾病的活性成分。

可选的，所述药物的形式包括片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、溶液剂或混悬剂。

所述应用具体可以但不限于为：提供一种试剂盒，所述试剂盒中包括了如第一方面所述的屋尘螨变应原Der p 29、如第二方面所述的重组载体、如第三方面所述的宿主细胞、或如第四方面所述的组合物。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次发现并得到屋尘螨变应原Der p 29，丰富了尘螨变应原组分，在尘螨变应原疫苗以及预防、诊断和治疗尘螨引起的过敏性疾病，特别是屋尘螨第29组分引起的过敏性疾病的药物中具有广泛的应用前景；

(2)本发明通过基因克隆、蛋白表达和纯化，得到重组的屋尘螨变应原Der p 29，蛋白纯度高、产量丰富，稳定性高，有利于后续大量制备和研究使用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1提供的重组质粒pET-32a-Der p 29双酶切图；

图2是本发明实施例1提供的Der p 29蛋白胶图，其中图2中(a)为Der p29未经纯化的蛋白胶图，图2中(b)为纯化后的Der p 29蛋白胶图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明实施例中，所述“尘螨变应原Der p 29”、所述“屋尘螨变应原Der p 29”与所述“Der p 29”可以互换。

实施例一屋尘螨变应原Der p 29的制备

1、重组载体构建

提取屋尘螨总蛋白，分离并鉴定得到屋尘螨变应原Der p 29，通过PCR获取屋尘螨变应原Der p 29的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示，有744个碱基组成(含终止密码子)，其编码248个氨基酸序列(含终止密码子)，并经过信息学分析推辞其蛋白的相对分子质量为45kD，等电点为5.11。

经过基因合成技术将屋尘螨变应原Der p 29的核苷酸序列的N端添加BamHⅠ酶切位点及其保护碱基，在C端添加XhoⅠ酶切位点及其保护碱基，对其进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，同时对pET-32a进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，两者的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，序列大小正确后进行回收，并将两者的双酶切产物混合在一起并加入T4DNA Ligase(连接酶)，16℃下进行连接反应16h，得到重组质粒pET-32a-Der p 29，然后转化至大肠杆菌Top10中，将菌液涂布至含氨苄的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落，提取质粒后再进行双酶切和测序验证，其中双酶切结果如图1所示，其中M表示蛋白质分子量标准(marker)，1泳道表示双酶切图，在744bp左右有目的基体条带，与Der p29理论分子量相符，同时测序结果表明目的基因插入正确。

2、Der p 29的表达和纯化

将测序正确的pET-32a-Der p 29转化至经氯化钙感受态处理的Orgami表达菌，经氨苄平板筛选，挑取阳性菌落过夜培养。二次摇菌后，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，37℃、200转/min诱导4h后收集菌体，超声破碎分别取上清和沉淀进行12％SDS-PAGE分析，以确定蛋白可溶性。再用FPLC进行Ni²⁺亲和层析纯化，包括用平衡液充分洗柱，再分别用含40mmol/L、300mmol/L咪唑平衡缓冲液进行洗脱，收集各次洗脱液进行SDS-PAGE分析，获得Der p 29。结果如图2所示，其中图2中(a)中M表示蛋白质分子量标准(marker)，1泳道表示诱导前培养基中的蛋白分布，2泳道表示诱导后培养基中的蛋白分布，3泳道表示上清中的蛋白分布，4泳道表示沉淀中的蛋白分布，可以看出Der p 29成功诱导表达。再经过Ni²⁺亲和层析纯化后，如图2中(b)所示，其中M表示蛋白质分子量标准(marker)，1泳道表示纯化后的Der p 29蛋白图，Der p 29蛋白大小为45kD，与预测结果相符，且为不可溶蛋白。

效果实施例1过敏原性检测(ELISA)

在96孔板中每孔包被Der p 29 100μL(1μg/mL)，3％BSA 4℃封闭过夜。以屋尘螨过敏患者的血清(1:50的比例稀释)为一抗，对照组中一抗为正常人血清(4份)，37℃孵育2h。之后每孔加入100μL生物素标记的抗人IgE(1:2000比例稀释)，37℃孵育2h。清洗5次，每孔加入100μL HRP标记的链霉亲和素(1:5000比例稀释)，37℃孵育1h。显色后37℃孵育10min，然后用2mol/L的浓硫酸终止反应。用自动酶标仪检测其在450nm处的吸光度，分析数据，患者血清IgE检测的吸光值高于正常人血清IgE检测的吸光值的2.5倍为阳性，并以正常人血清作为对照，结果发现Der p 29具有过敏源性。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 刘志刚

<120> 屋尘螨变应原Der p 29及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asn Asp Ser Glu Ile Phe Gly Arg Thr Ile Arg Val Asn Leu Ala

1 5 10 15

Lys Pro Val Lys Leu Arg Glu Ala Ser Gln Lys Ala Val Trp Ala Asp

20 25 30

Asp Glu Trp Leu Ala Lys His Ala Gly Lys Thr Leu Asp Ser Gln Phe

35 40 45

Ser Ile Asp Lys Lys Glu Thr Leu Glu Pro Asn Glu Asp Asp Asp Asn

50 55 60

Asp Asp Gln Glu Lys Asp Thr Ala Asp Glu Ser Ala Gly Leu Ser Glu

65 70 75 80

Lys Met Gln Thr Asn Pro Gln Val Phe Phe Asp Ile Arg Val Asp Asn

85 90 95

Gln Tyr Cys Gly Arg Ile Val Ile Leu Leu Arg Lys Asp Val Val Pro

100 105 110

Lys Thr Thr Glu Asn Phe Arg Cys Leu Cys Thr His Glu Lys Gly Phe

115 120 125

Gly Phe Arg Gly Ser Ile Phe His Arg Ile Ile Pro Gly Phe Met Ile

130 135 140

Gln Gly Gly Asp Phe Thr Asn His Asn Gly Thr Gly Gly Lys Ser Ile

145 150 155 160

Tyr Gly Arg Lys Phe Glu Asp Glu Asn Phe Gln Leu Lys His Thr Gly

165 170 175

Ala Gly Thr Leu Ser Met Ala Asn Ser Gly Pro Asn Thr Asn Gly Ser

180 185 190

Gln Phe Phe Ile Thr Ala Ser Arg Thr Glu Trp Leu Asp Gly Lys His

195 200 205

Val Val Phe Gly Gln Val Met Gln Gly Met Asp Ile Val Arg Lys Ile

210 215 220

Glu Glu Cys Gly Ser Lys Ser Gly Lys Pro Asn Lys Arg Val Lys Ile

225 230 235 240

Ala Asn Cys Gly Glu Phe Val

245

<210> 2

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaacgata gcgaaatctt cggtcgtacc atccgtgtta acctggcgaa accggttaaa 60

ctgcgtgaag cgagccagaa agctgtttgg gcggatgatg aatggctggc gaaacacgcg 120

ggcaaaaccc tggatagcca gttctctatc gataaaaaag aaaccctgga accgaacgaa 180

gatgatgata acgatgatca ggaaaaagat accgcggatg aaagcgcagg cctgagcgaa 240

aaaatgcaga ccaacccgca ggttttcttc gatatccgtg ttgataacca gtactgcggc 300

cgtatcgtta tcctgctgcg taaagatgtt gttccgaaaa ccaccgaaaa cttccgttgc 360

ctgtgcaccc acgaaaaagg cttcggtttc cgtggtagca tcttccaccg tatcatcccg 420

ggcttcatga tccagggtgg tgatttcacc aaccacaacg gcaccggcgg taaaagcatc 480

tacggccgta aattcgaaga cgaaaacttc cagctgaaac acaccggtgc gggcaccctg 540

agcatggcga actctggccc gaacaccaac ggtagccagt tcttcatcac cgcgtctcgt 600

accgaatggc tggatggcaa acacgttgtt ttcggtcagg ttatgcaggg catggatatc 660

gtgcgtaaaa tcgaagaatg cggcagcaaa tctggtaaac cgaacaaacg tgtgaaaatc 720

gcgaactgcg gtgaattcgt ttaa 744

Claims

1.一种屋尘螨变应原Der p 29，其特征在于，所述屋尘螨变应原Der p 29包括如SEQID NO:1所示的氨基酸序列和与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少95％同源性的氨基酸序列中的至少一种。

2.如权利要求1所述的屋尘螨变应原Der p 29，其特征在于，所述屋尘螨变应原Der p29的编码基因包括编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的屋尘螨变应原Der p 29，其特征在于，所述屋尘螨变应原Der p29的编码基因包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括编码如权利要求1-3任一项所述的屋尘螨变应原Der p 29的编码基因。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求4所述的重组载体。

6.一种屋尘螨变应原Der p 29的制备方法，其特征在于，包括：

7.如权利要求6所述的屋尘螨变应原Der p 29的制备方法，其特征在于，所述制备并获得屋尘螨变应原Der p 29的编码基因包括：提取屋尘螨总蛋白，分离并鉴定得到屋尘螨变应原Der p 29，通过PCR扩增得到所述屋尘螨变应原Der p 29的编码基因。

8.一种组合物，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的或如权利要求6-7任一项所述的制备方法制得的屋尘螨变应原Der p 29。

9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括药学上可接受的载体。

10.如权利要求1-3任一项所述的屋尘螨变应原Der p 29、如权利要求4所述的重组载体、如权利要求5所述的宿主细胞、如权利要求6-7任一项所述的制备方法制得的屋尘螨变应原Der p 29、或如权利要求8-9任一项所述的组合物在尘螨变应原疫苗以及预防、诊断和治疗尘螨引起的过敏性疾病的药物中的应用。