CN108885189A - 通过微流体自由流电泳分离和分析样品 - Google Patents

通过微流体自由流电泳分离和分析样品 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种微流体装置(11)，用于分离和分析微流体样品。该装置包括：分离通道(10)；第一电解质通道(12)，被配置为在使用中提供高电导率电解质溶液的流，并且在该通道的下游出口处设置有正电极(13)；第二电解质通道(14)，被配置为在使用时提供高电导率电解质溶液的流，并且在该通道的下游出口处设置有负电极(15)；其中通过第一和第二电解质通道的电解质的流从装置中除去电泳产物和气泡；其中电解质的存在在分离通道上提供基本均匀的电场。

Description

通过微流体自由流电泳分离和分析样品
技术领域
本发明涉及在微流体装置中分离和分析带电粒子，特别是涉及使用自由流电泳(FFE)在微流体装置中分离和分析带电粒子。微流体自由流电泳是一种分离和分析带电粒子的有效方法，该方法有潜力处理小量样品体积，并具有高分离效率和良好控制的边界条件。
背景技术
自由流电泳的传统方法是将金属电极嵌入微流体装置中。然而，当使用这些方法时，在电极/液体界面处产生的电解产物极大地限制了装置的稳定性和敏感性。这种情况下主要的担忧是电极/液体界面处气泡的形成，这能改变液体流形态，从而导致样品中带电粒子的不稳定分离。
此外，微流体装置所需的流体体积处于微升级至纳升级。因此，即使处于能负载很大电流密度的导电缓冲液的相对较低的电场(如20V/cm)下，在数秒内产生的气泡的物理尺寸也可以很容易地超过微流体通道中的体积。
已提出几种方法来减小形成这些电解产物的影响，例如通过膜从物理上使分析腔室与电极床分离开。此外，通过使用氧化还原电子载体来抑制气泡的形成。
尽管减轻了对电解产物影响的担忧，这些方法中的很多方法却带来了不同的缺点，例如，复杂的制造方法或极大地限制可应用的电流/电场。此外，避免或驱替气泡并没有克服由局部pH变化(由溶解的电解产物或电流产生的焦耳热所引起)所产生的问题。
已使用外部电极以便于制造降低气泡引入到微流体芯片上的风险的微流体装置，尽管在微流体芯片上的进口和出口处同时设置外部电极，但仍能产生流过微流体装置的电解产物和热量。
AU 738361 B1公开了一种用于自由流电泳的装置，其中分离膜和限制膜置于一个盒子内，第一流动路径沿分离膜一侧，第二流动路径沿分离膜相反的一侧，限制膜用于隔开来自各流动路径的缓冲液流。图6示出了基本在通道全部长度上延伸的电极。
EP 1621211公开了一种细胞分离装置，该装置不会破坏细胞样品，且防止细胞分离时电压施加至其上的电极耗尽，且历经长时间的细胞分离也不会导致通道堵塞。这是使用含有电解质的凝胶电极实现的。
正是在这种背景下作出了本发明。
发明内容
根据本发明，提供了一种用于分离和分析微流体样品的微流体装置，该装置包括：分离通道；第一电解质通道，被配置为在使用中提供高电导率电解质溶液的流，并且在该通道的下游出口处设置有正电极；和第二电解质通道，被配置为在使用时提供高电导率电解质溶液的流，并在该通道的下游出口处设置有负电极；并且其中，通过第一和第二电解质通道的电解质的流从所述装置中除去电泳产物和气泡；并且其中，电解质的存在在分离通道上提供基本均匀的电场。
将正电极和负电极设置在第一和第二电解质通道的下游出口处可以是特别有利的，因为它提供了一种用于主动输运产物(诸如电解产物)的手段，伴随着局部pH变化和热量远离微流体装置，而它们中的任何一个都不直接进入微流体通道。这是通过高电导率电解质溶液的流实现的，并不能通过固定电极如凝胶电极实现。从微流体装置除去电解质产物可以在微流体装置内提供更稳定的流体流形态。
正电极和负电极可以仅位于相应通道的下游出口处。第一和第二电解质通道可以通过导电通道阵列连接至分离通道。导电通道阵列可以包括至少一个位于分离通道的入口附近的导电通道。提供分离通道入口附近的至少一个导电通道限定了电场的起点。启动尽可能接近通道入口的电场使给定长度的分离通道内的电场范围最大化，并且尽可能快地启动电场使不受电场影响的流体流最小化。这确保了其他机制(例如扩散)的影响是有限的。
导电通道阵列可包括至少一个位于通道出口附近的导电通道。提供至少一个通道出口附近的导电通道允许上一个导电通道上游的分离通道内的高导电率溶液的总流速较小，这减少了高导电率流体到达分离通道的距离。这增强了电场的均匀性并防止有效的分离通道宽度因液体电极到达通道的距离更远而缩减。此外，导电通道阵列可以基本与分离通道相毗连。
在一些实施方式中，导电通道阵列基本垂直于分离通道、第一电解质通道和第二电解质通道。
在一些实施方式中，导电通道阵列被配置为在分离通道、正电极和负电极之间提供电连接。流过导电通道的电解质可以占流过分离通道的总流体流量的0.1％至10％。流过导电通道的电解质的精确量将由电解质通道、分离通道和导电通道的电阻比决定。分离通道中的流量百分比应保持尽可能低，如果需要，将额外的电阻施加至分离通道和导电通道中。
此外，导电通道阵列还提供高的流体动力学阻力，以最小化通道之间的传质。
可以在第一电解质通道和第二电解质通道中提供电解质溶液。在一些实施方式中，电解质溶液是一种高电导率电解质溶液。电解质溶液可以适当地负载电流。提供高电导率的电解质溶液可以是有利的，因为它可以用于将正电极和负电极与分离通道进行电连接。
此外，使用高电导率溶液是特别有利的，因为与导电性较低的流体相比，它们通过电解质通道时可以产生非常小的电压降。优选地，电解质溶液是氯化钾。
在一些实施方式中，由施加在下游电极上的电压产生的电流可以与第一电解质通道中的电解质溶液的流基本相反的方向流动。
此外，使用窄的导电通道可允许强电场施加至分离通道而不会破坏在电极和电解质界面处形成的气泡或其他电解产物。这可以带来样品(例如流体流中的核酸、蛋白质和荧光粒子)大的、稳定的偏转(deflection)和高分离分辨率。
在另一个实施方式中，电解质溶液与分离介质形成界面，从而产生液体电极。分离介质可以是辅助流体，例如缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲液。
正电极和负电极可以是金属连接器，该金属连接器可以是中空的。使用中空金属连接器是特别有利的，因为它允许在常规微流体装置内直接集成大的有效电极表面区域。这可以极大地简化装置制造过程。
在一些实施方式中，分离通道可以具有多个出口。
在本发明的另一个方面，提供了一种从根据本发明前一方面的微流体装置中除去电解产物的方法。此外，热量也可以从该微流体装置中除去。除去电解产物和热量可以减少对微流体装置内流体流的任何干扰。
此外，根据本发明，提供了一种在根据本发明的微流体装置中分析样品但没有电解产物的方法；该方法包括以下步骤：使高电导率电解质溶液流过第一和第二电解质通道；使样品流过分离通道；拍摄分离通道的光学图像；以及分析分离通道的光学图像。光学图像可以是荧光图像。
此外，根据本发明，提供了一种在微流体装置中分离第一样品的方法，在微流体装置中分离通道具有多个出口，该方法包括以下步骤：使高电导率电解质溶液流过第一和第二电解质通道；使微流体样品流过分离通道；对来自分离通道的至少一个出口的流出物进行取样。
电解质溶液和微流体样品在分离通道内可以沿相同的方向流动。热量可以通过高电导率电解质溶液的流从微流体装置中除去。气泡可以通过高电导率电解质溶液的流从微流体装置中除去。电流可以被配置为以与第一电解质通道中的电解质溶液的流基本相反的方向流动。电解质溶液可以与分离介质形成界面，从而产生液体电极。
在一些实施方式中，电解质溶液可以是氯化钾。在一些实施方式中，分离介质可以是缓冲液介质。缓冲溶液可选自包括古氏缓冲液(Good’s buffer)、磷酸盐缓冲液、PBS、碳酸盐缓冲液和硼酸盐缓冲液的组。选择缓冲溶液以尽可能接近地匹配样品溶剂。这是为了确保样品在通过通道时移动到缓冲溶液中时不会产生不利反应。
附图说明
现在将通过仅为示例的方式，并参考附图进一步且更具体地描述本发明，其中：
图1示出了根据本发明的微流体装置的图(a)和(c)和示意图(b)和(d)；
图2示出了荧光素和罗丹明的微流体电泳图像；
图3示出了溶菌酶分子的微流体电泳；
图4和图5示出了电解质通道中电解质溶液的电流与所施加的电压之间的关系图(I-V曲线)；
图6和图7示出了分离通道中样品的分离；
图8提供了流出微流体装置的气泡的图像；
图9示出了用于循环高电导率溶液的解除耦联的(decoupled)、可连接的流量控制。
具体实施方式
本发明涉及在微流体装置中使用自由流电泳分离和分析微流体样品。
参考图1，提供了用于分离和分析微流体样品的微流体装置11，装置11包括分离通道10；第一电解质通道12，在该通道的下游出口处设置有正电极13；第二电解质通道14，在该通道的下游出口处设置有负电极15。第一电解质通道12和第二电解质通道14被配置为在分离通道10上提供均匀的电场。
如图1所示，样品的分离在分离通道10中进行。微流体样品可以是蛋白质、核酸或荧光粒子，如荧光素粒子和罗丹明粒子(图2和图5)。在一些情况下，样品可包含带电粒子。在一个实施例中，可以在微流体装置内施加电场来分离带电粒子。
图1中所示的分离通道10与导电通道阵列16连接，导电通道阵列16与电解质通道一起提供高电导率电解质溶液，以将电流从下游电极传输到分离通道。
导电通道阵列16可以在正电极13和负电极15之间与分离通道10建立电连接，同时还提供高流体动力学阻力，以最小化通道之间的传质。
为了产生窄束分析物，含有带相反电荷的粒子的微流体样品和缓冲液(通常为0.5mM～50mM磷酸盐缓冲液)分别通过第一入口通道18和第二入口通道19流入分离通道10。此外，电解质溶液流入第一电解质通道12和第二电解质通道14。优选地，电解质溶液是高电导率溶液。例如，电解质溶液可以是KCl溶液。高浓度的KCl溶液可以通过注射泵或通过加压流体贮存器流入电解质通道。
如本文所用，除非另有说明，术语“分析物”是指在分析或分离类的过程中感兴趣的物质的样品、组分或粒子。
如本文所用，除非另有说明，术语“分离通道”是指受电场作用的样品流体流过的任何通道。在一些实施方式中，分离通道有多个出口，并且在这些实施例中，该通道用于分离流体的不同组分，然后通过分离通道的不同出口移除这些组分。在一些实施方式中，分离通道仅用于分析目的，并且由施加电场所产生的流体的分离提供了样品的原位分析。提供一个或多个出口对于分析功能并非关键，因为分析是样品保留在分离通道中时进行的。
可以在电解质通道中确定流体的流速，例如电解质溶液的流速。电解质通道中的流速(通常为每小时几百微升)比分离通道中的流速高10％，从而与电解质通道末端的流体动力学阻力一起迫使KCl溶液流过导电通道，并在分离通道的边缘形成两薄片状的KCl流。
如图1所示，第一电解质通道12的下游出口处的正电极13和第二电解质通道14的下游出口处的负电极15连接至电压源20。优选地，正电极13和负电极15是金属连接器。金属连接器可以是中空的。
在向金属连接器13、15施加电压时，高电导率的KCl溶液传输电流并因此将电场(通常是均匀的电场)以与正电极侧的电解质流相反的方向施加至分离通道。
同时，在金属连接器和KCl溶液的界面处形成的气泡以及热量和电解产物直接从微流体装置输送出并且将直接从该装置中排出而不与分离通道接触并且不会扰乱各流体流。如图8所示，可以使用直径约1mm至5mm的管将气泡25、电解产物和热量(例如焦耳热)输送出该装置。产生的每个气泡可以与微流体通道中的所有流体有大约相同的体积。
高电导率电解质溶液可以与分离介质形成稳定的界面，因此有效地用作负载电流的液体电极。然而，由于离子穿过该界面的能力，在分离通道内部或附近不发生电化学反应。
在一些实施方式中，分离介质可以是辅助流体，例如缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲液。通常，使用0.5mM至50mM的磷酸盐缓冲液，或者其可以超过5mM、10mM、15mM或25mM。在一些实施方式中，所用磷酸盐缓冲液的浓度可小于50mM、40mM、30mM或20mM。优选地，使用10mM的磷酸盐缓冲液。辅助流体可以在分离通道中，带电粒子流入到分离通道中。
分离通道的宽度可以是0.25mm至50mm，或者其可以超过1mm、5mm、10mm或15mm。分离通道的宽度可小于7.5mm、5mm、2.5mm或1mm。例如，分离通道的宽度可以是2mm或10mm。
第一和第二电解质通道的宽度可以是0.2mm至10mm，或者其可以超过2.5mm、5mm或7.5mm。第一和第二电解质通道的宽度可小于10mm、7.5mm或5mm。优选地，电解质通道的宽度为1mm。
分离通道、第一和第二电解质通道的长度可以是大约2mm至100mm，或者其可以超过5mm、10mm或15mm。分离通道和各电解质通道的长度可小于20mm、15mm、10mm或5mm。例如，分离通道和各电解质通道的长度可以是大约5mm，或者其可以是大约25mm。
导电通道的长度可以是0.1mm至15mm，或者其可以超过1mm、2mm、5mm、7mm或10mm。导电通道的长度可小于15mm、12mm、7.5mm或5mm。优选地，导电通道的长度约为2mm。
分离通道、各电解质通道和导电通道的高度可以为约5μm至250μm，或者其可以超过15μm、25μm或35μm。分离通道、各电解质通道和导电通道的高度可小于100μm、20μm或10μm。优选地，分离通道、各电解质通道和导电通道的高度约为25μm。在这些尺寸条件下，分析物可以以600μL/h的典型流速在分离通道中保持约1.5秒。
图1(a)和(b)示出了用于分析样品的优化实施方式，并且分离通道10仅设置有单个出口23。相比之下，图1(c)和图1(d)示出了用于分离样品的优化实施方式，因此分离通道10设置有三个出口23。这种构造允许在三个出口处收集样品的三个不同部分并且还可以用于分析分离通道内的样品。应当理解，可以根据分离的类型和所需的分离程度对出口23的数量进行选择以优化性能。当分析是基于通道内样品的分布时，例如使用荧光标记物并在通道内荧光下观察样品的分布来获得的，单个出口23是最合适的。当样品中的不同部分被分离并随后以不同方式测量、分析或处理时，所需的部分数量将决定出口的最佳数量。例如，可以设置两个、三个、四个或更多个出口。
参考图2、图3、图4、图5、图6和图7，示出了诸如荧光粒子和蛋白质的样品的分离和分析。微流体装置中的粒子分离可以利用电泳法。通常，电泳法是自由流的电泳方法。
如图2和图5所示，本发明公开的微流体装置可用于分离荧光粒子，例如荧光素和罗丹明。在一个实施例中，将10μg/ml荧光素和10μg/ml罗丹明在10mM KCl(pH＝7.0)中的混合溶液注入分离通道，侧边为10mM KCl溶液，并且将1M KCl溶液注入电解质通道(含10μg/ml荧光素，以能够监测高电导率溶液流动通过导电通道阵列)。结果示出在图2中。在分离通道中总共600μL/h的高流速下，可以在图像中看到两个带相反电荷的分析物的明显偏转和分离。在施加的电压为40伏下，样品流分离与流的宽度之比约为7。图4和图5中的I-V曲线表明，偏转随电压和电场的变化呈线性关系。利用这些数据和装置特性，荧光素的电泳迁移率计算为约-2.2×10-8m2/Vs(带负电)。
如图3、图6和图7所示，微流体装置可用于分析更复杂的样品，例如蛋白质。在图3中，将10mM磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)中的2mg/ml溶菌酶注入分离通道，侧边为10mM磷酸盐缓冲液，并将1M KCl溶液注入电解质通道(还有2mg/ml溶菌酶以使界面可见)。用UV显微镜和CCD照相机拍摄紫外光(290nm)下蛋白质的本征荧光图像。激发波长为280nm[带宽20nm]，发射波长为350nm[带宽40nm]。物镜的放大倍率为13倍，照相机是带有透过紫外线的石英窗口的Rolera EMCCD照相机。
此外，图4a示出了在分离通道和电解质通道中填充有1M KCl的微流体电泳装置的I-V曲线，图4b示出了电解质通道中填充有1M KCl而分离通道中充有10mM KCl的微流体电泳装置的I-V曲线。使用不同的溶液测量了微流体电泳装置的I-V曲线。首先用1M KCl填充分离通道和电解质通道，然后将分离通道中的流体变为10mM KCl。
假设对于均匀填充有1M KCl的微流体装置，则分离通道的电阻可忽略不计，由两条I-V曲线计算的电阻差大约为分离通道电阻(当填充10mM KCl时)。结果显示，在分离通道上源电压下降约60％的比例。结果示出在图3中。可以看出，在电流和电压之间以及样品流偏转和电场之间有良好的线性关系。溶菌酶分子的电泳迁移率计算为约2.3×10-8m2/Vs。
在另一个实施例中，本发明公开的微流体装置也用于研究其他蛋白质分子，例如牛血清白蛋白(BSA)、β-乳球蛋白和卵清蛋白。参考图6，示出了在10mM磷酸盐缓冲液中的2mg/ml牛血清白蛋白的微流体电泳，侧边为10mM磷酸盐缓冲液，含有1M KCl电解质。流速：样品/缓冲液＝20/200μL/h。参考图7，示出了在含有1M KCl电解质的10mM磷酸盐缓冲液中2mg/mlβ-乳球蛋白的微流体电泳。流速：样品/缓冲液＝10/150μL/h。
可选地，提供用于控制流体流的循环装置并连接到微流体装置，所述微流体装置包括：第一电解质通道，在该通道的下游出口处设置有正电极；和第二电解质通道，在该通道下游出口处设置有负电极。特别地，循环装置可用于控制和循环高电导率溶液。在一个实施方式中，用于控制流体流的循环装置可以连接至微流体装置，如本发明所公开的并如图9中所示。
在高电导率溶液和分离介质之间产生稳定的界面需要两种流体之间的稳定流。由于高电导率溶液的高流速的潜在要求，高导电率溶液可以出于诸如贮存器的尺寸等实际原因而循环，如图9所示。例如，使用温度控制的贮存器并将使用过的溶液滴到贮存器的顶部，仍然可以将气体和热量有效地保持在微流体装置外部。然而，溶解的电解产物可能难以过滤掉并且可能不得不补充离子。
如图9所示，可以使用解除耦联的、可连接的流体回路来循环例如高电导率溶液的流体流。流体流的控制可能需要压力驱动的流，其可以由压力源26产生。或者，流体流的控制可以使用注射泵21。另外，高电导率溶液可以贮存在入口贮存器28中，并且可以泵送至微流体装置30中。入口贮存器28可以通过可移动的密封件32关闭。
可选地，高电导率溶液可以从微流体装置30泵出，并且可以贮存在出口贮存器29中。如图9所示，在流体流循环过程中，可连接的流体回路的入口侧22和出口侧24处于解除耦联的状态，但在循环操作后可以使它们回到接触状态。包括循环回路31的装置30被配置为经由阀33将流体从出口贮存器29重新引入装置30。阀33是可操作的，以在操作完成之后并且在后续操作开始之前再填充注射泵21。如本文所公开的装置可允许压力驱动流或注射泵形式的高精度流控制。
相比之下，闭合流路必需要例如蠕动泵，其通常不是无脉冲的。另外，完全开放的流路不允许诸如高电导率溶液的流体流的自动循环。
本领域技术人员将进一步理解，尽管已经参考若干实施方式通过示例的方式描述了本发明，但本发明不限于所公开的实施方式，并且在不脱离所附权利要求书限定的本发明的范围的情况下能够构造替代实施方式。

Claims (22)

1.一种用于分离和分析微流体样品的微流体装置，所述装置包括：
分离通道；
第一电解质通道，被配置为在使用中提供高电导率电解质溶液的流，并且在该通道的下游出口处设置有正电极；
第二电解质通道，被配置为在使用时提供高电导率电解质溶液的流，并且在该通道的下游出口处设置有负电极；并且
其中，通过所述第一和第二电解质通道的电解质的流从所述装置中除去电泳产物和气泡；并且
其中，电解质的存在在分离通道上提供基本均匀的电场。
2.根据权利要求1或2所述的微流体装置，其中，所述正电极和所述负电极仅位于相应通道的下游出口处。
3.根据权利要求1或2所述的微流体装置，其中，所述第一和第二电解质通道通过导电通道阵列连接至所述分离通道。
4.根据权利要求3所述的微流体装置，其中，所述导电通道阵列包括至少一个位于所述分离通道的入口附近的导电通道。
5.根据权利要求3或4所述的微流体装置，其中，所述导电通道阵列包括至少一个位于所述通道的出口附近的导电通道。
6.根据权利要求3～5中任一项所述的微流体装置，其中，所述导电通道阵列与所述分离通道基本相毗连。
7.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置，其中，所述导电通道阵列基本垂直于所述分离通道、所述第一和第二电解质通道。
8.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置，其中，所述导电通道阵列被配置为在所述分离通道和所述电极之间提供电连接。
9.根据权利要求8所述的微流体装置，其中，流过所述导电通道的电解质占通过所述分离通道的总流体流量的0.1％至10％。
10.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置，其中，所述电解质溶液是高电导率电解质溶液。
11.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置，其中，所述正电极和所述负电极是金属连接器。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的微流体装置，其中，所述分离通道具有多个出口。
13.一种在根据权利要求1～12中任一项所述的微流体装置中分析样品但没有电解产物的方法，所述方法包括以下步骤：
使高电导率电解质溶液流过所述第一和第二电解质通道；
使样品流过所述分离通道；
拍摄所述分离通道的光学图像；和
分析所述分离通道的光学图像。
14.一种在根据权利要求12所述的微流体装置中分离第一样品的方法，所述方法包括以下步骤：
使高电导率电解质溶液流过所述第一和第二电解质通道；
使微流体样品流过所述分离通道；
对来自所述分离通道的至少一个出口的流出物进行取样。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，所述电解质溶液和微流体样品在所述分离通道内沿相同方向流动。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中，热量通过高电导率电解质溶液的流从所述微流体装置中除去。
17.根据权利要求13～16中任一项所述的方法，其中，气泡通过高电导率电解质溶液的流从所述微流体装置中除去。
18.根据权利要求13～17中任一项所述的方法，其中，电流以与所述第一电解质通道中的电解质溶液的流基本相反的方向流动。
19.根据权利要求13～18中任一项所述的微流体方法，其中，所述电解质溶液与分离介质形成界面，从而产生液体电极。
20.根据权利要求13～19中任一项所述的微流体方法，其中，所述电解质溶液是氯化钾。
21.根据权利要求18所述的微流体方法，其中，所述分离介质是缓冲溶液。
22.根据权利要求21所述的微流体方法，其中，所述缓冲溶液选自包括古氏缓冲液、磷酸盐缓冲液、PBS、碳酸盐缓冲液和硼酸盐缓冲液的组。
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