CN108883165A - 用于癌症免疫治疗的肽和肽组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于免疫治疗方法的肽、蛋白、核酸和细胞。特别是，本发明涉及癌症的免疫疗法。本发明还涉及单独使用或与其他肿瘤相关肽(能够例如作为刺激抗肿瘤免疫反应或体外刺激T细胞并转入患者的疫苗组合物的活性药物成分)联合使用的肿瘤相关T细胞(CTL)肽表位。与主要组织兼容性复合体(MHC)分子结合的肽或与此同类的肽也可以是抗体、可溶性T细胞受体和其他结合分子的靶标。

Description

用于癌症免疫治疗的肽和肽组合物

技术领域

本发明涉及用于免疫治疗方法的肽、蛋白质、核酸和细胞。特别是，本发明涉及癌症的免疫疗法。本发明还涉及单独使用或与其他肿瘤相关肽(刺激抗肿瘤免疫反应或体外刺激T细胞并转入患者的疫苗复合物的活性药物成分)联合使用的肿瘤相关T细胞(CTL)肽表位。与主要组织兼容性复合体(MHC)分子结合的肽或与此同类的肽也可以是抗体、可溶性T细胞受体和其他结合分子的靶标。

本发明还涉及上述肽在生成用于靶向癌细胞的与肿瘤相关抗原(TAA)结合的特异性T细胞受体(TCR)中的用途，以及在生成表达该T细胞受体的T细胞中的用途，以及涉及使用该T细胞受体治疗癌症的方法。源自人肿瘤细胞的HLA-I类分子的新型肽序列及其变体可用在引发抗肿瘤免疫反应的疫苗组合物中或作为开发药物/免疫活性化合物和细胞的靶标。优选的是具有氨基酸序列KIQEILTQV(SEQ ID NO:1)的肽。

背景技术

胃癌是恶性细胞在胃壁形成的一种疾病。胃癌可发源于胃部的任何一部分，可能扩散到整个胃部以及其他器官；尤其是食管、肺和肝脏。胃癌是全球第四最常见的癌症，2002年有93万确诊病例。胃癌具有高死亡率(每年80万)，使之成为全球仅次于肺癌导致癌症死亡的第二大最常见原因。此病较常见于男性，并常见于亚洲国家和发展中国家。

在美国，胃癌约占每年所有新发癌症病例的2％(25,500例)，但在其他国家更常见。在韩国，胃癌是位于第一位的癌症种类，占恶性肿瘤的20.8％。在日本，胃癌仍是男性最常见的癌症。在美国，每年约有13,000名男性和8,000名女性被诊断患有胃癌。大部分为70岁以上。

胃癌是全球第四大常见癌症，仅次于肺癌、乳腺癌、结肠癌和直肠癌。此外，胃癌仍是第二大最常见癌症死因。据美国癌症协会估计，2007年有一百万新发病例，其中近70％发生在发展中国家，大约80万死亡病例。

此疾病的全球发病率中存在巨大的地域差异。该疾病的发病率在亚洲和南美洲部分地区最高，在北美最低。根据记录，该疾病的死亡率在智利、日本、南美和前苏联最高。

除了日本通常进行早期检测外(在韩国以有限的方式进行)，世界大部分地区均不进行筛查，因此，胃癌在得到确诊时通常已为晚期。因而，胃癌仍然对医疗保健专业人士带来重大挑战。胃癌的危险因素为幽门螺旋杆菌(H.pylori)感染、吸烟、摄入高量盐分、以及其他饮食因素。少数胃癌(1％至3％)与胃癌遗传易感性综合征相关。在弥漫型胃癌常染色体显性遗传易感性家族中，大约25％发生E-cadherin基因突变。这一亚群胃癌被称为遗传性弥漫性胃癌。12这可能有益于提供遗传咨询，并考虑在种系截断的年轻无症状携带者中进行预防性胃切除术。

胃壁由3层组织组成：粘膜(最内)层、肌(中间)层和浆膜(最外)层。胃癌首先发生于粘膜层内壁，随着生长而扩散至外层。有四种标准治疗方法可治疗胃癌。胃癌治疗方法包括手术、化疗、放疗或放化疗。手术是胃癌的主要治疗方法。手术的目的是进行完全切除，并使切缘为阴性(R0切除)。但是，大约有50％的局部胃癌患者不能进行R0切除。R1切除表示在显微镜下可发现残留癌细胞(切缘阳性)，R2切除表示有肉眼可见的残留癌细胞，但疾病没有远处转移。患者结果取决于诊断时发现的最初期别(NCCN肿瘤学临床实践指南^TM)。

对于II期疾病患者，治疗性手术切除后5年生存率为30-50％，III期疾病患者为10-25％。这些患者有局部及全身复发的可能性极高。80-90％的胃癌患者均会发生转移，在较早期别得到确诊的患者中6个月生存率为65％，而在较晚期确诊的患者中不到15％。

神经胶质瘤是源自神经系统胶质细胞的脑肿瘤。神经胶质细胞(Glial cell)，通常称为神经胶质(neuroglia)或简单地称为胶质(glia)细胞，是提供支持和营养、保持动态平衡、形成髓鞘和参与神经系统信号传输的非神经元细胞。神经胶质瘤的两个最重要的亚群为星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤，根据其来源的正常胶质细胞类型(分别为星形胶质细胞和少突胶质细胞)而得名。多形性胶质母细胞瘤(以下简称胶质母细胞瘤)属于星形细胞瘤的亚群，是成人中最常见的恶性脑肿瘤，约占所有恶性脑肿瘤的40％，约占胶质瘤的50％(CBTRUS,2006,www.cbtrus.org)。它对中枢神经系统有很强的侵袭性，是所有胶质瘤中恶性水平最高(IV级)的肿瘤。由于神经影像学、显微外科学、各种治疗方案(如替莫唑胺或放射)的进步，在该疾病的治疗方法上已经取得了稳步发展，虽然如此，胶质母细胞瘤仍无法治愈(Burton and Prados,2000)。该类型的脑肿瘤致死率非常高：自首次确诊后的预期平均存活时间为9至12个月。在1986年到1990年的观察期，其5年存活率为8.0％。截至目前，侵袭性治疗(包括肿瘤全切除)治疗后五年存活率仍然不足10％(Burton and Prados,2000)。

结直肠癌的发病是遗传和环境因素之间相互作用的结果。在大多数病例中，结直肠肿瘤似乎由腺瘤性息肉演变而来；但是这个演变过程可能需要很多年。结直肠癌的主要风险因素是年龄，90％的病例在50岁之后诊断患有此病。根据美国癌症协会的报道，结直肠癌的其它风险因素包括饮酒、高脂肪和/或红色肉类饮食、水果和蔬菜的摄取量不足。结直肠癌的发病率继续上升，特别是日本等地区，这些地区接受西化饮食，摄入过多的脂肪和肉类而纤维摄入量减少，这些因素可能是罪魁祸首。但是发病率的上升速度比不上以前，这可能是由于进行了更多的筛查和息肉切除从而防止了息肉发展成为癌症。

和大多数实体肿瘤的治疗一样，一线治疗为手术治疗，但是，手术治疗受益者仍仅限于早期患者，但有很大一部分患者在确诊时已是晚期。基于氟尿嘧啶的化疗方案是晚期结直肠癌的标准治疗。这些治疗方案的大多数为所谓的FOLFOX方案(输注5-FU/亚叶酸+奥沙利铂)和FOLFIRI(伊立替康、亚叶酸，推注和连续输注5-FU)方案。

第三代细胞毒素类药物的引入，如伊立替康和奥沙利铂，增加了显著改善疗效的希望，但预后仍较差，转移癌的存活率一般仍只有大约20个月，因此，治疗该疾病的需求仍远未满足。

癌症免疫治疗代表了癌症细胞特异性靶向作用的一个选项，同时最大限度地减少副作用。癌症免疫疗法利用存在的肿瘤相关抗原。

肿瘤相关抗原(TAA)的目前分类主要包括以下几组：

a)癌-睾丸抗原：T细胞能够识别的最先确认的TAA属于这一类抗原，由于其成员表达于组织学相异的人肿瘤中、正常组织中、仅在睾丸的精母细胞/精原细胞中、偶尔在胎盘中，因此，它最初被称为癌-睾丸(CT)抗原。由于睾丸细胞不表达HLA I类和II类分子，所以，在正常组织中，这些抗原不能被T细胞识别，因此在免疫学上可考虑为具有肿瘤特异性。CT抗原大家熟知的例子是MAGE家族成员和NY-ESO-1。

b)分化抗原：肿瘤和正常组织(肿瘤源自该组织)都含有TAA。大多数已知的分化抗原发现于黑色素瘤和正常黑色素细胞中。许多此类黑色素细胞谱系相关蛋白参与黑色素的生物合成，因此这些蛋白不具有肿瘤特异性，但是仍然被广泛用于癌症的免疫治疗。例子包括，但不仅限于，黑色素瘤的酪氨酸酶和Melan-A/MART-1或前列腺癌的PSA。

c)过量表达的TAA：在组织学相异的肿瘤中以及许多正常组织中都检测到了基因编码被广泛表达的TAA，一般表达水平较低。有可能许多由正常组织加工和潜在提呈的表位低于T细胞识别的阈值水平，而它们在肿瘤细胞中的过量表达能够透过打破先前确立的耐受性而引发抗癌反应。这类TAA的典型例子为Her-2/neu、生存素、端粒酶或WT1。

d)肿瘤特异性抗原：这些独特的TAA产生于正常基因(如β-catenin、CDK4等)的突变。这些分子变化中有一些与致瘤性转化和/或进展相关。肿瘤特异性抗原一般可在不对正常组织带来自体免疫反应风险的情况下诱导很强的免疫反应。另一方面，这些TAA在多数情况下只与其上确认了有TAA的确切肿瘤相关，并且通常在许多个体肿瘤之间并不都共享TAA。在含有肿瘤特定(相关)同种型蛋白的情况下，如果肽源自肿瘤(相关)外显子也可能出现肽肿瘤特异性(或相关性)。

e)由异常翻译后修饰产生的TAA：此类TAA可能由肿瘤中既不具有特异性也不过量表达的蛋白产生，但其仍然具有肿瘤相关性(该相关性由主要对肿瘤具有活性的翻译后加工所致)。此类TAA产生于变糖基化模式的改变，导致肿瘤产生针对MUC1的新型表位或在降解过程中导致诸如蛋白拼接的事件，这可能具有也可能不具有肿瘤特异性。

f)肿瘤病毒蛋白：这些TTA是病毒蛋白，可在致癌过程中发挥关键作用，并且由于它们是外源蛋白(非人源蛋白)，所以能够激发T细胞反应。这类蛋白的例子有人乳头状瘤16型病毒蛋白、E6和E7，它们在宫颈癌中表达。

基于T细胞的免疫治疗靶向作用于主要组织兼容性复合体(MHC)分子提呈的来源于肿瘤相关蛋白或肿瘤特异性蛋白的肽表位。肿瘤特异性T淋巴细胞所识别的抗原，即其表位，可以是源自所有蛋白类型的分子，如酶、受体、转录因子等，它们在相应肿瘤的细胞中被表达，并且与同源未变的细胞相比，其表达通常上调。

MHC分子有两类：MHC I类和MHC II类。MHC I类分子由一条α重链和β-2-微球蛋白，MHC II类分子由一条α和一条β链组成。其三位构造形成一个结合槽，用于与肽进行非共价相互作用。大部分有核细胞上都可发现MHC-I类分子。他们提呈主要为内源性的蛋白、缺陷核糖体产物(DRIP)和较大肽裂解生成的肽。然而，源自内体结构或外源性来源的肽也经常在MHC-I类分子上发现。这种I-类分子非经典提呈方式在文献中被称为交叉提呈(Brossartand Bevan,1997；Rock et al.,1990)。MHC II类分子主要发现于专业抗原提呈细胞(APC)上，并且主要提呈，例如，在内吞作用过程中由APC占据并且随后被加工的外源性或跨膜蛋白的肽。

肽和MHC I类的复合体由负载相应T细胞受体(TCR)的CD8阳性T细胞进行识别，而肽和MHC II类分子的复合体由负载相应TCR的CD4阳性辅助T细胞进行识别。因此，TCR、肽和MHC按照1:1:1的化学计量呈现，这一点已是共识。

CD4阳性辅助T细胞在诱导和维持CD8阳性细胞毒性T细胞的有效反应中发挥重要作用。肿瘤相关抗原(TAA)衍生的CD4阳性T细胞表位的识别对开发能引发抗肿瘤免疫反应的药物产品可能非常重要(Gnjatic et al.,2003)。在肿瘤部位，T辅助细胞维持着对细胞毒性T细胞(CTL)友好的细胞因子环境(Mortara et al.,2006)并吸引效应细胞，如CTL、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞和粒细胞(Hwang et al.,2007)。

在没有炎症的情况下，MHC II类分子的表达主要局限于免疫系统细胞，尤其是专业抗原提呈细胞(APC)，例如，单核细胞、单核细胞源性细胞、巨噬细胞、树突状细胞。在癌症患者的肿瘤细胞中发现有MHC II类分子的表达(Dengjel et al.,2006)。本发明的拉长(较长)肽可作为MHC-II类活性表位。

MHC-II类表位活化的辅助T细胞在编排抗肿瘤免疫的CTL效应子功能中发挥着重要作用。触发T_H1细胞反应的辅助T细胞表位支援CD8阳性杀伤T细胞的效应子功能，其中包括直接作用于肿瘤细胞的细胞毒性功能(该类肿瘤细胞表面显示有肿瘤相关肽/MHC复合体)。这样，肿瘤相关T辅助细胞表位单独使用或与其他肿瘤相关肽结合使用可作为刺激抗肿瘤免疫反应的疫苗化合物的活性药物成分。

哺乳动物(如小鼠)模型显示，即使没有CD8阳性T淋巴细胞，CD4阳性T细胞也能透过分泌干扰素-γ(IFNγ)抑制血管生成而足以抑制肿瘤的表现(Beatty and Paterson,2001；Mumberg et al.,1999)。没有CD4T细胞作为直接抗肿瘤效应因子的证据(Braumulleret al.,2013；Tran et al.,2014)。

由于HLA II类分子的组成性表达通常仅限于免疫细胞，因此，直接从原发肿瘤中分离II类肽之前被认为是不可能的事。然而，Dengjel等人成功地在肿瘤中直接识别了多个MHC II类表位(WO 2007/028574,EP 1 760 088 B1)。

由于CD8依赖型和CD4依赖型这两种反应共同并协同地促进抗肿瘤作用，因此，确定和表征由CD8+T细胞(配体：MHC I类分子+肽表位)或CD4阳性T辅助细胞(配体：MHC II类分子)识别的肿瘤相关抗原对开发肿瘤疫苗非常重要。

对于MHC I类肽触发(引发)细胞免疫反应的肽，它也必须与MHC分子结合。这一过程依赖于MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特异性多态性。MHC-I类-结合肽的长度通常为8-12个氨基酸残基，并且在其与MHC分子相应结合沟槽相互作用的序列中通常包含两个保守残基(“锚“)。这样，每个MHC的等位基因都有”结合基序“，从而确定哪些肽能与结合沟槽特异性结合。

在MHC-I类依赖性免疫反应中，肽不仅能与肿瘤细胞表达的某些MHC-I类分子结合，而且它们之后还必须能被T细胞负载的特异性T细胞受体(TCR)识别。

对于被T淋巴细胞识别为肿瘤特异性抗原或相关性抗原以及用于治疗的蛋白质，必须具备特殊的条件。该抗原应主要由肿瘤细胞表达，而不由正常健康组织表达，或表达数量相对较少。在一个优选的实施方案中，与正常健康组织相比，所述肽应在肿瘤细胞中过度提呈。更为适宜的情况是，该相应抗原不仅出现于一种肿瘤中，而且浓度(即每个细胞的相应肽拷贝数目)高。肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原往往是源自直接参与因细胞周期控制或凋亡抑制中的其功能而发生的正常细胞向肿瘤细胞转化的蛋白。另外，这些直接导致转化事件的蛋白的下游靶标可能会被上调，因此可能与肿瘤间接相关。这些间接肿瘤相关抗原也可能是预防接种方法的靶标(Singh-Jasuja et al.,2004)。至关重要的是，表位存在于抗原氨基酸序列中，以确保这种来自肿瘤相关抗原的肽(“免疫原性肽“)可导致体外或体内T细胞反应。

因此，TAA是基于T细胞疗法(包括但不限于肿瘤疫苗)研发的起点。识别和表征TAA的方法通常基于对患者或健康受试者T细胞的使用情况，或基于肿瘤与正常组织肽之间差别转录特性或差别表达模式的产生。然而，对肿瘤组织或人肿瘤细胞株中过量表达或选择性表达的基因的识别并不提供在免疫疗法中使用这些基因所转录抗原的准确信息。这是因为，有着相应TCR的T细胞必须要存在而且对这个特定表位的免疫耐受性必须不存在或为最低水平，因此，这些抗原的表位只有一部分适合这种应用。因此，在本发明的一非常优选的实施例中，只选择那些针对可发现功能性和/或增殖性T细胞情况的过量提呈或选择性提呈肽，这一点非常重要。这种功能性T细胞被定义为在以特异性抗原刺激后能够克隆地扩展并能够执行效应子功能(“效应子T细胞”)的T细胞。

在通过根据本发明的特定TCR(例如可溶性TCR)和抗体或其他结合分子(支架)靶向作用于肽-MHC的情况下，基础肽的免疫原性是次要的。在这些情况下，提呈是决定因素。

因此，鉴于其他癌症的上述和类似情况，仍然需要对以下癌症患者实施安全有效、并且在不使用化疗药物或可能导致严重副作用药物的情况下即可提升患者福祉的新型治疗方案：胃癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、急性髓性白血病(AML)、幽门螺旋杆菌引起的MALT淋巴瘤、结肠癌/结直肠癌、胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、宫颈癌、人乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、肝癌、不同表型的脑肿瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)等白血病、肺癌、尤因氏肉瘤、子宫内膜癌、头颈部鳞状细胞癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、膀胱癌、卵巢癌、肾细胞癌、非典型脑膜瘤、乳头状甲状腺癌、脑肿瘤、涎腺导管癌、宫颈癌、结外型T/NK细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺和乳腺的恶性实体瘤、以及其他肿瘤。

WO 2015/187040涉及氨基神经鞘糖脂类似物及其肽衍生物，包含这些化合物的组合物和使用这些化合物治疗或预防疾病或病症的方法，尤其是与癌症、感染、特应性疾病、自身免疫疾病或糖尿病有关的疾病或病症。KIQEILTQV为SEQ ID NO:377，如序列中含有一个或多个与MHC分子结合并诱导T细胞应答的表位的肽所公开。

US 2012-0308590公开了KIQEILTQV(SEQ ID NO:3)，其属于用于肺癌和食管癌治疗的IMP-3 552-560(胰岛素样生长因子II mRNA结合蛋白3)。同样，Tomita,Y.等人公开了衍生自IMP-3的肽。

US 20110142919公开了衍生自推定RNA结合蛋白KOC并由MS鉴定的KIQEILTQV(SEQID NO:409)。

Dutoit等人(2012)公开了用于胶质母细胞瘤治疗的KIQEILTQV(NP_006538)。

WO 2007/150077公开了从卵巢癌样本中分离的免疫原性肽。肽IGF2BP3-001为SEQID No:158。

发明内容

在本发明的第一方面，本发明涉及一种肽或其药用盐，包含由SEQ ID NO:1组成或由该序列的与SEQ ID NO:1具有至少77％、优选至少85％同源(优选至少75％或至少85％相同)的变体序列组成的氨基酸序列，其中变体与MHC结合和/或诱导T细胞与所述肽发生交叉反应，其中所述肽不是基础的全长多肽。此外，所述肽不是IMP-3和/或KOC衍生的抗原。

本发明进一步涉及本发明的肽或其药用盐，其包含由SEQ ID NO:1组成或由与SEQID NO:1具有至少65％、优选至少75％、且更优选至少85％同源性(优选为至少75％或至少85％相同)的变体组成的序列，其中所述肽或其变体的总长度为8至100个、优选为8至30个、最优选为8至14个氨基酸，其中所述肽或变体与MHC结合和/或诱导T细胞与所述肽发生交叉反应。

本发明的肽是本文所述SEQ ID NO:1(KIQEILTQV)及其变体的肽。

本发明还通常涉及本发明的肽在治疗增殖性疾病中的用途，增殖性疾病为例如胃癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、急性髓性白血病、幽门螺旋杆菌引起的MALT淋巴瘤、结肠癌/结直肠癌、胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、宫颈癌、人乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、肝癌、不同表型的脑肿瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)等白血病、肺癌、尤因氏肉瘤、子宫内膜癌、头颈部鳞状细胞癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、膀胱癌、卵巢癌、肾细胞癌、非典型脑膜瘤、乳头状甲状腺癌、脑肿瘤、涎腺导管癌、宫颈癌、结外型T/NK细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺和乳腺的恶性实体瘤、以及其他肿瘤。

优选的是在非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌(如胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤)、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、头颈癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、默克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌和胆管癌以及食管癌中的用途。更优选的是在胰腺癌、肝细胞癌、胃癌和/或结直肠癌中的用途。

特别优选的是本发明由SEQ ID NO:1组成的肽(单独或与其他组合)。更优选的是由SEQ ID NO:1组成的肽(单独或与其他组合)，及其在胃癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、急性髓性白血病、幽门螺旋杆菌引起的MALT淋巴瘤、结肠癌/结直肠癌、胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、宫颈癌、人乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、肝癌、不同表型的脑肿瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)等白血病、肺癌、尤因氏肉瘤、子宫内膜癌、头颈部鳞状细胞癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、膀胱癌、卵巢癌、肾细胞癌、非典型脑膜瘤、乳头状甲状腺癌、脑肿瘤、涎腺导管癌、宫颈癌、结外型T/NK细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺和乳腺的恶性实体瘤以及其他肿瘤的免疫治疗中的用途。

IGF2BP1基因编码胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白家族的成员。该基因编码的蛋白质含有4个K同源结构域和2个RNA识别基序。它通过与某些基因mRNA结合起作用，包括胰岛素样生长因子2，β-肌动蛋白和含β-转导素重复基因蛋白，并调节它们的翻译。已经发现了编码该基因不同同种型的两种转录物变体。IGF2BP1基因定位于染色体17q21.32。该基因座中的580kb微缺失与精神发育迟滞、小头畸形、腭裂和心脏畸形相关(Rooryck et al.,2008)。

IGF2BP1在多种不同的癌症实体中过度表达。在乳腺癌中，已检测到中度(30％)和高度(5％)IGF2BP1基因扩增以及IGF2BP1扩增非依赖性过度表达(Doyle et al.,2000；Ioannidis et al.,2003)。由Ross及其同事进行的结直肠癌研究显示，IGF2BP1在大多数结直肠癌标本中过度表达(81％)，而在正常结肠组织中缺乏或缺失(Ross et al.,2001)。Ioannidis及其同事提供了IGF2BP1在一组癌症类型中表达的证据，包括结肠癌(1/1)、前列腺癌(1/4)、乳腺癌(3/4)、不同肉瘤(24/33)、单核细胞白血病(1/2)、12/24的恶性神经上皮肿瘤、2/5的良性神经上皮肿瘤和4/15的非小细胞肺癌(Ioannidis et al.,2001；Ioannidis et al.,2004)。此外，IGF2BP1被证明在腺癌和卵巢低恶性潜在肿瘤(Gu etal.,2004)和卵巢浆液性癌积液(Davidson et al.,2014)以及肝细胞癌(2/7的患者)(Himoto et al.,2005；Gutschner et al.,2014)、绒毛膜癌(Hsieh et al.,2013)、神经母细胞瘤(Bell et al.,2015)和横纹肌肉瘤(Faye et al.,2015)中过度表达。IGF2BP1表达的上调已在不同的睾丸肿瘤中进一步描述，如原位侵袭性睾丸癌、经典和精原细胞瘤和未分化胚胎癌(Hammer et al.,2005)。在急性淋巴细胞白血病中，IGF2BP1过度表达似乎是ETC6/RUNX1阳性肿瘤亚组的特征(Stoskus et al.,2011)。在恶性黑色素瘤中，IGF2BP1的表达增加显示与Wnt/β-连环蛋白信号传导途径的过度活性相关(Elcheva et al.,2008)。IGF2BP2在基底细胞癌中过度表达与Wnt激活以及Hedgehog信号传导相关(Noubissi etal.,2014)。

高IGF2BP1水平似乎与不同癌症实体的不良预后相关。IGF2BP1过度表达显示与卵巢癌患者的无复发和总体存活率下降显著相关(Gu et al.,2004；Kobel et al.,2007)。此外，IGF2BP1的阳性免疫染色与肺癌患者的肿瘤大小、非良好分化的肿瘤分级和预后不良相关(Kato et al.,2007)。在结直肠癌中，发现IGF2BP1的表达与转移形成和复发增加以及较短的存活时间相关(Dimitriadis et al.,2007)。IGF2BP1过度表达与肝细胞癌的预后不良(Zhou et al.,2015b)以及神经母细胞瘤患者的总体存活率较低(Bell et al.,2015)相关。IGF2BP1超甲基化显示与脑膜瘤的侵袭性疾病表型相关(Vengoechea et al.,2013)。

IGF2BP1表达显示与卵巢癌、结直肠癌和神经母细胞瘤的晚期疾病阶段相关。Koebel及其同事报告了优先检测到IGF2BP1在高级别和晚期卵巢癌标本中表达水平高(Kobel et al.,2007)。在结直肠癌中，IGF2BP1染色的频率和强度显示随着疾病进展到淋巴结转移而增加。在97％的结直肠癌淋巴结转移中检测到高水平的IGF2BP1蛋白，原发癌中的表达水平与存在淋巴结转移具有良好的相关性(Vainer et al.,2008)。在神经母细胞瘤中，IGF2BP1表达与4期癌症相关(Bell et al.,2015)。

本发明还涉及本发明的肽，其具有与主要组织兼容性复合体(MHC)I或以延长形式存在的例如长度变化的MHC-II类分子结合的能力。

本发明进一步涉及本发明中的肽，其中所述肽(每种肽)由或基本由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。

本发明进一步涉及本发明的肽，其中所述肽被修饰和/或包含非肽键。

本发明进一步涉及本发明的肽，其中所述肽为融合蛋白的一部分，特别是与HLA-DR抗原相关不变链(Ii)的N-端氨基酸融合，或与抗体(例如，树突状细胞特定抗体)融合，或融合到抗体的序列中。

本说明书进一步涉及一种核酸，其编码本发明的肽。本说明书进一步涉及本发明的核酸，其为DNA、cDNA、PNA、RNA、或其组合。

本发明进一步涉及一种能表达和/或表达本发明核酸的表达载体。

本发明进一步涉及本发明的肽、本发明的核酸或本发明的表达载体在治疗疾病和药物中的用途，特别是用于治疗癌症。

本发明进一步涉及本发明中肽或本发明中所述肽复合体(含有MHC)的特异性抗体以及制造这些抗体的方法。

本发明进一步涉及含本发明核酸或表达载体的宿主细胞。

本发明进一步涉及本发明的宿主细胞，其为抗原提呈细胞，优选为树突细胞。

本发明进一步涉及制备本发明肽的一种方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞，以及从所述宿主细胞或其培养基中分离肽。

本发明进一步涉及本发明中的方法，其中通过使足量的抗原与抗原提呈细胞接触，抗原被载在表达于合适抗原提呈细胞或人工抗原呈递细胞表面的I或II类MHC分子上。

本发明进一步涉及本发明的方法，其中抗原提呈细胞包含能表达和/或表达含SEQID NO:1、优选为含SEQ ID NO:1或其变体氨基酸序列的肽的表达载体。

本发明进一步涉及以本发明方法制造的激活的T细胞，其中所述T细胞有选择性地识别一种细胞，该细胞表达含本发明氨基酸序列的多肽。

本发明进一步涉及一种杀伤患者靶细胞的方法，其中患者的靶细胞异常地表达含本发明任意氨基酸序列的多肽，该方法包括对患者施用本发明方法制造的有效量T细胞。

本发明进一步涉及任何所述肽、本发明的核酸、本发明的表达载体、本发明的细胞、本发明的激活的T淋巴细胞、T细胞受体或抗体或其他肽-和/或肽-MHC结合分子作为药物或在药物制备中的用途。所述药物优选为具有抗癌活性。

优选情况为，所述药物为基于可溶性TCR或抗体的细胞治疗药物、疫苗或蛋白质。

本发明进一步涉及本发明中的用途，其中所述癌细胞来自胃癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、急性髓性白血病、幽门螺旋杆菌引起的MALT淋巴瘤、结肠癌/结直肠癌、胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、宫颈癌、人乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、肝癌、不同表型的脑肿瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)等白血病、肺癌、尤因氏肉瘤、子宫内膜癌、头颈部鳞状细胞癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、膀胱癌、卵巢癌、肾细胞癌、非典型脑膜瘤、乳头状甲状腺癌、脑肿瘤、涎腺导管癌、宫颈癌、结外型T/NK细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺和乳腺的恶性实体瘤、以及其他肿瘤。

本发明进一步涉及一种基于本发明肽的生物标志物，在此称为“靶标“，其可用于诊断癌症，优选为非小细胞肺癌。所述标志物可以是肽本身的过度提呈，或相应基因的过度表达。标志物也可以用于预测治疗成功的可以性，优选为免疫疗法，最优选为靶向由该生物标志物识别的相同靶的免疫疗法。例如，抗体或可溶性TCR可用于对肿瘤切片进行染色以检测是否存在与MHC复合的相关肽。任选地，抗体具有进一步的效应子功能，如免疫刺激域或毒素。

本发明还涉及这些新靶标在确定可识别至少一种所述靶标的TCR中的用途，优选为在确定可激活T细胞的TCR中的用途

本发明还涉及这种新靶标在癌症治疗中的用途。

本发明还涉及本发明的肽在制备TCR、个别TCR亚基(单独或组合)及其亚结构域，特别是可溶性TCR(sTCR)和克隆TCR中的用途，所述TCR加工为自体或异体T细胞，以及涉及制备这些TCR的方法，以及载有所述TCR或与所述TCR交叉反应的其他细胞。

本发明进一步涉及TCR蛋白、个别TCR亚基(单独或组合)及其亚结构域，特别是结合至KIQEILTQV(SEQ ID NO:1)-HLA-A*02复合体的可溶性TCR(sTCR)，其包含TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。

本发明进一步涉及包含编码本发明TCR的核苷酸序列的分离核酸。本说明书进一步涉及根据本说明书制备的包含编码TCRα链、β链或两者的核酸的重组表达载体。

本说明书进一步涉及本发明的包含表达编码TCRα链、β链或两者的核酸的重组表达载体的分离宿主细胞。

本说明书进一步涉及包含本发明重组表达载体的分离宿主细胞，优选其中所述细胞为外周血淋巴细胞(PBL)。

本说明书进一步涉及包含本发明重组表达载体的分离PBL，其中所述PBL为CD8+T细胞或CD4+ T细胞。

本说明书进一步涉及包含本发明的至少一种宿主细胞的细胞群。

本说明书进一步涉及本发明TCR蛋白在治疗增殖性疾病中的用途，增殖性疾病为例如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、脑癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、乳腺癌、默克尔细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、胆囊癌、胆管癌和食管癌。

具体实施方式

是否能刺激免疫反应取决于是否存在被宿主免疫系统视为异物的抗原。发现肿瘤相关抗原的存在增加了运用宿主免疫系统干预肿瘤生长的可能性。目前，针对癌症免疫治疗，正在探索利用免疫系统的体液和细胞进行免疫的各种机制。

细胞免疫反应的特定元素能特异性地识别和破坏肿瘤细胞。从肿瘤浸润细胞群或外周血中分离出的T-细胞表明，这些细胞在癌症的天然免疫防御中发挥了重要作用。特别是CD8阳性T细胞在这种反应中发挥重要作用，TCD8⁺能识别通常8至10个源自蛋白或位于细胞质的缺损核糖体产物(DRIP)的氨基酸残基的主要组织兼容性复合体(MHC)所载的肽中所含的I类分子。人MHC分子也称为人白细胞-抗原(HLA)。

术语“T细胞反应”是指由一种肽在体外或体内诱导的效应子功能的特异性扩散和激活。对于MHC I类限制性细胞毒性T细胞，效应子功能可能为溶解肽脉冲的、肽前体脉冲的或天然肽提呈的靶细胞、分泌细胞因子，优选为肽诱导的干扰素-γ，TNF-α或IL-2，分泌效应分子，优选为肽诱导的颗粒酶或穿孔素，或脱颗粒。

本文所用“肽”这一术语，是指一系列氨基酸残基，通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。这些肽的长度优选为9个氨基酸，但至短可为8个氨基酸长度，至长可为10或11个氨基酸或更长，如果为MHC-II类肽时(本发明肽的延长变体)，至长可为12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸长度或更长。

因此，“肽”这一术语应包括一系列氨基酸残基的盐，通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。优选的情况是，盐为肽的药用盐，例如：氯化物或乙酸(三氟乙酸)盐。必须注意的是，本发明肽的盐与其体内状态的肽基本上不同，因为该不是体内的盐。

术语“肽”应也包括“寡肽”。本文使用的术语“寡肽”是指一系列氨基酸残基，通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。寡肽的长度对于本发明来说并不十分关键，只要在寡肽中保持正确的表位即可。通常，寡肽长度约小于30个氨基酸残基，约长于15个氨基酸。

“多肽”这一术语是指一系列氨基酸残基，通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。多肽的长度对于本发明来说并不十分关键，只要保持正确的表位即可。与术语肽或寡肽相对，“多肽”这一术语是指包含多于约30个氨基酸残基的分子。

一种肽、寡肽、蛋白质或编码该分子的核苷酸如果能诱导免疫反应，则具有“免疫原性”(因此是本发明中的一种“免疫原”)。在本发明的情况下，免疫原性的更具体定义是诱导T细胞反应的能力。因此，“免疫原”是一种能够诱导免疫反应的分子，并且在本发明的情况下，是一种能诱导T细胞反应的分子。在另一方面，所述免疫原可以是肽，肽与MHC的复合体、和/或用于提高特异性抗体或TCR抗性的蛋白。

I类T细胞“表位”要求的是一种结合至MHC I类受体上的短肽，从而形成一种三元复合体(MHC I类α链、β-2-微球蛋白和肽)，其可以通过T细胞负载匹配T细胞受体与具有适当亲和力的MHC/肽复合物结合来识别。结合至MHC I类分子的肽的典型长度为8-14个氨基酸，最典型为9个氨基酸长度。

在人类中，有三种编码MHC I类分子的不同基因位点(人MHC分子也是指定的人白细胞抗原(HLA))：HLA-A、HLA-B和HLA-C。HLA-A*01、HLA-A*02和HLA-B*07是可从这些基因位点表达的不同MHC I类等位基因的实例。

表1：HLA-A*02和HLA-A*24和最常见HLA-DR血清类型的表达频率F。频率根据Mori等人(Mori et al.,1997)使用的Hardy-Weinberg公式F＝1–(1-Gf)²改编，从美国人群范围内的单体型频率中推导出。由于连锁不平衡，某些HLA-DR等位基因内的A*02或A*24组合与其预期单一频率相比，可能是浓缩的或频率较低。有关详细信息，请参阅Chanock等人的文献(Chanock et al.,2004)。

在一项优选的实施方案中，术语“核苷酸序列”是指脱氧核苷酸的杂聚物。

编码特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可为天然核苷酸序列，也可为合成核苷酸序列。一般来说，编码肽、多肽以及本发明蛋白的DNA片段由cDNA片段和短寡核苷酸衔接物，或一系列寡核苷酸组成，以提供一种合成基因，该基因能够在包含源自微生物或病毒操纵子的调节元素的重组转录单元中被表达。

如本文所用的术语“肽的核苷酸编码”是指编码肽的核苷酸序列，其包括与将表达序列的生物系统，如树突细胞或用于产生TCR的另一细胞系统，兼容的人工(人造)启动子和终止密码子。

如本文所用的术语“TCR蛋白的核苷酸编码”指编码TCR蛋白的核苷酸序列，其包括与将表达序列的生物系统，如T细胞或用于产生TCR的另一细胞系统，兼容的人工(人造)启动子和终止密码子。

本文提到的核酸序列既包括单链核酸也包括双链核酸。因此，除非本文另有所指，否则，例如对于DNA，具体的序列是该序列的单链DNA、该序列与其互补序列的双工(双链DNA)以及该序列的互补序列。

“编码区”这一术语是指在基因的天然基因组环境中天然或正常编码该基因的表达产物的那部分基因，即，体内编码该基因的天然表达产物的区域。

编码区可来自非突变(“正常”)基因、突变基因或异常基因，甚至还可以来自DNA序列，完全可在实验室中使用本领域熟知的DNA合成方法合成。

“表达产物”这一术语是指多肽或蛋白，它是基因和遗传码退化并因而编码同样的氨基酸所造成的任何核酸序列编码同等物的翻译产物。

“片段”这一术语，当指的是一种编码序列时，表示包含非完整编码区的DNA的一部分，其表达产物与完整编码区表达产物基本上具有相同的生物学功能或活性。

“DNA片段”这一术语是指一种DNA聚合物，以单独的片段形式或一种较大DNA结构的组分形式存在，它们从至少分离过一次的DNA中以基本纯净的形式获得，即不含污染性内源性材料，并且获得的数量或浓度能够使用标准生化方法，例如使用克隆载体，进行识别、操纵和回收该片段及其组分核苷酸序列。此类片段以开放阅读框架(未被内部未翻译序列打断)或内含子(通常提呈于真核基因中)的形式存在。未翻译DNA序列可能存在于开放阅读框架的下游，在那里其不会干预编码区的操纵或表达。

“引物”这一术语表示一种短核酸序列，其可与一个DNA链配对，并在DNA聚合酶开始合成脱氧核糖核酸链之处提供一个游离的3'-OH末端。

“启动子”这一术语表示参与RNA聚合酶的结合从而激活转录的DNA区域。

术语“分离”表示一种物质从其原来的环境(例如，如果是天然发生的则是天然环境)中被移走。例如，活体动物中的天然核苷酸或多肽不是分离的，但是，从天然系统中一些或所有共存物质中分离出来的核苷酸或多肽是分离的。此类多核苷酸可能是载体的一部分和/或此类多核苷酸和多肽可能是一种组合物的一部分，并且由于该载体或组合物不是其天然环境的一部分，因此它仍然是分离的。

本发明中披露的多核苷酸和重组或免疫原性多肽也可能以“纯化”的形式存在。术语“纯化”并非要求绝对的纯度；它只是一个相对的定义，可以包括高度纯化或部分纯化的制剂，相关领域技术人员能理解这些术语。例如，各个从已用传统方法纯化为具有电泳同构型的cDNA库中分离出的各种克隆物。明确考虑到将起始材料或天然物质纯化至少一个数量级，优选为两或三个数量级，更优选为四或五个数量级。此外，明确涵盖所述多肽的纯度优选为99.999％，或至少为99.99％或99.9％；甚而适宜为以重量计99％或更高。

根据本发明公开的核酸和多肽表达产物，以及包含此类核酸和/或多肽的表达载体可能以“浓缩的形式”存在。本文使用的术语“浓缩”是指材料的浓度至少是其自然浓度的大约2、5、10、100或1000倍，有优势的是，按重量计为0.01％，优选为至少0.1％。也明确考虑到，按重量计约为0.5％、1％、5％、10％和20％的浓缩制剂。序列、构型、载体、克隆物以及包含本发明的其他材料可有优势地以浓缩或分离的形式存在。“活性片段”这一术语是指产生免疫反应的片段(即具有免疫原性活性)，通常是一种肽、多肽或核酸序列的片段，不论是单独或可选地与合适的佐剂一起或在载体中给予一种动物，比如哺乳动物，例如兔子或小鼠，也包括人；这种免疫反应采用的形式是在接受动物(如：人)体内刺激T细胞反应。或者，“活性片段”也可用于诱导体外T细胞反应。

本文使用的“部分”(portion)、“节段”(segment)、“片段”(fragment)这几个术语，当与多肽相关地使用时是指残基的连续序列，比如氨基酸残基，其序列形成一个较大序列的子集。例如，如果一个多肽以任一种肽链内切肽酶(如胰蛋白酶或糜蛋白酶)进行处理，则该处理获得的寡肽会代表起始多肽的部分、节段或片段。当与多核苷酸相关地使用时，这些术语是指用任何核酸内切酶处理所述多核苷酸产生的产物。

根据本发明，术语“等同度百分比”或“等同百分比”，如果指的是序列，则表示在待对比序列(“被对比序列”)与所述序列或权利要求的序列(“参考序列”)对准之后将被对比序列与所述序列或权利要求的序列进行比较。然后根据下列公式计算等同度百分比：

等同度百分比＝100[1-(C/R)]

其中C是参考序列与被对比序列之间对准长度上参考序列与被对比序列之间的差异数量，其中

(i)参考序列中每个碱基或氨基酸序列在被对比序列中没有对应的对准碱基或氨基酸；

(ii)参考序列中每个空隙，以及

(iii)参考序列中每个对准碱基或氨基酸与被比对比序列中对准碱基或氨基酸不同，即构成一个差异以及

(iiii)必须在对准序列的第1位置开始对准；

并且R是参考序列与被对比序列对准长度上在参考序列中产生任何空隙也计算为一个碱基或氨基酸的参考序列中的碱基或氨基酸数目。

如果“被对比序列”和“参考序列”之间存在的一个对准按上述计算的等同度百分比大致等于或大于指定的最低等同度百分比，则被对比序列与参考序列具有指定的最低等同度百分比，虽然可能存在按本文上述计算的等同度百分比低于指定等同度百分比的对准。

因此，如上所述，本发明提出了一种肽，其包括选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10的一个序列、或与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10具有85％同源性的其变体、或诱导与该肽发生T细胞交叉反应的一个变体。本发明所述的肽具有与主要组织兼容性复合体(MHC)I或所述肽延长版本的II类分子结合的能力。

在本发明中，“同源性”一词是指两个氨基酸序列之间的同一度(参见上文的等同度百分比，如肽或多肽序列。前文所述的“同源”是通过将理想条件下调整的两个序列与待比较序列进行比对后确定的。此类序列同源性可通过使用ClustalW等算法创建一个排列而进行计算。也可用使用一般序列分析软件，更具体地说，是Vector NTI、GENETYX或由公共数据库提供的其他工具。

本领域技术人员能评估特定肽变体诱导的T细胞是否可与该肽本身发生交叉反应(Appay et al.,2006；Colombetti et al.,2006；Fong et al.,2001；Zaremba et al.,1997)。

发明人用给定氨基酸序列的“变体”表示，一个或两个氨基酸残基等的侧链通过被另一个天然氨基酸残基的侧链或其他侧链取代而发生改变，这样，这种肽仍然能够以由SEQID NO:1的给定氨基酸序列构成的肽大致同样的方式与HLA分子结合。优选为KIQEILTQV(SEQ ID NO:1)。例如，一种肽可能被修饰以便至少维持(如没有提高)其能与HLA-A*02或-DR等合适MHC分子的结合槽相互作用和结合，以及至少维持(如没有提高)其与激活T细胞的TCR结合的能力。类似地，TCR蛋白可被修饰成至少维持(如果不提升的话)其与合适的MHC分子/KIQEILTQV(SEQ ID NO:1)复合体，例如HLA-A或-DR相互作用和结合的能力，并且以那种方式，至少维持(如果不提升的话)激活T细胞的能力。

随后，这些T细胞可与细胞和杀伤细胞发生交叉反应，这些细胞表达多肽，其中包含本发明中定义的同源肽的天然氨基酸序列，如，KIQEILTQV(SEQ ID NO:1)。正如科学文献和数据库(Rammensee et al.,1999；Godkin et al.,1997)中所述，HLA-A结合肽的某些位点通常为锚定残基，可形成一种与HLA结合槽的结合模序相称的核心序列，其定义由构成结合槽的多肽链的极性、电物理、疏水性和空间特性确定。因此，本领域技术人员能够通过保持已知的锚残基来修饰SEQ ID No:1提出的氨基酸序列，并且能确定这些变体是否保持与MHC I或II类分子/KIQEILTQV(SEQ ID NO:1)复合体结合的能力。本发明的变体保持与MHCI或II类分子/KIQEILTQV(SEQ ID NO:1)复合体结合的能力。表达本发明变体的T细胞可以在随后杀灭表达含有同源肽(例如KIQEILTQV(SEQ ID NO:1))的天然氨基酸序列的多肽的细胞。

如果无另有说明，那么本文公开的原始(未修饰)肽可以通过在肽链内的不同(可能为选择性)位点上取代一个或多个残基而被修饰。优选情况是，这些取代位于氨基酸链的末端。对于TCR蛋白，优选情况是，这些取代位于TCRα链和TCRβ链的可变结构域。此取代可能是保守性的，例如，其中一个氨基酸被具有类似结构和特点的另一个氨基酸所取代，比如其中一个疏水性氨基酸被另一个疏水性氨基酸取代。更保守的取代是具有相同或类似的大小和化学性质的氨基酸间的取代，例如，亮氨酸被异亮氨酸取代。在天然同源蛋白质家族序列变异的研究中，某些氨基酸的取代往往比其他氨基酸更具有耐受性，这些氨基酸往往表现出与原氨基酸的大小、电荷、极性和疏水性之间的相似性相关，这是确定“保守取代”的基础。

在本文中，保守取代定义为在以下五种基团之一的内部进行交换：基团1—小脂肪族、非极性或略具极性的残基(Ala,Ser,Thr,Pro,Gly)；基团2—极性、带负电荷的残基及其酰胺(Asp,Asn,Glu,Gln)；基团3—极性、带正电荷的残基(His,Arg,Lys)；基团4—大脂肪族非极性残基(Met,Leu,Ile,Val,Cys)以及基团5—大芳香残基(Phe,Tyr,Trp)。

较不保守的取代可能涉及一个氨基酸被另一个具有类似特点但在大小上有所不同的氨基酸所取代，如：丙氨酸被异亮氨酸残基取代。高度不保守的取代可能涉及一个酸性氨基酸被另一个具有极性或甚至具有碱性性质的氨基酸所取代。然而，这种“激进”取代不能认为是无效的而不予考虑，因为化学作用是不完全可预测的，激进的取代可能会带来其简单化学原理中无法预见的偶然效果。

当然，这种取代可能涉及普通L-氨基酸之外的其他结构。因此，D-氨基酸可能被本发明的抗原肽中常见的L-氨基酸取代，也仍在本公开的范围之内。此外，非标准氨基酸(即，除了常见的天然蛋白原氨基酸)也可以用于取代之目的，以生产根据本发明的免疫原和免疫原性多肽。

如果在一个以上位置上的取代发现导致肽的抗原活性基本上等于或大于以下定义值，则对这些取代的组合进行测试，以确定组合的取代是否产生对肽抗原性的迭加或协同效应。肽内被同时取代的位置最多不能超过4个。

基本上由本文所指氨基酸序列组成的一种肽可能有一个或两个非锚定氨基酸(见下面锚基序相关内容)被交换，而不存在这种情况，即相比于未修饰的肽，与人类主要组织兼容性复合体(MHC)–I或II类分子的能力基本上被改变或受到不利影响。在另一实施方案中，在基本上由本文所述氨基酸序列组成的肽中，一个或两个氨基酸可与其保守交换伙伴交换(见下文)，而不存在这种情况，即相比于未修饰的肽，与人类主要组织兼容性复合体(MHC)–I或II类分子的能力基本上被改变或受到不利影响。

这些基本不与T细胞受体互动的氨基酸残基可通过取代其他几乎不影响T细胞反应并不妨碍与相关MHC结合的氨基酸而得到修饰。因此，除了特定限制性条件外，本发明的肽可能为任何包括给定氨基酸序列或部分或其变体的肽(发明人所用的这个术语包括寡肽或多肽)。

表2：本发明肽的变体

较长(延长)的肽也可能适合。MHC I类表位(尽管通常为实际表位)是在加工过程中几乎不影响暴露实际表位所需蛋白裂解的残基。

本说明书的肽可被拉长多达四个氨基酸，即1、2、3或4个氨基酸可以以8至11个氨基酸长度的任意组合加至任一端，并通过从包含实际表位的较长肽或蛋白的肽加工而生成。优选侧翼的残基在4:0至0:44的范围内。本说明书的延长组合见表3。

表3：本发明肽的延长组合

C-端	N-端
		4	0
3	0或1
		2	0或1或2
1	0或1或2或3
		0	0或1或2或3或4
N-端	C-端
		4	0
3	0或1
		2	0或1或2
1	0或1或2或3
		0	0或1或2或3或4

延伸/延长的氨基酸可以是所述蛋白或任何其他氨基酸的原序列肽。延长可用于增强所述肽的稳定性或溶解性。

因此，本发明所述的表位可能与天然肿瘤相关表位或肿瘤特异性表位相同，也可能包括来自参考肽的不超过四个残基的不同肽，只要它们有基本相同的抗原活性即可。

在一项替代实施方案中，肽的一边或双边被延长4个以上的氨基酸，优选最多30个氨基酸的总长度。这可形成MHC-II类结合肽。结合至MHC II类肽可通过本领域中已知的方法进行测试。

因此，本发明提出了MHC I类表位的肽和变体，其中所述肽或抗体的总长度为8至100个、优选为8至30个、最优选为8至14个氨基酸长度(即10、11、12、13、14个氨基酸，如果为延长II类结合肽时，长度也可为15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸)。

当然，本发明的肽或变体能与人主要组织兼容性复合体(MHC)I或II类分子结合。肽或变体与MHC复合物的结合可用本领域内的已知方法进行测试。

优选情况是，当本发明的肽特异性T细胞相比于取代肽受到检测时，如果取代肽在相对于背景肽溶解度增加达到最大值的一半，则该肽浓度不超过约1mM，优选为不超过约1μM，更优选为不超过约1nM，再优选为不超过约100pM，最优选为不超过约10pM。也优选为，取代肽被一个以上的T细胞识别，最少为2个，更优选为3个。

肿瘤特异性TCR亲和力增强及其开发依赖于存在最佳TCR亲和力的窗口。这样窗口的存在是根据观察结果：HLA-A2限制性病原体特异性TCR与HLA-A2限制性肿瘤相关自身抗原特异性TCR相比，KD值通常大约低10倍(Aleksic et al.2012；Kunert et al.2013)。现已知，尽管肿瘤抗原可能具有免疫原性，但是因为肿瘤来自个体自身的细胞，因此仅突变蛋白质或翻译加工改变的蛋白将被免疫系统视为外来物质。上调或过度表达(所谓的自体抗原)的抗原不一定诱导针对肿瘤的功能免疫应答：表达对这些抗原具有高度反应性的TCR的T细胞会在一种称为中枢耐受的程序中在胸腺内被不利选择(Xing et al.2012；Ruella etal.2014；Sharpe et al.2015)，也就是说只有对自身抗原具有低亲和力TCR的细胞才仍然存在。因此，本说明书的TCR或变体对MAG-003的亲和力可通过本领域熟知的方法来增强。

“药物组合物”是指适合在医疗机构用于人体的组合物。优选地，药物组合物为无菌状态，并根据GMP指南生产。

药物组合物包括游离形式或以一种药用盐形式存在的肽(也参见上文)。此处使用的“药用盐”是指所公开的肽的一种衍生物，其中该肽由制酸或药剂的碱盐进行改性。例如，用与适合的酸反应的游离碱(通常其中的中性药物有一个中性–NH₂基团)制备酸式盐。适合制备酸盐的酸包括有机酸，如：乙酸、丙酸、羟基酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、甲磺酸、苯磺酸、水杨酸等等、以及无机酸，如：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等。相反，可在一种肽上提呈的酸性基团的碱盐制剂使用药用碱基进行制备，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、三甲胺等等。

本发明的另一实施方案涉及一种非天然肽，其中所述肽由或基本由根据SEQ IDNo:1的氨基酸序列组成，并经合成产生(即，合成)为一种药用盐。合成产生肽的方法是本领域公知的。本发明肽的盐与其体内状态的肽基本上不同，因为这些体内产生的肽不是盐。该肽的非天然盐形式介导肽的溶解度，特别是包含所述肽的药物组合物的情况下，例如，本文所公开的肽疫苗。为了向需治疗的受试者有效地提供肽，需要肽具有充分、至少基本的溶解度。优选地，盐为肽的药用盐。本发明的这些盐包括碱和碱土盐类，诸如Hofmeister系列的盐，包含阴离子PO₄ ^3-、SO₄ ^2-、CH₃COO^-、Cl^-、Br^-、NO₃ ^-、ClO₄ ^-、I^-、SCN^-和阳离子NH₄ ⁺、Rb⁺、K⁺、Na⁺、Cs⁺、Li⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺和Ba²⁺。特别地，盐选自(NH₄)₃PO₄、(NH₄)₂HPO₄、(NH₄)H₂PO₄、(NH₄)₂SO₄、NH₄CH₃COO、NH₄Cl、NH₄Br、NH₄NO₃、NH₄CIO₄、NH₄I、NH₄SCN、Rb₃PO₄、Rb₂HPO₄、RbH₂PO₄、Rb₂SO₄、Rb₄CH₃COO、Rb₄Cl、Rb₄Br、Rb₄NO₃、Rb₄CIO₄、Rb₄I、Rb₄SCN、K₃PO₄、K₂HPO₄、KH₂PO₄、K₂SO₄、KCH₃COO、KCl、KBr、KNO₃、KClO₄、KI、KSCN、Na₃PO₄、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、Na₂SO₄、NaCH₃COO、NaCl、NaBr、NaNO₃、NaCIO₄、NaI、NaSCN、ZnCI₂Cs₃PO₄、Cs₂HPO₄、CsH₂PO₄、Cs₂SO₄、CsCH₃COO、CsCl、CsBr、CsNO₃、CsCIO₄、CsI、CsSCN、Li₃PO₄、Li₂HPO₄、LiH₂PO₄、Li₂SO₄、LiCH₃COO、LiCl、LiBr、LiNO₃、LiClO₄、LiI、LiSCN、Cu₂SO₄、Mg₃(PO₄)₂、Mg₂HPO₄、Mg(H₂PO₄)₂、Mg₂SO₄、Mg(CH₃COO)₂、MgCl₂、MgBr₂、Mg(NO₃)₂、Mg(ClO₄)₂、MgI₂、Mg(SCN)₂、MnCl₂、Ca₃(PO₄),、Ca₂HPO₄、Ca(H₂PO₄)₂、CaSO₄、Ca(CH₃COO)₂、CaCl₂、CaBr₂、Ca(NO₃)₂、Ca(ClO₄)₂、CaI₂、Ca(SCN)₂、Ba₃(PO₄)₂、Ba₂HPO₄、Ba(H₂PO₄)₂、BaSO₄、Ba(CH₃COO)₂、BaCl₂、BaBr₂、Ba(NO₃)₂、Ba(ClO₄)₂、BaI₂和Ba(SCN)₂。特别优选为NH乙酸、MgCl₂、KH₂PO₄、Na₂SO₄、KCl、NaCl和CaCl₂，例如：氯化物或乙酸盐(三氟乙酸)盐。

在特别优选的实施方案中，药物组合物包括乙酸(醋酸盐)，三氟乙酸盐或盐酸(氯化物)形式的肽或TCR蛋白。

另一方面，本发明提出了一种编码本发明中肽或肽变体、TCR蛋白和TCR变体的核酸(如多聚核苷酸)。多聚核苷酸可以为，例如，DNA、cDNA、PNA、RNA或其组合物，它们可为单链和/或双链、或多聚核苷酸的原生或稳定形式(如：具有硫代磷酸骨架的多聚核苷酸)，并且只要它编码肽，就可能包含也可能不包含内含子。当然，多聚核苷酸只能编码加入天然肽键并含有天然氨基酸残基的肽。另一个方面，本发明提出了一种可根据本发明表达多肽的表达载体。

对于连接多核苷酸，已经开发出多种方法，尤其是针对DNA，可通过向载体补充可连接性末端等方法进行连接。例如，可向DNA片段加入补充性均聚物轨道，之后DNA片段被插入到载体DNA。然后，通过补充性均聚物尾巴的氢键结合，将载体和DNA片段结合，从而形成重组DNA分子。

含有一个或多个酶切位点的合成接头为DNA片段与载体连接提供了另一种方法。含各种限制性核酸内切酶的合成接头可通过多种管道购得，其中包括从国际生物技术公司(International Biotechnologies Inc,New Haven,康涅狄格州,美国)购得。

编码本发明多肽的DNA理想修饰方法是使用Saiki等人(Saiki et al.,1988)所采用的聚合酶链反应方法。此方法可用于将DNA引入合适的载体(例如，通过设计合适的酶切位点)，也可用于本领域已知的其他有用方法修饰DNA。如果使用病毒载体，痘病毒载体或腺病毒载体为优选。

之后，DNA(或在逆转录病毒载体情况下，RNA)可能表达于合适的宿主，从而制成含本发明肽或变体的多肽。因此，可根据已知技术使用编码本发明肽或变体的DNA，用本文所述方法适当修饰后，构建表达载体，然后表达载体用于转化合适宿主细胞，从而表达和产生本发明中的多肽。此类技术包括那些公开于，例如，美国专利4,440,859、4,530,901、4,582,800、4,677,063、4,678,751、4,704,362、4,710,463、4,757,006、4,766,075和4,810,648。

编码含本发明化合物多肽的DNA(或在逆转录病毒载体情况下，RNA)可能被加入到其他多种DNA序列，从而引入到合适的宿主中。同伴DNA将取决于宿主的性质、DNA引入宿主的方式、以及是否需要保持为游离体还是要相互结合。

一般来说，DNA可以适当的方向和正确的表达阅读框架附着到一种表达载体(如质粒)中。如有必要，该DNA可能与所需宿主所识别的相应转录和翻译调节控制核苷酸序列连接，尽管表达载体中一般存在此类控制功能。然后，该载体通过标准方法被引入宿主。一般来说，并不是所有的宿主都会被载体转化。因此，有必要选择转化过的宿主细胞。选择方法包括用任何必要的控制元素向表达载体插入一个DNA序列，该序列对转化细胞中的可选择性属性(如抗生素耐药性)进行编码。

另外，有这种选择属性的基因可在另外一个载体上，该载体用来协同转化所需的宿主细胞。

然后，本发明中的重组DNA所转化的宿主细胞在本文中所述本领域技术人员熟悉的合适条件下培养足够长的时间，从而表达之后可回收的肽。

有许多已知的表达系统，包括细菌(如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)、酵母(如酵母菌)、丝状真菌(如曲霉菌)、植物细胞、动物细胞及昆虫细胞。该系统可优选为哺乳动物细胞，如来自ATCC细胞生物学库(Cell Biology Collection)中的CHO细胞。

典型的哺乳动物细胞组成型表达载体质粒包括CMV或含一个合适的多聚A尾巴的SV40启动子以及抗性标志物(如新霉素)。一个实例为从Pharmacia公司(Piscataway，新泽西州，美国)获得的pSVL。一种可诱导型哺乳动物表达载体的例子是pMSG，也可以从Pharmacia公司获得。有用的酵母质粒载体是pRS403-406和pRS413-416，一般可从Stratagene Cloning Systems公司(La Jolla,加州92037，美国)获得。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合型质粒(YIp)，并插入了酵母可选择性标记物HIS3、TRP1、LEU2和URA3。pRS413-416质粒为酵母着丝粒质粒(Ycp)。基于CMV启动子的载体(如，来自于Sigma-Aldrich公司)提供了瞬时或稳定的表达、胞浆表达或分泌，以及FLAG、3xFLAG、c-myc或MATN不同组合物中的N-端或C-端标记。这些融合蛋白可用于检测、纯化及分析重组蛋白。双标融合为检测提供了灵活性。

强劲的人巨细胞病毒(CMV)启动子调控区使得COS细胞中的组成蛋白表达水平高达1mg/L。对于较弱的细胞株，蛋白水平一般低于0.1mg/L。SV40复制原点的出现将导致DNA在SV40复制容纳性COS细胞中高水平复制。例如，CMV载体可包含细菌细胞中的pMB1(pBR322的衍生物)复制原点、细菌中进行氨苄青霉素抗性选育的钙-内酰胺酶基因、hGH polyA和f1的原点。含前胰岛素原引导(PPT)序列的载体可使用抗FLAG抗体、树脂和板引导FLAG融合蛋白分泌到进行纯化的培养基中。其他与各种宿主细胞一起应用的载体和表达系统是本领域熟知众所周知的。

在另一个实施方案中，对本发明的两个或更多的肽或肽变体进行编码，因此，以一个连续顺序(类似于“一串珠子”的构建体)表达。在达到目标，所述肽或肽变体可能通过连接符氨基酸的延伸处(例如LLLLLL)连接或融合一起，也可能他们之间没有任何附加的肽而被连接。这些构建体也可用于癌症治疗，可诱导涉及MHC I和MHC II类分子的免疫应答。

本发明还涉及一种宿主细胞，其以本发明的多核苷酸载体构建转化而来。宿主细胞可为原核细胞，也可为真核细胞。在有些情况下，细菌细胞为优选原核宿主细胞，典型为大肠杆菌株，例如，大肠杆菌菌株DH5(从Bethesda Research Laboratories公司(Bethesda,马里兰州,美国)获得)和RR1(从美国菌种保藏中心(ATCC,Rockville,马里兰州,美国)，ATCC编号31343获得)。首选的真核宿主细胞包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞，优选为脊椎动物细胞，如：小鼠、大鼠、猴子或人成纤维细胞和结肠癌细胞株中的细胞。酵母宿主细胞包括YPH499、YPH500和YPH501，一般可从Stratagene Cloning Systems公司(LaJolla,CA 92037,美国)获得。首选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞为ATCC中的CCL61细胞、NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH/3T3为ATCC中的CRL 1658细胞、猴肾源性COS-1细胞为ATCC中的CRL 1650细胞以及人胚胎肾细胞的293号细胞。首选昆虫细胞为Sf9细胞，可用杆状病毒表达载体转染。有关针对表达选择合适宿主细胞的概要，可从教科书(Paulina Balbás and Argelia Lorence《Methods in Molecular Biology Re-combinantGene Expression,Reviews and Protocols》Part One,Second Edition,ISBN 978-1-58829-262-9)和技术人员知道的其他文献中查到。

含本发明DNA结构的适当宿主细胞的转化可使用大家熟知的方法完成，通常取决于使用载体的类型。关于原核宿主细胞的转化，请参见，例如，Cohen等人的文献(Cohen etal.,1972)和(Green and Sambrook,2012)。酵母细胞的转化在Sherman等人的文章(Sherman et al.,1986)中进行了描述。Beggs(Beggs,1978)中所述的方法也很有用。对于脊椎动物细胞，转染这些细胞的试剂等，例如，磷酸钙和DEAE-葡聚糖或脂质体配方，可从Stratagene Cloning Systems公司或Life Technologies公司(Gaithersburg,MD 20877，美国)获得。电穿孔也可用于转化和/或转染细胞，是本领域用于转化酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞和脊椎动物细胞大家熟知的方法。

被成功转化的细胞(即含本发明DNA结构的细胞)可用大家熟知的方法(如PCR)进行识别。另外，上清液存在的蛋白可使用抗体进行检测。

应了解，本发明中的某些宿主细胞用于制备本发明中的肽，例如细菌细胞、酵母细胞和昆虫细胞。但是，其他宿主细胞可能对某些治疗方法有用。例如，抗原提呈细胞(如树突状细胞)可用于表达本发明中的肽，使他们可以加加载相应的MHC分子中。因此，本发明提出了含本发明中核酸或表达载体的一种宿主细胞。

在一个优选实施方案中，宿主细胞为抗原提呈细胞，尤其是树突状细胞或抗原提呈细胞。2010年4月29日，美国食品和药物管理局(FDA)批准载有含前例腺酸性磷酸酶(PAP)的重组融合蛋白可用于治疗无症状或症状轻微的转移性HRPC(Rini et al.,2006；Smallet al.,2006)。

另一方面，本发明提出了一种配制一种肽及其变体的方法，该方法包括培养宿主细胞和从宿主细胞或其培养基中分离肽。

在另一个实施方案中，本发明中的TCR蛋白、核酸或表达载体用于药物中。例如，肽或其变体可制备为静脉(i.v.)注射剂、皮下(s.c.)注射剂、皮内(i.d.)注射剂、腹膜内(i.p.)注射剂、肌肉(i.m.)注射剂。肽注射的优选方法包括s.c.、i.d.、i.p.、i.m.和i.v.注射。DNA注射的优选方法为i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射。例如，给予50μg至1.5mg，优选为125μg至500μg的肽或DNA，这取决于具体的肽或DNA。上述剂量范围在以前的试验中成功使用(Walter et al.,2012)。

用于主动免疫接种的多聚核苷酸可为基本纯化形式，也可包被于载体或输送系统。核酸可能为DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能为其组合物。这种核酸的设计和引入方法为本领域所熟知。例如，文献中有其概述(Teufel et al.,2005)。多核苷酸疫苗很容易制备，但这些载体诱导免疫反应的作用模式尚未完全了解。合适的载体和输送系统包括病毒DNA和/或RNA，如基于腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺相关病毒或含一种以上病毒元素的混合病毒的系统。非病毒输送系统包括阳离子脂质体和阳离子聚合物，是DNA输送所属领域内熟知的系统。也可使用物理输送系统，如通过“基因枪”。肽或核酸编码的肽可以是一种融合蛋白，例如，含刺激T细胞进行上述CDR的表位。

本发明的药剂也可能包括一种或多种佐剂。佐剂是那些非特异性地增强或加强免疫反应的物质(例如，通过CD8-阳性T细胞和辅助T(T_H)细胞介导的对一种抗原的免疫应答，因此被视为对本发明的药剂有用。适合的佐剂包括(但不仅限于)1018ISS、铝盐、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、鞭毛蛋白或鞭毛蛋白衍生的TLR5配体、FLT3配体、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特resiquimod、ImuFactIMP321、白细胞介素IL-2、IL-13、IL-21、干扰素α或β，或其聚乙二醇衍生物、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、ISCOMs、LipoVac、MALP2、MF59、单磷酰脂A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、水包油和油包水乳状液、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、OspA、载体系统、基于聚丙交酯复合乙交酯[PLG]和右旋糖苷微粒、重组人乳铁传递蛋白SRL172、病毒颗粒和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、源自皂角苷、分支杆菌提取物和细菌细胞壁合成模拟物的Aquila公司的QS21刺激子，以及其他专有佐剂，如：Ribi's Detox、Quil或Superfos。优选佐剂如：弗氏佐剂或GM-CSF。前人对一些树突状细胞特异性免疫佐剂(如MF59)及其制备方法进行了描述(Allison and Krummel,1995)。也可能使用细胞因子。一些细胞因子直接影响树突状细胞向淋巴组织迁移(如，TNF-)，加速树突状细胞成熟为T淋巴细胞的有效抗原提呈细胞(如，GM-CSF、IL-1和IL-4)(美国5849589号专利，特别以其完整引用形式并入本文)，并充当免疫佐剂(如IL-12、IL-15、IL-23、IL-7、IFN-α、IFN-β)(Gabrilovich et al.,1996)。

据报告，CpG免疫刺激寡核苷酸可提高佐剂在疫苗中的作用。如果没有理论的约束，CpG寡核苷酸可通过Toll样受体(TLR)(主要为TLR9)激活先天(非适应性)免疫系统从而起作用。CpG引发的TLR9活化作用提高了对各种抗原的抗原特异性体液和细胞反应，这些抗原包括肽或蛋白抗原、活病毒或被杀死的病毒、树突状细胞疫苗、自体细胞疫苗以及预防性和治疗性疫苗中的多糖结合物。更重要的是，它会增强树突状细胞的成熟和分化，导致T_H1细胞的活化增强以及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)生成加强，甚至CD4T细胞说明的缺失。甚至有疫苗佐剂的存在也能维持TLR9活化作用诱发的T_H1偏移，这些佐剂如：正常促进T_H2偏移的明矾或弗氏不完全佐剂(IFA)。CpG寡核苷酸与以下其他佐剂或配方一起制备或联合给药时，表现出更强的佐剂活性，如微粒、纳米粒子、脂肪乳或类似制剂，当抗原相对较弱时，这些对诱发强反应尤为必要。他们还能加速免疫反应，使抗原剂量减少约两个数量级，在有些实验中，对不含CpG的全剂量疫苗也能产生类似的抗体反应(Krieg,2006)。美国6406705B1号专利对CpG寡核苷酸、非核酸佐剂和抗原结合使用促使抗原特异性免疫反应进行了描述。一种CpG TLR9拮抗剂为Mologen公司(德国柏林)的dSLIM(双干环免疫调节剂)，这是本发明药物组合物的优选成分。也可使用其他如TLR结合分子，如：RNA结合TLR7、TLR8和/或TLR9。

其他有用的佐剂例子包括(但不限于)化学修饰性CpG(如CpR、Idera)、dsRNA模拟物，如，Poly(I:C)及其衍生物(如：AmpliGen、Hiltonol、多聚-(ICLC)、多聚(IC-R)、多聚(I:C12U))、非CpG细菌性DNA或RNA以及免疫活性小分子和抗体，如：环磷酰胺、舒尼替单抗、西乐葆、NCX-4016、西地那非、他达拉非、伐地那非、索拉非尼、替莫唑胺、temsirolimus、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、VEGF Trap、ZD2171、AZD2171、抗-CTLA4、免疫系统的其他抗体靶向性主要结构(如：抗-CD40、抗-TGFβ、抗-TNFα受体)和SC58175，这些药物都可能有治疗作用和/或充当佐剂。技术人员无需过度进行不当实验就很容易确定本发明中有用的佐剂和添加剂的数量和浓度。

首选佐剂是抗-CD40、咪喹莫特、瑞喹莫德、GM-CSF、环磷酰胺、舒尼替尼、贝伐单抗、干扰素α、CpG寡核苷酸及衍生物、多聚(I:C)及衍生物、RNA、西地那非和PLG或病毒颗粒的微粒制剂。

本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂从含集落刺激因子制剂中选择，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭)、环磷酰胺、咪喹莫特、resiquimod和干扰素-α。

本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂从含集落刺激因子制剂中选择，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭)、环磷酰胺、咪喹莫特和resimiquimod。在本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂为环磷酰胺、咪喹莫特或resiquimod。更优选的佐剂是Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA50V、Montanide ISA-51、聚-ICLC和抗CD40mAB或其组合物。

此组合药物为非肠道注射使用，如皮下、皮内、肌肉注射，也可口服。为此，肽和其他选择性分子在药用载体中分解或悬浮，优选为水载体。此外，组合物可包含辅料，如：缓冲剂、结合剂、冲击剂、稀释剂、香料、润滑剂等。这些肽也可与免疫刺激物质合用，如：细胞因子。可用于此类组合物的更多辅料可在从A.Kibbe所著的Handbook of PharmaceuticalExcipients(Kibbe,2000)等书中获知。此组合药物可用于阻止、预防和/或治疗腺瘤或癌性疾病。例如，EP2112253中有示例制剂。

重要的是要认识到，通过本发明的疫苗引发的免疫应答在不同的细胞阶段和开发的不同阶段攻击癌症。而且不同的癌症相关信号通路被攻击。这相对于其他疫苗的优势，这些疫苗只针对一个或几个靶标，这可能会导致肿瘤很容易适应于攻击(肿瘤逃逸)。此外，并非所有的个体肿瘤都表达相同模式的抗原。因此，几个肿瘤相关肽的组合确保了每个肿瘤都承担至少一些靶标。该组合物以这样的方式设计，预期每个肿瘤可表达几种抗原并覆盖肿瘤生长和维持所需要的几种独立的途径。因此，疫苗可易于“现成的”用于较大患者群体。这意味着，预选择接受疫苗治疗的患者可限制为HLA分型，无需抗原表达的任何额外的生物标志物评估，但仍然确保多个靶标同时被诱导的免疫应答攻击，这对于疗效很重要(Banchereau et al.,2001；Walter et al.,2012)。

本文所用的“支架”一词是指与(如抗原)决定因子特异性结合的分子。在一项实施方案中，支架是能够引导其所连接的实体(例如，(第二)抗原结合部分)至目标靶点，例如，至特定类型的肿瘤细胞或承载抗原决定簇的肿瘤基质(如根据目前申请中肽和MHC的复合体)。在另一项实施例中，支架能够通过其靶抗原(例如T细胞受体复合体抗原)激活信号通路。支架包括但不限于抗体及其片段，抗体的抗原结合区，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区，结合的蛋白包括至少一个锚蛋白重复序列基元和单域抗原结合(SDAB)分子、适体、(可溶)TCR和(经修饰的)细胞，例如同种异体或自体T细胞。为了评估某个分子是否是结合至靶点的支架，可进行结合测定。

“特异”结合是指，与其他天然肽-MHC复合体相比，该支架与感兴趣的肽-MHC复合体更好地结合，结合程度为，拥有能够杀死承载特定靶点细胞的活性分子的支架不能够杀死无特定靶点但提呈一个或多个其他肽-MHC复合体的另一细胞。如果交叉反应性肽-MHC的肽并不是天然的，即，并非来自人HLA-多肽组，则结合至其他肽-MHC复合体是无关紧要的。评估靶细胞杀伤的测试在本领域中是公知的。它们应该含有未改变的肽-MHC提呈的靶细胞(原发细胞或细胞系)或载有肽的细胞进行，以便达到天然肽-MHC的水平。

各支架可包括一个标记，其通过确定是否存在或不存在卷标所提供的信号可检测到结合支架。例如，该支架可用荧光染料或任何其他适用的细胞标记分子进行标记。此类标记分子是本领域中公知的。例如，通过荧光染料进行的荧光标记可通过荧光或激光扫描显微术或流式细胞术提供结合适体的可视化。

各支架可与第二个活性分子(例如IL-21、抗CD3、抗CD28)共轭。

关于多肽支架的进一步信息，可参阅，例如，在WO 2014/071978A1背景技术部分，并作为参考文献引用。

本发明还涉及适体。适体(例如，参见WO 2014/191359及其中引用的文献)是短的单链核酸分子，其可以折迭为所定义的三维结构并识别特定的靶标结构。它们似乎是开发靶向治疗的合适替代方法。适体已显示可选择性与具有高亲和力和特异性的复合体靶标相结合。

识别细胞表面分子的适体在过去十年内已经确定，并为开发诊断和治疗方法提供了手段。由于适体已显示几乎无毒性和免疫原性，因此，它们是生物医学应用中有前景的候选物质。事实上适体，例如前例腺特异性膜抗原识别适体，已被成功地用于靶向治疗并在体内模型的异种移植物中显示出功能。此外，认识到特定肿瘤细胞系的适体也已确定。

可选择DNA适体来揭示各种癌细胞的广谱标识属性，特别是那些来自于实体瘤的细胞，而非致瘤和主要健康细胞不被识别。如果所识别的适体不仅识别肿瘤特异性子类型，而且与一系列肿瘤相互作用，这使适体适用于作为所谓的广谱诊断和治疗手段。

此外，用流式细胞仪对细胞结合行为的研究显示，适体在纳摩尔范围内显示出很好的亲和力。

适体用于诊断和治疗目的。此外，也可能显示，一些适体被肿瘤细胞吸取，因而可作为抗癌剂靶向递送的分子赋形剂，例如siRNA进入肿瘤细胞。

可针对复合体靶标选择适体，如复合体靶标为例如细胞和组织以及当前发明的肽与与MHC分子的复合体，使用细胞SELEX(通过指数富集的配体系统进化)技术。

本发明中的肽可用于生成和开发出针对MHC/肽复合物的特定抗体。这些抗体可用于治疗，将毒素或放射性物质靶向病变组织。这些抗体的另一用途是为了成像之目的(如PET)将放射性核素靶向病变组织。这可有助于检测小转移灶或确定病变组织的大小和准确位置。

因此，本发明的另一方面是提出产生特异性结合至与HLA限制性抗原络合的I或II类人主要组织兼容性复合体(MHC)的一种重组抗体的方法，该方法包括：用可溶形式的与HLA限制性抗原络合的(MHC)I或II类分子对包含表达所述主要组织兼容性说复合体(MHC)I或II类的基因工程非人哺乳动物进行免疫；将mRNA分子与产生所述非人哺乳动物细胞的抗体分离；产生一个噬菌体显示库，显示由所述mRNA分子编码的蛋白分子；以及将至少一个噬菌体与所述噬菌体显示库分离，所述的至少一个噬菌体显示所述抗体特异性地结合至与HLA限制性抗原络合的所述人主要组织兼容性说复合体(MHC)I或II类。

本发明的另一方面提出一种抗体，其特异性结合至与一种HLA限制性抗原络合的I或II类人主要组织兼容性说复合体(MHC)，其中该抗体优选为多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体和/或嵌合抗体。

产生这种抗体和单链I类主要组织兼容性复合物的相应方法，以及产生这些抗体的其他工具在WO 03/068201、WO 2004/084798、WO 01/72768、WO 03/070752以及出版物(Cohen et al.,2003a；Cohen et al.,2003b；Denkberg et al.,2003)中进行了披露，为了本发明之目的，所有参考文献通过引用被完整地并入本文。

优选地，该抗体与复合体的结合亲和力低于20纳摩尔，优选为低于10纳摩尔，这在本发明情况下也被视为具有“特异性”。

本发明涉及与SEQ ID NO:1特异性结合的TCR蛋白或其变体或功能片段。本说明书进一步涉及本说明书的TCR蛋白，其中该TCR蛋白(在化学上)被修饰和/或包含非肽键。

本发明进一步涉及一种核酸，其编码本发明所述的TCR蛋白，前提是该TCR蛋白并非完整(完全)的人蛋白。

本发明进一步涉及一种本发明的核酸，为DNA、cDNA、PNA、RNA或其组合。

本发明进一步涉及一种能表达或表达本发明核酸的表达载体。

本发明进一步涉及本发明的TCR蛋白、本发明的核酸或本发明的表达载体在药物中的用途，特别是用于治疗胃癌、结直肠癌和/或胶质母细胞瘤。

本发明进一步涉及含本发明核酸或本发明表达载体的宿主细胞。

本发明进一步涉及本发明的宿主细胞，其为T细胞，优选为CD8阳性T细胞或CD4阳性T细胞。

本发明进一步涉及制备本发明TCR蛋白的方法，所述方法包括用A2/IGF2BP3-001(SEQ ID NO:1)单体从HLA-A*02阴性健康供体孵育PBMC，用四聚体-藻红蛋白(PE)孵育PBMC并通过荧光启动细胞分选(FACS)方法–Calibur分析分离高亲和力T细胞。

本说明书还涉及一种识别和分离本发明TCR蛋白的一种方法，所述方法包括：用A2/p286-1Y2L单体从HLA-A*02阴性健康供体孵育PBMC，用四聚体-藻红蛋白(PE)孵育PBMC并通过荧光启动细胞分选(FACS)方法–Calibur分析分离高亲和力T细胞。

本说明书还涉及一种识别和分离本发明TCR蛋白的一种方法，所述方法包括：用A2/p286-1Y2L9L单体从HLA-A*02阴性健康供体孵育PBMC，用四聚体-藻红蛋白(PE)孵育PBMC并通过荧光启动细胞分选(FACS)方法–Calibur分析分离高亲和力T细胞。

本说明书还涉及一种产生本发明TCR蛋白的一种方法，所述方法包括：获得含整个人体TCRαβ基因位点(1.1和0.7Mb)的转基因小鼠(其T细胞表达多样化人类TCR，用于补偿小鼠TCR缺乏)，用IGF2BP3-001对小鼠进行免疫处理，用四聚体-藻红蛋白(PE)孵育从转基因小鼠中获得的PBMC，并通过荧光启动细胞分选(FACS)方法–Calibur分析分离高亲和力T细胞。

本说明书还涉及一种产生本发明TCR蛋白的一种方法，所述方法包括：获得含整个人体TCRαβ基因位点(1.1和0.7Mb)的转基因小鼠(其T细胞表达多样化人类TCR，用于补偿小鼠TCR缺乏)，用p286-1Y2L对小鼠进行免疫处理，用四聚体-藻红蛋白(PE)孵育从转基因小鼠中获得的PBMC，并通过荧光启动细胞分选(FACS)方法–Calibur分析分离高亲和力T细胞。

本说明书还涉及一种产生本发明TCR蛋白的一种方法，所述方法包括：获得含整个人体TCRαβ基因位点(1.1和0.7Mb)的转基因小鼠(其T细胞表达多样化人类TCR，用于补偿小鼠TCR缺乏)，用p286-1Y2L9L对小鼠进行免疫处理，用四聚体-藻红蛋白(PE)孵育从转基因小鼠中获得的PBMC，并通过荧光启动细胞分选(FACS)方法–Calibur分析分离高亲和力T细胞。

本发明还涉及一种在靶细胞异常表达IGF2BP3-001的患者中杀伤靶细胞的方法，所述方法包括向患者施用有效量的本发明T细胞。

本说明书进一步涉及任何所述TCR、本说明书的一种核酸、本说明书的一种表达载体、本说明书的一种细胞、本说明书中的激活细胞毒性T淋巴细胞作为药剂或在制造药剂中的用途。本说明书进一步涉及一种根据本说明书的用途，其中药剂可有效抗癌。

本说明书进一步涉及本说明书中的用途，其中所述癌细胞选自胃癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、急性髓性白血病、幽门螺旋杆菌引起的MALT淋巴瘤、结肠癌/结直肠癌、胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、宫颈癌、人乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、肝癌、不同表型的脑肿瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)等白血病、肺癌、尤因氏肉瘤、子宫内膜癌、头颈部鳞状细胞癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、膀胱癌、卵巢癌、肾细胞癌、非典型脑膜瘤、乳头状甲状腺癌、脑肿瘤、涎腺导管癌、宫颈癌、结外型T/NK细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺和乳腺的恶性实体瘤、以及其他肿瘤。

本发明进一步涉及一种基于本发明肽的特定标志物蛋白和生物标志物，在此称为“靶标”，其可用于诊断和/或判断以上癌症，特别是胃癌、结直肠癌和胶质母细胞瘤的预后。本发明还涉及这些新靶点在癌症治疗中的用途。

本文中术语“抗体”为广义上的定义，既包括多克隆也包括单克隆抗体。除了完整或“全部”的免疫球蛋白分子，“抗体”这一术语还包括这些免疫球蛋白分子和人源化免疫球蛋白分子的片段(如，CDR、Fv、Fab和Fc片段)或聚合物，只要它们表现出本发明的任何期望属性(例如，胃癌、结直肠癌和胶质母细胞瘤标志物(多)肽的特异性结合、将毒素传递给癌症标志物基因表达水平增加时的胃癌、结直肠癌和胶质母细胞瘤和/或抑制胃癌、结直肠癌和胶质母细胞瘤标志物多肽的活性)。

只要有可能，本发明的抗体可从商业来源购买。本发明的抗体也可能使用已知的方法制得。技术人员会了解全长非小细胞肺癌标志物多肽或其片段可用于制备本发明的抗体。用于产生本发明抗体的多肽可部分或全部地由天然源经纯化而得，也可利用重组DNA技术生产。

本领域的技术人员会认识到，两种或两种以上不同集合的单克隆抗体或多克隆抗体能最大限度地增加获得一种含预期用途所需的特异性和亲和力(例如，ELISA法、免疫组织化学、体内成像、免疫毒素疗法)的抗体的可能性。根据抗体的用途，用已知的方法对其期望活性进行测试(例如，ELISA法、免疫组织化学、免疫治疗等；要获取产生和测试抗体的进一步指导，请参阅，例如，Greenfield,2014(Greenfield,2014))。例如，该抗体可用ELISA法或免疫印迹法、免疫组织化学染色福尔马林固定的癌组织或冰冻的组织切片进行检测。在初次体外表征后，用于治疗或体内诊断用途的抗体根据已知的临床测试方法进行检测。

此处使用的术语“单克隆抗体”是指从大量同质抗体中获得的一种抗体，即，由相同的抗体组成的抗体群，但可能少量提呈的自然突变除外。此处所述的单克隆抗体具体包括嵌合“抗体，其中一部分重链和/或轻链与从特定物种中获得的抗体或属于特定抗体类型和分类型抗体的相应序列相同(同质)，同时，剩余链与从其他物种中获得的抗体或属于特定抗体类型和子类型抗体的相应序列以及这些抗体的片段相同(同质)，只要他们表现出预期的拮抗活性(美国4816567号专利，其在此以其整体并入)。

本发明的单克隆抗体可能使用杂交瘤方法制得。在杂交瘤方法中，老鼠或其他适当的宿主动物，通常用免疫制剂以引发产生或能产生将特异性结合至免疫制剂的抗体。或者，淋巴细胞可在体外进行免疫。

单克隆抗体也可由DNA重组方法制得，如：美国4816567号专利所述。编码本发明单克隆抗体的DNA可很容易地使用传统程序进行分离和测序(例如：通过使用能与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。

体外方法也适用于制备单价抗体。抗体消化以产生抗体的片段，尤其是Fab片段，可以通过使用本领域已知的常规技术完成。例如，可以通过使用木瓜蛋白酶完成消化。木瓜蛋白酶消化的实施例在WO 94/29348和美国4342566号专利中有描述。抗体的木瓜蛋白酶消化通常产生两种相同的抗原结合性片段，称为Fab片段(每个片段都有一个抗原结合点)和残余Fc片段。胃蛋白酶处理产生一个F(ab')₂片段和一个pFc'片段。

抗体片段，不论其是否附着于其他序列，均可包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、删除、替换、或其他选择性修饰，但前提是，片段的活性与非修饰的抗体或抗体片段相比没有显著的改变或损害。这些修饰可提供一些额外的属性，如：删除/添加可与二硫键结合的氨基酸，以增加其生物寿命、改变其分泌特性等。在任何情况下，抗体片段必须拥有生物活性的特性，如：结合活性、调节结合域的结合力等。抗体的功能性或活性区域可通过蛋白特定区域的基因突变、随后表达和测试所表达的多肽进行确定。这些方法为本行业技术人员所熟知，可包括编码抗体片段的核酸的特定位点基因突变。

本发明的抗体可进一步包括人源化抗体或人抗体。非人(如：鼠)抗体的人源化形式为嵌合抗体免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如：Fv、Fab、Fab'或抗体的其他抗原结合序列)，其中包含从非人免疫球蛋白中获得的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(如具有与其特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠或兔子)CDR的残基取代。在某些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架(FR)残基被相应的非人残基取代。人源化抗体可能还包括既非受体抗体、也非输入CDR或框架序列中发现的残基。一般来说，人源化抗体将包括几乎所有的至少一个、通常为二个可变域，其中，全部或几乎全部的CDR区域均对应于非人免疫球蛋白的区域并且全部或几乎全部的FR区域均为人免疫球蛋白相同序列的区域。理想情况是，人源化抗体还将包括至少免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的一部分。

人源化非人抗体的方法为本行业所熟知。一般来说，人源化抗体具有一个或多个从非人源头引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基往往被称为“输入”残基，通常从“输入”可变域中获得。人源化基本上可以通过将啮齿动物CDR或CDR序列取代为相应的人抗体序列而完成。因此，这种“人源化”抗体为嵌合抗体(美国4816567号专利)，其中大大少于完整的人可变域被来自于非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常为人抗体，其中有些CDR残基以及可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代。

可使用免疫后在内源性免疫球蛋白产生缺失时能产生完整人抗体的转基因动物(如：小鼠)。例如，它被描述为，嵌合和种系突变小鼠中的抗体重链连接区域基因的纯合性缺失导致内源性抗体生成的完全抑制。在此种系变种小鼠中人种系免疫球蛋白基因数组的转移在抗原挑战后将导致人抗体的生成。人抗体也可在噬菌体展示库中产生。

本发明的抗体优选为通过药用载体的形式给予受试者。通常，在制剂中使用适量的药用盐，以使制剂等渗。药用载体的例子包括生理盐水、林格氏液和葡萄糖溶液。溶液的pH值优选为约5至8，更优选为约7至7.5。此外，载体还包括缓释制剂，如：含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，其中基质为有形物品形式，如：薄膜、脂质体或微粒。本行业的技术人员熟知，某些载体可能为更优选，取决于例如，抗体的给药途径和浓度。

该抗体可通过注射(如：静脉内、腹腔内、皮下、肌肉内)或通过输注等其他方法给予受试者、患者或细胞，确保其以有效的形式传输到血液中。这些抗体也可以通过瘤内或瘤周途径给予，从而发挥局部和全身的治疗作用。局部或静脉注射为优选。

抗体给药的有效剂量和时间表可根据经验确定，并且作出此类决定属本行业的技术范围内。本行业的技术人员会明白，必须给予的抗体剂量根据以下因素会有所不同，例如：接受抗体的受试者、给药途径、使用的抗体以及其他正在使用的药物的特定类型。单独使用的抗体的通常日剂量可能为约1μg/kg至最多100mg/kg体重或更多，这取决于上述因素。给予抗体，优选为治疗非小细胞肺癌后，治疗抗体的疗效可通过技术人员熟知的不同方法评估。例如：接受治疗的受试者癌症的大小、数量和/或分布可使用标准肿瘤成像技术进行监测。因治疗而给予的抗体与不给予抗体时的病程相比，可阻止肿瘤生长、导致肿瘤缩小、和/或阻止新肿瘤的发展，这样的抗体是一种有效治疗癌症的抗体。

本发明的另一方面提出了制备识别特异性肽-MHC复合物的可溶性T细胞受体(sTCR)的一种方法。这种可溶性T细胞受体可从特异性T细胞克隆中产生，并且它们的亲和力可以通过互补决定区靶向诱变而增加。为了T细胞受体选择之目的，可以使用噬菌体展示(美国2010/0113300，(Liddy et al.,2012))。为了在噬菌体展示期间以及实际使用为药物时稳定T细胞受体之目的，可通过非天然二硫键、其他共价键(单链T细胞受体)或通过二聚化结构域连接α和β链(Boulter et al.,2003；Card et al.,2004；Willcox et al.,1999)。T细胞受体可以连接到毒素、药物、细胞因子(参见US 2013/0115191)、域招募效应细胞，如抗CD3域等，以便对靶细胞执行特定的功能。此外，它可能表达于用于过继转移的T细胞。进一步的信息可在WO 2004/033685A1和WO 2004/074322A1中找到。sTCR的组合在WO 2012/056407A1中进行了描述。WO 2013/057586A1中公开了制备的进一步的方法。

此外，可用本发明的肽和/或TCR或抗体或其他结合分子在活检样本的基础上验证病理师对癌症的诊断。

该抗体或TCR也可用于体内诊断实验。一般来说，抗体用放射性核素标记(如：¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹⁴C、¹³¹I、³H、³²P或³⁵S)，从而可免疫闪烁扫描法使肿瘤局限化。在一实施方案中，其中的抗体或片段与两个或两个以上选自包括上述蛋白的组的蛋白质靶目标细胞外域结合，并且亲和力值(Kd)低于1x10μM。

诊断用抗体可通过各种影像学方法使用适合检测的探针进行标记。探针检测方法包括但不限于，荧光、光、共聚焦和电镜方法；磁共振成像和光谱学技术；透视、计算机断层扫描和正电子发射断层扫描。合适的探针包括但不限于，荧光素、罗丹明、曙红及其它荧光团、放射性同位素、黄金、钆和其他稀土、顺磁铁、氟-18和其他正电子发射放射性核素。此外，探针可能是双功能或多功能的，并且用一种以上的上述方法可进行检测。这些抗体可用所述的探针直接或间接进行标记。抗体探针的连接，包括探针的共价连接、将探针融合入抗体、以及螯合化合物的共价连接从而结合探针、以及其他本行业熟知的方法。对于免疫组织化学方法，疾病组织样本可能是新鲜或冷冻或可能包埋于石蜡中以及用福尔马林等防腐剂固定。固定或包埋的切片包括与标记一抗和二抗接触的样本，其中该抗体用于检测原位蛋白的表达。

通过以下实施例对本发明作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。为了本发明之目的，所有参考文献均以完整引用的形式并入本文。

附图说明

图1显示了正常组织和癌症中IGF2BP3-001肽的提呈。

图2-4显示了癌症和正常组织中IGF2BP3-001的表达。

图5显示了IGF2BP3对HLA-A*02:01的亲和力。IGF2BP3和对照肽MUC-001(中间粘合蛋白)和MET-001(强粘合蛋白)的解离常数(KD)用基于ELISA的测定法测量。

图6显示了IGF2BP3mRNA在所有评估的癌症样本中均可检测到，如实施例6所示。表达水平范围为在结直肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和食管癌样本(CCA001T、CCA006T、HNSCC017T1、NSCLC004T1、NSCLC005T1、OC038T、OSCAR052T1和OSCAR055T1)样本表达尚可，在胰腺癌样本(PC002T)中表达相当低。

实施例

HLA结合

SYFPEITHI常规(Rammensee et al.,1997；Rammensee et al.,1999)预测KIQEILTQV(SEQ ID NO:1)与A*02:01结合，绝对分数为27，相对分数为0.74。肽IGF2BP3-001提呈于癌细胞上，具体如下：

表5：IGF2BP3-001提呈频率

IGF2BP3-001在≥380个HLA-A*02阳性肿瘤样本中定量，包括16种不同的癌症类型和>240个不同来源正常组织样本，涵盖所有风险类别，重点是高风险和中风险器官(状态：2015年8月)。图1显示了这些组织中IGF2BP3-001的相对肽提呈水平。IGF2BP3-001经常且仅在不同实体的原发性肿瘤样本上发现，而不在正常组织上发现。因此，IGF2BP3-001靶标在HLA-A*02的背景下以高度肿瘤特异性的方式提呈。

图5所示的数据进一步提供证据表明，IGF2BP3-001是与HLA-A*02:01结合非常良好的肽。

当与来自自体情况(即患者)的T细胞相比时，异体反应性环境可用于规避自身耐受性并产生具有更高亲合力的T细胞。此类环境的实例包括体外产生异体HLA反应性肽特异性T细胞(Sadovnikova et al.1998；Savage et al.2004；Wilde et al.2012)和用人-MHC或人TCR的转基因小鼠进行免疫(Stanislawski et al.2001；Li et al.2010)。

实施例1

体外产生异体HLA反应性肽特异性T细胞(Sadovnikova et al.2004)

获得知情同意后，使用来自HLA-A*02阳性和HLA-A*02阴性健康供体的PBMC。从MBLI中获得含有IGF2BP3-001的重组生物素化HLA-A2I类单体和A2荧光四聚体。将PBMC使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释的抗CD20SA室温下孵育1小时，洗涤，并使用生物素化的A2/IGF2BP3-001单体室温下温育30分钟，洗涤并在具有10％人AB血清的RPMI中用24孔板以3×10⁶个细胞/孔进行铺板。第1天以10ng/mL加入白细胞介素7(IL-7；R&D Systems,Minneapolis,MN)，第4天以10U/mL加入IL-2(Chiron,Harefield,United Kingdom)。在5周的期间，每周用新鲜的PBMC对细胞进行再刺激，用1:1的比例与应答细胞混合，并在24孔板中以3×10⁶/孔进行铺板。

为了获得高亲合力T细胞，将大约10⁶个含有HLA-A2/IGF2BP3-001四聚体-藻红蛋白(PE)(获得自MBLI)的PBMC 37℃下孵育30分钟，随后用抗CD8-异硫氰酸荧光素(FITC)/别藻蓝蛋白(APC)在4℃下孵育20分钟，然后进行荧光激活细胞分选(FACS)-Calibur分析。用FACS-Vantage(Becton Dickinson,Cowley,Oxford,United Kingdom)进行分选。分选的四聚体阳性细胞在24孔板中扩增，方法为每孔2x10⁵个分选细胞、2x10⁶个经照射的A2阴性PBMC作为进料、2x10⁴CD3/CD28珠/mL(Dynal,Oslo Norway)和IL-2(1000U/mL)。然后使用如此获得的高亲合力T细胞，采用本领域已知的技术鉴定和分离TCR，例如单细胞5'RACE(cDNA末端快速扩增)。然后使用本领域熟知的方法分析非冗余TCR DNA用于氨基酸/DNA序列测定将其克隆到表达载体中。

实施例2：TCR的克隆

克隆TCR的方法是本领域已知的，例如，如美国专利8,519,100中所述，其全部内容通过引用并入本文用于所述方法。编码限制性位点NdeI(用于在细菌中有效启动表达的被引入的甲硫氨酸)的α链可变区序列特异性寡核苷酸A1(ggaattccatatgagtcaacaaggagaagaagatccSEQ ID NO:11)，和编码限制性位点SalI的α链恒定区序列特异性寡核苷酸A2(ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacgSEQ ID NO:12)被用于扩增α链可变区。在β链的情况下，编码限制性位点，如NdeI(用于在细菌中有效启动表达的被引入的甲硫氨酸)的β链可变区序列特异性寡核苷酸B1(tctctcatatggatggtggaattactcaatccccaaSEQ ID NO:13)和编码限制性位点，如AgeI的β链恒定区序列特异性寡核苷酸B2(tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggcSEQ ID NO:14)被用于扩增β链可变区。

从三个健康供体的T细胞中分离和克隆的三种TCR(R10P1A7、R13P1C6和R18P1C12)，每种编码肿瘤特异性TCR-α和TCR-β链。TCR R18P1C12衍生自HLA-A2阳性供体，TCR R10P1A7和TCR R13P1C6衍生自HLA-A2阴性供体。

对TCR的α和β可变区进行测序。然后，通过(Molecular Cloning a LaboratoryManual Third edition by Sambrook and Russell)中描述的标准方法将TCRα和β可变区克隆到含有Cα或Cβ(分别)的基于pGMT7的表达质粒中。使用Applied Biosystems3730x1DNA分析仪对质粒进行测序。

将用NdeI和SalI切割的编码TCRα链的DNA序列连接到用NdeI和XhoI切割的pGMT7+Cα载体中。将用NdeI和AgeI切割的编码TCRβ链的DNA序列连接到用NdeI和AgeI切割的单独pGMT7+Cβ载体中。将结合的质粒转化为感受态大肠杆菌菌株XL1-blue细胞中，并在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB/琼脂板上铺板。在37℃孵育过夜后，挑取单个菌落，并在含有100μg/ml氨苄青霉素的10ml LB中摇荡培养过夜。使用Miniprep试剂盒(Qiagen)纯化克隆的质粒，并使用自动DNA测序仪(Lark Technologies)对插入片段进行测序。

噬菌体展示技术可用于产生TCR变体库，以识别高亲和力突变。(Li et al,(2005)Nature Biotech 23(3):349-354)一文中描述的TCR噬菌体展示技术和筛选方法可应用于参考TCR。

例如，α链序列的所有三个CDR区以及β链序列的所有三个CDR区可以通过诱变进行靶向作用，并且每个CDR库单独进行筛选。

因此，可鉴定亲和力和/或结合半衰期至少是参考TCR两倍的TCR(暗示至少是天然TCR的两倍)。

使用包括在恒定区中引入半胱氨酸的方法重新折叠TCR异二聚体，以提供人造链间二硫键。使用这种方式制备了TCR，其由以下组成：(a)参考TCRβ链以及突变的α链；(b)参考TCRα链以及突变的β链；和(c)β和α链的各种组合，包括突变可变结构域。

可以使用BIAcore方法分析高亲和力可溶性二硫键连接的TCR和TCR变体以及天然肽KIQEILTQV(SEQ ID NO:1)HLA-A*02复合体之间的相互作用。

高亲合力TCR变体也可以通过酵母或T细胞展示技术从CDR突变体库中选择(Holler et al.2003；Chervin et al.2008)。因此，候选TCR变体为设计TCR CDR突变提供了指导，以获得高亲和力TCR变体(Robbins et al.2008；Zoete et al.2007)。

实施例3：自体T细胞工程技术

T细胞可进行工程化处理以表达高亲合力TCR(所谓的TCR疗法)或蛋白融合衍生的嵌合抗原受体(CAR)，增强了对MHC I/IGF2BP3-001复合体或MHC II/IGF2BP3-001复合体的抗原特异性。一方面，该方法克服了与中枢和外周耐受性相关的一些限制，并且生成在靶向作用于肿瘤更有效的T细胞，而不需要患者进行新的T细胞活化。

一方面，为了获得表达本说明书TCR的T细胞，编码肿瘤特异性TCR-α和/或TCR-β链的核酸(按实施例1-2中所述进行鉴定和分离)被克隆入表达载体，诸如γ逆转录病毒或慢病毒。重组病毒产生，然后测试功能，如抗原特异性和功能性亲合力。然后，最终产品的等分试样被用于转导靶T细胞群体(一般纯化自患者的PBMC)，在输入患者前展开。

另一方面，为了获得表达本说明书TCR的T细胞，TCR RNA通过本领域中已知的技术(例如，体外转录系统)合成。然后，体外合成的TCR RNA通过电穿孔来重新表达肿瘤特异性TCR-α和/或TCR-β链被引入获得自健康供体的原代CD8+T细胞。

为了测试外源性TCR在转化T细胞的细胞表面是否功能性地表达，使用四聚体染色技术检测MHC/IGF2BP3-001结合T细胞。如图5和表6所示，采用荧光标记的MHC/IGF2BP3-001四聚体染色观察到CD3阳性特异性T细胞群体在TCR表达性CD8+T细胞中的比例(6.78％)(TCR R10P1A7)和16.54％(TCR R13P1C6)高于使用MHC/不相关肽(例如，NYESO1-001)四聚体(1.53％)或模拟对照(1.73％)的比例。作为对照，已知与MHC/NYESO1-001复合体特异性结合的无关TCR(如：1G4TCR)所转化的原代CD8+ T细胞更容易被MHC/NYESO1-001四聚体检测到(17.69％)。这些结果表明TCR R10P1A7和TCR R13P1C6在T细胞表面表达，并可特异性结合于MHC/IGF2BP3-001复合体。

为了确定TCR是否诱导MHC/IGF2BP3-001特异性细胞毒活性，将转化的CD8+ T细胞与载有IGF2BP3-001的靶细胞或载有相似但无关肽的靶细胞或对照物(例如，仅未载有靶细胞和CD8+ T细胞)进行共培育，然后进行IFN-γ释放测定。CD8+ T细胞分泌IFN-γ提示具有细胞毒活性的T细胞活化。

表6

在与载有IGF2BP3-001的靶细胞共培育后，用本次公开资料中TCR转化的所有原代CD8+ T细胞释放的IFN-γ水平不相关加载肽靶细胞和对照细胞刺激的水平高得多。靶向肽滴定分析显示了～1nM(TCR R10P1A7)和～0.8nM(TCR R13P1C6)时的EC50。这些结果表明，通过与MHC/IGF2BP3-001复合体的特异性相互作用，本发明的TCR可激活细胞毒性T细胞活性，例如IFN-γ释放。

为了确定MHC/IGF2BP3-001复合体的TCR的结合基序，在IGF2BP3-001肽的9个氨基酸的每一个上均进行丙氨酸定位扫描分析。丙氨酸取代的IGF2BP3-001肽如表7所示。

表7

简而言之，各TCR转化的T细胞与载有IGF2BP3-001、IGF2BP3-001-A1至IGF2BP3-001-A9或不相关NYESO1-001肽共同培育，随后进行IFNγ释放测定，如上所述。

TCR R10P1A7和TCR R13P1C6的丙氨酸定位扫描分析结果归纳于表8中。

表8

TCR	IGF2BP3-001的位置可促使TCR结合
		R10P1A7	1,3-7
R13P1C6	3-6

具有相同基序的A*02结合肽的全基因组筛选显示，无潜在交叉反应性肽。这些结果表明IGF2BP3-001的第3-6位置对于TCR R10P1A7和TCR R13P1C6结合可能是重要的。

为了确定本文所述的T细胞表达TCR的功效，用TCR R10P1A7转化的原代CD8+ T细胞与人癌细胞系共同培育，例如，HLA-A2阳性和IGF2BP3-001(靶向)阳性的A-375(人黑色素瘤细胞系)和T98G(人成胶质细胞瘤细胞系)以及HLA-A2阳性、IGF2BP3-001阴性的SK-BR-3(人乳腺癌细胞系)，然后进行IFNγ释放测定。

在HLA-A2阳性、IGF2BP3-001阳性的A-375和T98G细胞中观察到IFN-γ释放，但在SK-BR-3细胞中并非如此，其具有基础水平的IFN-γ释放，这与效应细胞具有可比性。这些结果表明，表达TCR R10P1A7的T细胞可以HLA-A2/IGF2BP3-001特异性的方式特异性地诱导靶向作用于癌细胞的细胞毒活性。

本说明书提出了可用于治疗癌症/肿瘤(优选为过度提呈或只提呈IGF2BP3-001的黑色素瘤和胶质母细胞瘤)的TCR。

实施例5：同种异体T细胞工程技术

γδT细胞是涉及抗病原体第一道防线的非常规T淋巴细胞效应子，可以通过激活受体等、TCR-γ和TCR-δ链以MHC无关的方式与肿瘤细胞相互作用并根除肿瘤细胞。这些γδT细胞显示出预活化的表型，其在激活后可快速产生细胞因子(IFN-γ、TNF-α)和发生强细胞毒性反应。这些T细胞对许多癌症具有抗肿瘤活性，并表明γδT细胞介导的免疫治疗是可行的并且可诱导客观的肿瘤反应。(Braza et al.2013)。

使用固定化抗原、激动单克隆抗体(mAb)，肿瘤衍生的人造抗原呈递细胞(aAPC)或活化mAb和aAPC的组合的最新进展已成功地用寡克隆或多克隆TCR扩增γδT细胞谱。例如，固定化的主要组织相容性复合体I类链相关A是表达TCRδ1同种型的γδT细胞的刺激物，且板结合活化抗体已经离体扩增了Vδ1和Vδ2细胞。在aAPC上共培养后，产生了临床上足够量的TCRδ1、TCRδ2和TCRδ1^negTCRδ2^neg，并且这些亚组在体外和体内显示出记忆表型和对肿瘤反应性的差异。(Deniger et al.2014)。

另外，通过引入TCR-α和TCR-β链可以证明γδT细胞适于遗传修饰。(Hiasa etal.2009)。本说明书的另一方面涉及表达与IGF2BP3-001结合的TCR-α和TCR-β的γδT细胞的产生。为此，γδT细胞通过Deniger et al.2014所述的方法扩增，接着将表达与IGF2BP3-001结合(如实施例3所述)的TCR的重组病毒转导入扩增的γδT细胞。然后将病毒转导的γδT细胞输注入患者。

实施例6：mRNA表达

使用原位杂交(ISH)技术直接在福尔马林固定的或冷冻的组织切片中检测mRNA表达。由于其高灵敏度和空间分辨率，它是一种合适的方法来确定细胞类型特异性靶标表达和癌组织切片内靶标表达的分布或频率。

使用Advanced Cell Diagnostics(ACD)开发的技术进行ISH检测IGF2BP3 mRNA。技术基于大约20对Z形寡核苷酸探针与靶序列的杂交。信号扩增通过分支DNA扩增实现，该扩增基于寡核苷酸的多个杂交步骤，最终构建分支DNA(bDNA)树。最后，大量的标记探针与bDNA树的分支杂交，并可检测增强的信号。显色检测试剂盒(RED)包括与酶(碱性磷酸酶)连接的标记探针。信号检测取决于显色底物FastRed的酶转化，它会额外放大原始信号。是一种非常灵敏的技术，这是因为信号放大过程高效，与高灵敏度配对且Z探针对与靶标mRNA强大结合，即使被部分交联或降解。根据ACD的说明，20个探针对中的3对与每个单个RNA分子结合足以产生可检测的ISH信号。

每个ISH实验细分为两个方法学过程：1)用于靶标修复的组织预处理，以及2)靶标杂交、信号放大和检测。最佳的预处理条件对于在FFPE组织切片中成功进行靶标检测至关重要。固定过程诱导细胞和组织中蛋白质、DNA和RNA的交联，从而掩盖杂交位点。因此，为了确保靶标mRNA的可取性和探针组的适当结合，这些交联必须在靶杂交之前除去。组织预处理包括三个不连续的步骤：1)通过过氧化氢处理阻断内源碱性磷酸酶，2)通过在靶标修复试剂中煮沸进行靶标修复，以及3)通过蛋白酶消化进行靶标修复。由于不同FFPE块之间的固定和交联程度可能不同，因此必须通过实验确定每个FFPE块的最佳靶标修复条件。因此，将组织切片展开至不同的煮沸和蛋白酶消化时间，随后与阳性和阴性对照探针组杂交。通过显微镜评估阳性对照中的特异性信号强度、阴性对照中的非特异性背景和组织形态学来确定最佳条件。根据制造商的方案进行组织预处理。预处理试剂包含在试剂盒中。在完成不同的预处理步骤之后，通过特异性探针组与相关mRNA杂交以及随后的分支DNA信号扩增和显色或荧光信号检测来评估靶标表达。根据制造商的方案进行所有的测定。

表9：mRNA表达(见图6)

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序列表

<110> 伊玛提克斯生物技术有限公司

<120> 用于癌症免疫治疗的肽和肽组合物

<130> I32953WO

<150> GB 1604490.1

<151> 2016-03-16

<150> US 62/309,107

<151> 2016-03-16

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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tagaaaccgg tggccaggca caccagtgtg gc 32

Claims (41)

1.一种肽及其药用盐，所述肽由SEQ ID No.1的氨基酸序列、以及与SEQ ID No.1具有至少88％同源性的其变体序列组成，其中变体肽与主要组织兼容性复合体(MHC)结合和/或诱导T细胞与该变体肽发生交叉反应，其中所述肽不是全长多肽。

2.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽具有与MHC-I或-II类分子结合的能力，其中所述肽与MHC结合时能够被CD4和/或CD8T细胞识别。

3.根据权利要求1或2所述的肽或其变体，其中氨基酸序列包括SEQ ID No.1的连续氨基酸延伸区段。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的肽或其变体，其中所述肽或其变体的总长度为8至100个氨基酸、优选为8至30个氨基酸、更优选为8至16个氨基酸、最优选为该肽由或基本由SEQ ID No.1的氨基酸序列组成。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的肽或其变体，其中所述肽被修饰，和/或包含非肽键。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的肽或其变体，其中所述肽为融合蛋白的一部分，尤其包含HLA-DR抗原相关不变链(Ii)的N-端氨基酸。

7.一种核酸，其编码权利要求1至6中任一项所述的肽或其变体，任选地与异源启动子序列连接。

8.一种表达载体，其能够表达或表达权利要求7所述的核酸。

9.一种重组宿主细胞，其包括权利要求1至6中任一项所述的肽、权利要求7所述的核酸、或权利要求8所述的表达载体，其中所述宿主细胞优选为抗原提呈细胞，例如树突状细胞。

10.一种用于制备权利要求1至6中任一项所述的肽或其变体的方法，所述方法包括培养权利要求9所述的宿主细胞，以及从所述宿主细胞和/或其培养基中分离出所述肽或其变体，其中权利要求9所述的宿主细胞提呈权利要求1至6所述的肽或表达权利要求7所述的核酸或包含权利要求8所述的表达载体。

11.一种体外制备激活的T淋巴细胞的方法，该方法包括将T细胞与载有抗原的人I或II类MHC分子体外接触一段时间，该时间足以以抗原特异性的方式激活T细胞，人I或II类MHC分子在合适的抗原提呈细胞表面或模拟抗原提呈细胞的人工构建体的表面上表达，其中所述抗原为权利要求1至4中任一项所述的肽。

12.一种激活的T淋巴细胞，由权利要求11所述的方法制成，其有选择性地识别一种细胞，该细胞提呈含权利要求1至4中任一项给定氨基酸序列的多肽。

13.一种杀灭患者中靶细胞的方法，其中该靶细胞提呈含有权利要求1至4中任一项给出的氨基酸序列的多肽，所述方法包括向患者施用有效量的权利要求12所述的激活T细胞。

14.一种抗体，特别是可溶性或膜结合性抗体，其特异性地识别权利要求1至5中任一项所述的肽或其变体，优选为与MHC分子结合时的权利要求1至5中任一项所述的肽或变体。

15.权利要求1至6中任一项所述的肽或其变体、权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体、权利要求9所述的宿主细胞、或权利要求12所述的激活的T淋巴细胞、或权利要求14所述的抗体在药物中的用途。

16.权利要求1至6中任一项所述的肽或其变体、权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体、权利要求9所述的宿主细胞、或权利要求12所述的激活的T淋巴细胞、或权利要求14所述的抗体在癌症诊断和/或癌症治疗或抗癌药物制备中的用途。

17.根据权利要求16所述的权利要求1至6中任一项所述的肽或其变体、权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体、权利要求9所述的宿主细胞、或权利要求12所述的激活的T淋巴细胞、或权利要求14所述的抗体的用途，其中所述癌症选自胃癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、急性髓性白血病、幽门螺旋杆菌引起的MALT淋巴瘤、结肠癌/结直肠癌、胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、宫颈癌、人乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、肝癌、不同表型的脑肿瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)等白血病、肺癌、尤因氏肉瘤、子宫内膜癌、头颈部鳞状细胞癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、膀胱癌、卵巢癌、肾细胞癌、非典型脑膜瘤、乳头状甲状腺癌、脑肿瘤、涎腺导管癌、宫颈癌、结外型T/NK细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺和乳腺的恶性实体瘤、以及其他肿瘤，这些肿瘤过表达能够衍生得到SEQ ID No.1的肽的蛋白。

18.一种试剂盒，包括：

(a)容器，包含药物组合物，该药物组合物含有权利要求1至6中任一项所述的肽或其变体、权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体、权利要求9所述的细胞、或权利要求12所述的激活的T淋巴细胞、或权利要求14所述的抗体，以溶液或冻干的形式；

(b)任选地，第二个容器，其含有冻干剂型的稀释液或重构液；

(c)任选地，至少一种以上选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.10的肽，以及

(d)任选地，(i)使用溶液或(ii)重构和/或使用冻干剂型的说明书。

19.根据权利要求18所述的试剂盒，进一步包括一个或多个(iii)缓冲剂，(iv)稀释剂，(v)过滤液，(vi)针，或(v)注射器。

20.根据权利要求18或19所述的套件，其中所述肽选自SEQ ID No.1。

21.一种T细胞受体(TCR)或其片段，优选为可溶性或膜结合性TCR，其与HLA配体反应，其中所述配体与SEQ ID No.1氨基酸序列具有至少85％同一性，或者其中所述氨基酸序列由SEQ ID No.1组成。

22.根据权利要求21所述的T细胞受体，其中所述T细胞受体以可溶性分子提供并任选地具有其他效应子功能，如抗体片段、免疫刺激结构域或毒素。

23.根据权利要求21或22所述的T细胞受体，其中所述TCR是包含α和β链恒定结构域序列的α/β异源二聚体TCR，其中所述恒定结构域序列通过天然二硫键连接，如：在任一TRAC的外显子2的Cys4与TRBC1或TRBC2的外显子2的Cys2之间。

24.根据权利要求21至23中任一项所述的T细胞受体，其中所述TCR与可检测标记、治疗剂、PK修饰基团或其任意组合相关联。

25.根据权利要求24所述的T细胞受体，其中所述治疗剂是与所述TCRα或β链的C或N端共价连接的CD3抗体。

26.一种核酸，或一种能够表达该核酸的表达载体，其编码权利要求21至25中任一项所述的T细胞受体，其任选与异源启动子序列连接。

27.一种宿主细胞，其包括权利要求26所述的核酸、或编码权利要求14所述的抗体的核酸、或权利要求26所述的表达载体，其中所述宿主细胞优选为T细胞或NK细胞。

28.一种用于制备权利要求21至24中任一项所述的T细胞受体的方法，所述方法包括培养权利要求27所述的宿主细胞，以及从宿主细胞和/或其培养基中分离所述T细胞受体。

29.一种用于产生用于个体患者的个性化抗癌疫苗或基于化合物的疗法和/或细胞疗法的方法，所述方法包括：

a)识别个体患者的肿瘤样本所提呈的肿瘤相关肽(TUMAP)；

b)将a)中识别的肽与已经针对免疫原性和/或在肿瘤中相对正常组织过提呈进行预先筛选的肽库进行比较；

c)选择库中的与在该患者中识别的TUMAP匹配的至少一种肽；以及

d)基于步骤c)生产和/或构建个性化疫苗或基于化合物的疗法或细胞疗法。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述TUMAP通过以下方法识别：

a1)将肿瘤样本的表达数据与肿瘤样本组织类型相应的正常组织样本的表达数据进行比较，以识别在肿瘤样本中过表达或异常表达的蛋白；和

a2)将表达数据与肿瘤样本中与MHC I类和/或II类分子结合的MHC配体的序列相关联，以识别源自于肿瘤过表达或异常表达的蛋白的MHC配体。

31.根据权利要求29或30所述的方法，其中MHC配体的序列的识别是通过洗脱由肿瘤样本分离的MHC分子的结合肽，并对所洗脱的配体进行测序而进行的。

32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中与肿瘤样本组织类型相应的正常组织样本获得自同一患者。

33.根据权利要求29至32中任一项所述的方法，其中包含在库中的肽基于以下步骤进行识别：

aa.通过高度平行的方法，例如微阵列或基于测序的表达谱，进行全基因组信使核糖核酸(mRNA)表达分析，其包括识别相较于正常组织在恶性组织中过表达的基因；

ab.选择步骤aa检测到的有选择地表达或过表达的基因所编码的肽，以及

ac.通过选定的肽确定体内T细胞反应的诱导，包括使用来自健康供体或所述患者的人类T细胞而进行的体外免疫原性测定；或

ba.用质谱法识别来自所述肿瘤样本的HLA配体；

bb.通过高度平行的方法，例如微阵列或基于测序的表达谱，进行全基因组信使核糖核酸(mRNA)表达分析，其包括识别相较于正常组织在恶性组织中过表达的基因；

bc.比较所识别的HLA配体与该基因表达数据；

bd.选择步骤bc检测到的有选择地表达或过表达的基因所编码的肽；

be.重新检测肿瘤组织上且在健康组织上缺乏或不经常检测到的由步骤bd选定的TUMAP，并确定在mRNA水平上过表达的相关性；以及

bf.通过选定的肽确定体内T细胞反应的诱导，包括使用来自健康供体或所述患者的人类T细胞的体外免疫原性测定。

34.根据权利要求29至33中任一项所述的方法，其中包含在库中的肽的免疫原性通过包括体外免疫原性检测、针对个别HLA结合性的患者免疫监测、MHC多聚体染色、ELISPOT分析和/或细胞内细胞因子染色的方法而确定。

35.根据权利要求29至34中任一项所述的方法，其中所述库包括多个选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.10的肽。

36.根据权利要求29至35中任一项所述的方法，其还包括，识别该肿瘤样本与该个体患者的相应正常组织相比而独特具有的至少一种突变，以及选择与该突变相关的肽，使其包含于疫苗中或用于产生细胞疗法。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述至少一种突变通过全基因组测序而识别。

38.一种药物组合物，其包括选自以下的至少一种活性成分：

a)由SEQ ID No.1至SEQ ID No.10组成的肽；

b)与a)中的肽和/或肽MHC复合体反应的T细胞受体；

c)包含a)中所述的肽、以及HLA-DR抗原相关不变链(Ii)的第1至80N-端氨基酸的融合蛋白；

d)编码a)至c)中任一项的核酸或包含该核酸的表达载体；

e)包含d)中的表达载体的宿主细胞；

f)激活的T淋巴细胞，其通过包括使T细胞与a)中的肽进行体外接触一段时间的方式、以及将这些激活的T细胞转入自体或其他患者的方法而得到，其中接触的时间足以以抗原特异性方式激活该T细胞，且肽在合适的抗原提呈细胞表面上表达；

g)抗体或可溶性T细胞受体，其与a)中的肽和/或肽-MHC复合体、和/或提呈a)中的肽的细胞反应的，且可能通过与免疫激活结构域或毒素融合而修饰；

h)适体，其识别选自SEQ ID No.1的肽和/或由SEQ ID No.1的肽与MHC分子的复合体；

i)a)至h)中任一项的结合的或标记的肽或支架，以及药学上可接受的载体、和任选地药学上可接受的赋形剂和/或稳定剂。

39.一种适体，其特异性地识别权利要求1至5中任一项的肽或其变体，优选为与MHC分子结合的权利要求1至5中任一项所述的肽或其变体。

40.一种治疗癌症的方法，包括向有此需要的受试者施用权利要求38所述的药物组合物，其中所述癌症为胃癌、前列腺癌、口腔癌、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、急性髓性白血病、幽门螺旋杆菌引起的MALT淋巴瘤、结肠癌/结直肠癌、胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、宫颈癌、人乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、肝癌、不同表型的脑肿瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)等白血病、肺癌、尤因氏肉瘤、子宫内膜癌、头颈部鳞状细胞癌、喉上皮癌、食管癌、口腔癌、膀胱癌、卵巢癌、肾细胞癌、非典型脑膜瘤、乳头状甲状腺癌、脑肿瘤、涎腺导管癌、宫颈癌、结外型T/NK细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺和乳腺癌的恶性实体瘤、以及其他肿瘤、或其组合。

41.根据权利要求41所述的方法，其中癌症是胃癌或结直肠癌或胶质母细胞瘤。