CN108873283A - 一种基于超连续激光器构建的多模式全光谱暗场显微镜及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种多模式全光谱暗场显微镜，其具有相互平行的第一光轴，在该光轴上同轴依次排布有光源、空间滤波系统、第一中孔反射镜和凹面反射镜；和第二光轴，在该光轴上同轴依次排布有扫描系统、物镜、第二中孔反射镜和光谱仪；第一中孔反射镜和第二中孔反射镜之间的光路设有相位传递系统。本发明还提供该显微镜的多种应用，其基于LSPR建立暗场成像光路，以实现聚焦照明模式；通过凹面反射镜和两中孔反射镜的设置增加了一条光路以实现光片照明模式，可同时实现光片照明模式暗场成像功能。

Description

一种基于超连续激光器构建的多模式全光谱暗场显微镜及其 应用

技术领域

本发明属于显微成像技术领域，具体涉及一种基于超连续激光器构建的多模式全光谱暗场显微镜及其应用。

背景技术

显微镜成像技术在研究贵金属纳米材料与细胞的相互作用中发挥着重要作用。例如电子显微镜、原子力显微镜、近场扫描光学显微镜、暗场显微镜、激光共聚焦显微镜等，利用显微镜可以观察贵金属纳米材料在细胞内的分布和定位等信息。然而由于成像方法本身的特点以及所用探针性质的限制，目前对于实时观察贵金属纳米颗粒与细胞的相互作用还存在着巨大挑战。例如电子显微镜不能对活细胞进行成像，原子力显微镜和近场扫描光学显微镜的扫描速率很慢等，这些都限制了其在细胞与纳米材料相互作用实时研究中的应用。单分子、单颗粒水平的荧光成像技术提供了揭示细胞内单分子水平生化反应动态过程的有效手段，使实时追踪纳米颗粒的运动和定位信息成为可能。然而，现有的基于荧光探针的单颗粒成像方法通常存在一对无法克服的矛盾：一方面，为了实现较高的时空分辨率，我们需要借助大功率光源激发单颗粒上标记的荧光探针，以便在较短时间内搜集足够的荧光信号；而另一方面，强光源带来的荧光漂白作用又限制了长时间实时成像的能力。

贵金属纳米颗粒具有独特的局域表面等离子体共振(LSPR)特性，其发出的散射光可以被暗场显微镜(Dark Field Microscope，DFM)探测到。近年来的研究表明，基于纳米金等颗粒自身的LSPR性质，进行单颗粒暗场成像，避免了荧光成像方法的光漂白问题，因此成为了研究贵金属纳米颗粒与细胞相互作用的有效手段。利用暗场显微镜，在单分子水平上对金属纳米颗粒的动态行为进行分析，对研究活细胞和组织的生物学行为、制备纳米功能材料、开发新的传感器具有重要意义。例如，通过检测金属纳米颗粒的散射信号，可以分析其与细胞、生物分子的相互作用，揭示其聚集状态与胞内运输情况。

然而，现有的单个金属纳米颗粒的LSPR光谱研究，采用的都是暗场显微镜-光谱仪联用装置。现有的商业化暗场显微镜其光路图如图1所示，光源的光经暗场聚光镜2’和凸透镜3’聚焦到样品上，并且该光穿过样品4’由一物镜接收W’。但是，由于现有商业化仪器的封装限制，暗场显微镜不具有荧光成像功能，因此只能进行细胞轮廓的结构成像，无法进行功能成像，限制了对贵金属纳米颗粒与细胞相互作用研究的深入。例如现有暗场显微镜只能观察到纳米金进入细胞的过程和状态，无法同时观察其与特定的亚细胞结构共定位，获得纳米金与细胞内部相互作用的细节信息。此外，现有的商业化暗场显微镜由于自带光源一般使用卤素灯，光强度弱、光谱范围窄，造成在进行单颗粒成像研究时，对散射信号较弱的样品需要的光谱采集时间较长，对更弱的样品甚至完全无法实现信号的采集。例如，对于粒径在30nm以下的小颗粒纳米金，现有的商业化仪器无法在单颗粒尺度对其进行成像研究。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种基于超连续激光器的多模式全光谱暗场显微镜及其应用，实现多功能扩展，解决现有技术中弱散射信号样品无法实时检测这一缺陷，实现对亚细胞结构里的生物生化反应过程进行追踪和分析，为研究纳米材料与细胞的相互作用提供了有力手段。

为实现上述目的，本发明提供一种多模式全光谱暗场显微镜，其具有相互平行的第一光轴，沿该光轴具有光路的第一方向，且沿该第一方向在该光轴上同轴依次排布有光源、空间滤波系统、第一中孔反射镜和凹面反射镜；和第二光轴，沿该光轴具有与第一方向相反的光路的第二方向，且沿该第二方向在该光轴上同轴依次排布有扫描系统、物镜、第二中孔反射镜和光谱仪；所述第一中孔反射镜和第二中孔反射镜之间的光路垂直于第一光轴和第二光轴且设有相位传递系统。

所述第二滤片和光谱仪之间设有一可移除的光分路器，该分路器设置为将在第二光轴上沿第二方向传播的光反射至一CCD相机。

所述光谱仪和所述CCD相机分别与所述光分路器之间设有透镜。

所述第一中孔反射镜和凹面反射镜之间设有第一滤片，且所述第二中孔反射镜和光谱仪之间设有第二滤片。

所述光源为超连续激光器。

空间滤波系统由两块共轭设置的透镜与一个设置于这两个透镜的共轭焦点的针孔组成。

所述针孔的直径大小满足如下关系：

d＝λf/r

其中，λ为光源的波长,单位为m，f为空间滤波系统的前透镜的焦距，单位为m，r为光源的光束半径,单位为m。

所述第一中孔反射镜和第二中孔反射镜均为中间带有通孔的反射镜，所述第一中孔反射镜和第二中孔反射镜平行设置且镜面彼此相对，其通孔完全对中。

所述相位传递系统为一组焦距相同的共轭透镜。

扫描系统包括一载物台，该载物台安装于一XYZPiezo上。

进一步地，本发明还提供一种多模式全光谱暗场显微镜在光片照明模式下的信号采集方法，包括：步骤S1：搭建根据上文所述的多模式全光谱暗场显微镜，并将一可移除的光分路器设置于其第二滤片和光谱仪之间；步骤S2：制备待测样品；步骤S3：将待测样品放置于步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的载物台上，在其相位传递系统和第二中孔反射镜之间插入一第二遮光板，遮挡在第一中孔反射镜背面的第一光轴上的光路]；步骤S4：采集待测样品在光片照明模式下的信号。

所述步骤S4包括：步骤S41：由步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的CCD相机采集待测样品的信号，得到待测样品的暗场成像结果；步骤S42：移除所述光分路器，并由步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的光谱仪采集待测样品的信号，得到待测样品的暗场光谱图。

进一步地，本发明还提供一种多模式全光谱暗场显微镜在聚焦照明模式下的信号采集方法，其特征在于，包括：步骤S1：搭建根据上文所述的多模式全光谱暗场显微镜，并将一可移除的光分路器设置于其第二滤片和光谱仪之间；步骤S2：制备待测样品；步骤S3：将待测样品放置于步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的载物台上，在其第一反射镜和凹面反射镜之间插入一第一遮光板，并开启其光源；步骤S4：采集待测样品在聚焦照明模式下的信号。

所述步骤S4包括：步骤S41：由步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的CCD相机采集待测样品的信号，得到待测样品的暗场成像结果；步骤S42：移除所述光分路器，并由步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的光谱仪采集待测样品的信号，得到待测样品的暗场光谱图。

进一步地，本发明还提供一种多模式全光谱暗场显微镜的多模式共定位成像方法，其特征在于，包括：步骤S1：搭建根据上文所述的多模式全光谱暗场显微镜，并将一可移除的光分路器设置于其第二滤片和光谱仪之间；步骤S2：制备纳米金；步骤S3：细胞培养及细胞对纳米金的摄取，并得到待测样品：步骤S3：将待测样品放置于步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的载物台上，在其第一反射镜和凹面反射镜之间插入一第一遮光板，并开启其光源；步骤S4：由步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的CCD相机采集待测样品的信号，得到待测样品的多模式共定位成像结果。

本发明的有益效果在于：

本发明的多模式全光谱暗场显微镜能够实现多种应用，其基于LSPR建立暗场成像光路，以实现聚焦照明模式暗场成像功能，并通过凹面反射镜和两个中孔反射镜的设置增加了一条光片照明模式光路以实现光片照明模式暗场成像功能，可同时实现光片照明模式暗场成像功能；并在该光路中添加对应滤片，还可实现荧光成像功能。荧光成像与暗场成像相互补充，可实现对纳米金颗粒与亚细胞结构共定位功能成像。此外，本发明采用超连续激光器作为光源，克服了光强度弱和光谱范围窄等问题，可以实现弱散射信号获取，实现了400-1200nm宽光谱暗场与荧光信号的采集与成像、单个30nm粒径纳米金颗粒1ms时间高采集速度的多模式成像功能。

附图说明

图1是现有的现有的商业化暗场显微镜的光路图。

图2是根据本发明的一个实施例的多模式全光谱暗场显微镜的光路图。

图3(a)-图3(g)示出了70nm边长的纳米金三角片和50nm粒径的纳米金球颗粒作为待测样品在光片照明模式下的测量结果，其中图3(a)、3(b)分别为两者的形貌使用透射电子显微镜的表征结果；图3(c)是现有的暗场显微镜对纳米金三角片的暗场成像结果；图3(e)是本发明的多模式全光谱暗场显微镜在暗场光片照明模式下对纳米金三角片的暗场成像结果；图3(d)是现有的暗场显微镜对纳米金球的暗场成像结果；图3(f)是本发明的多模式全光谱暗场显微镜对纳米金球的暗场成像结果；图3(g)是本发明的多模式全光谱暗场显微镜与现有的暗场显微镜在相同的曝光时间下的信噪比对比图。

图4(a)-图4(d)示出了纳米金颗粒和纳米银颗粒在聚焦照明模式下的测量结果，其中图4(a)和图4(c)分别示出了纳米金颗粒与纳米银颗粒在聚焦照明模式下的暗场成像，图4(b)和图4(d)分别示出了纳米金颗粒与纳米银颗粒在聚焦照明模式下的暗场光谱图。

图5(a)-图5(c)是本发明的多模式全光谱暗场显微镜采用多模式共定位成像方法采集到的金纳米颗粒进入细胞的过程；其中图5(a)是本发明的多模式全光谱暗场显微镜用Cy3标记获得的溶酶体荧光成像结果，5(b)是本发明的多模式全光谱暗场显微镜在光片照明模式下的暗场成像结果，其示出了纳米金颗粒的分布信息；5(c)是二者的多模式共定位成像结果。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1一种多模式全光谱暗场显微镜

如图2所示为根据本发明的一个实施例的多模式全光谱暗场显微镜，其包括在第一光轴I上沿第一方向100依次排布的光源1、空间滤波系统2、第一中孔反射镜ID1、第一滤片M1和凹面反射镜CM，以及在平行于第一光轴I的第二光轴II上沿与第一方向100相反的第二方向200依次排布的扫描系统4、物镜W、第二中孔反射镜ID2、第二滤片M2和光谱仪A。

第一滤片M1和第二滤片M2均为可切换的，并由此可以从光路中移除，或切换为具有不同波长的第一滤片M1和第二滤片M2。

所述第二滤片M2和光谱仪A之间设有一可切换并由此可从光路中移除的光分路器FC，该分路器FC设置为将在第二光轴II上沿第二方向传播的光反射至一CCD相机B。所述CCD相机B为DP70，所述光谱仪A为PRINSTONSP2300i。所述光谱仪A和所述CCD相机B分别与所述光分路器FC之间设有透镜L5、L6。

在本实施例中，光源1为超连续激光器(NKT SuperK EXTREME EXW-12)，从而能够发射400-1200nm波长的连续谱激光以克服光强度若和光谱范围窄等问题。空间滤波系统2为针孔滤波系统，由两块共轭设置的透镜L1、L2与一个设置于这两个透镜的共轭焦点的针孔P组成，可实现空间滤波和激光扩束。其针孔P的直径大小满足如下关系：

d＝λf/r

其中，λ为光源1的波长，单位为m，f为空间滤波系统2的前透镜焦距，单位为m，r为光源1的光束半径，单位为m。

所述凹面反射镜CM为柱状凹面反射镜(THORLABS CCM254-100-P01)，其焦距为400mm，其焦点与所述物镜W的焦点重合。凹面反射镜CM安装在一手动升降台上，从而精确调控凹面反射镜CM聚焦形成的光片高度。

扫描系统4包括一载物台41，该载物台41安装于一XYZPiezo(XYZ位移台)42上，该XYZpiezo 42上安装有用于控制平移台的Labview程序，从而实现XYZpiezo 42控制载物台41移动，且载物台41上放置盖玻片43，用于固定待测样品，使得通过XYZPiezo42移动样品完成聚焦光斑对待测样品的扫描，进而实现实时检测和分析弱散射信号样品光谱信息以及实现大视野扫描光谱mapping。

物镜W为OLYMPUS UPlanFLN。

第一中孔反射镜ID1和第二中孔反射镜ID2均为中间带有通孔的反射镜，反射镜的直径为25.4mm，通孔为椭圆形，长轴7mm，短轴5mm。第一中孔反射镜ID1和第二中孔反射镜ID2平行设置且镜面彼此相对，且其通孔完全对中，以实现光路的匹配。所述第一中孔反射镜ID1和第二中孔反射镜ID2之间的光路垂直于第一光轴I和第二光轴II且设有相位传递系统3，该相位传递系统3为一组焦距相同的共轭透镜L3、L4。

下面参见图2说明本发明的多模式全光谱暗场显微镜的工作原理。光源1所产生的400-1200nm波长的连续谱激光首先穿过空间滤波系统2进行滤波与扩束。扩束后的激光由所述第一中孔反射镜ID1反射。此时，激光的外围部分由第一中孔反射镜ID1反射形成了环形光，作为聚焦照明模式的光源，中间部分则穿过了第一中孔反射镜ID1的通孔形成了直径约5mm的圆形光束，该光束即为光片照明模式的光源。

其中，聚焦照明模式的环形光透过相位传递系统3，并经第二中孔反射镜ID2发射至物镜W的后孔径，并由后孔径的边缘被该物镜W聚焦为一个尺度接近光学衍射极限的光斑，该光斑通过XYZPiezo 42精确移动载物台41来与载物台41上的待测样品重合，用于进行待测样品的光谱扫描。光斑与待测样品重合并发生反射和散射，这些光被所述物镜W所收集，其中反射光被第二中孔反射镜ID2反射出去，而待测样品的散射光则透过第二中孔反射镜ID2的中孔，由光分路器FC实现分光，并被CCD相机A或者光谱仪B所接收。

光片照明模式的圆形光束则透过滤片M1发射至样品的斜上方，并由凹面反射镜CM从侧面聚焦在物镜上方的载物台41上，并从侧方形成100μm厚度的光片，以供光片与待测样片重合实现光片照明。凹面反射镜的高度调节可由手动升降台提供，从而精确调控光片高度。

实施例2一种多模式全光谱暗场显微镜在光片照明模式下的信号采集方法

步骤S1：搭建如上文所述的多模式全光谱暗场显微镜，并将光分路器FC设置于其第二滤片M2和光谱仪A之间，且第一滤片M1和第二滤片M2均切换至移除出光路。

步骤S2：待测样品的制备：将纳米金颗粒吸附在表面清洁和硅烷化处理后的玻璃表面。具体地，将洗净后的盖玻片浸泡在1％APTES的甲醇溶液中放置12h，然后依次用甲醇和超纯水冲洗玻璃片以去除多余的APTES和甲醇，之后放在120℃的烘箱中3h进行老化。将20μL浓度为10-30pM的纳米金溶液滴加在上述玻璃片上，5min后用超纯水冲洗玻璃片以除去没有结合在玻璃片上的纳米金，氮气吹干。此外，也可制备其他纳米金属颗粒。

步骤S3：将待测样品放置于步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的载物台41上，在其相位传递系统3和第二中孔反射镜ID2之间插入一第二遮光板K2，遮挡在第一中孔反射镜ID1背面的第一光轴I上的光路，并开启光源1。

步骤S4：采集待测样品在光片照明模式下的信号，包括：

步骤S41：由步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的CCD相机B采集待测样品的信号，得到待测样品的暗场成像结果；

步骤S42：移除光分路器FC，并由步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的光谱仪A采集待测样品的信号，得到待测样品的暗场光谱图。

实验结果

为了验证光片照明模式下暗场成像效果的提升，分别制备了70nm边长的纳米金三角片和50nm粒径的纳米金球颗粒作为待测样品，测量了在光片照明模式下的暗场成像结果(图3(a)-图3(g))。其中，两者的形貌使用透射电子显微镜的表征结果如图3(a)、3(b)所示。图3(c)是用普通卤素灯作为光源的现有的暗场显微镜对纳米金三角片的暗场成像结果(曝光时间100ms，ISO灵敏度为400，卤素灯照明强度100％，输出为DC12V 8.4A)，分析后表明信号极其微弱。与之相反，图3(e)显示本发明的多模式全光谱暗场显微镜在暗场光片照明模式下对70nm边长的纳米金三角片的暗场成像结果(曝光时间100ms，ISO灵敏度为400，照明强度20％，实测照明功率5.7mW)，在大视野下可清晰地观察到单个70nm纳米金三角片独有的红色特征峰的散射信号。图3(d)、图3(f)分别示出了现有的暗场显微镜和本发明的多模式全光谱暗场显微镜对50nm纳米金球的暗场成像结果，并反映了同样的结果。图3(g)则示出了本发明的多模式全光谱暗场显微镜与现有的暗场显微镜在相同的曝光时间下的信噪比对比图，该图表明，在相同的曝光时间下(100ms)，利用超连续激光使用光片照明，其信噪比相较于卤素灯照明提高了100倍。

实施例3：多模式全光谱暗场显微镜在聚焦照明模式下的信号采集方法

步骤S1：搭建如上文所述的多模式全光谱暗场显微镜，并将光分路器FC设置于其第二滤片M2和光谱仪A之间，且第一滤片M1和第二滤片M2均切换至移除出光路。

步骤S2：采用与实施例2同样的方法制备待测样品。在本实施例中，待测样品为30nm纳米金与40nm纳米银。

步骤S3：将待测样品放置于步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的载物台41上，在其第一反射镜ID1和凹面反射镜CM之间插入一第一遮光板K1，并开启光源1。通过严格控制照明光斑的形状来实现照明中心的高强度，可实现在极短时间内收集到足够强的光谱信号。

步骤S4：采集待测样品在聚焦照明模式下的信号，包括：

步骤S41：由步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的CCD相机B采集待测样品的信号，得到待测样品的暗场成像结果；

步骤S42：切换以从光路中移除光分路器FC，并由步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的光谱仪A采集待测样品的信号，得到待测样品的暗场光谱图。

此外，还可以包括步骤S43：打开XYZPiezo 42上安装的控制程序，实现对样品的移动扫描并瞬时采集样品的暗场光谱图，可实现光谱mapping。

实验结果

(1)聚焦照明模式下的暗场成像：

结果如图4(a)和4(c)所示，相对于光片照明，聚焦式照明的散射信号强度有了明显提升。在实测照明总功率170.1μW、曝光时间100ms的条件下，纳米金颗粒(图4(a))与纳米银颗粒(图4(c))具有很强的散射信号，甚至产生严重过曝现象。

(2)聚焦照明模式下的暗场光谱分析：

结果如图4(b)和图4(d)所示，30nm纳米金纳米金颗粒在540nm、40nm纳米银颗粒在480nm有强散射特征峰。

实施例4：多模式全光谱暗场显微镜的多模式共定位成像方法

步骤S1：搭建如上文所述的多模式全光谱暗场显微镜，并将光分路器FC设置于其第二滤片M2和光谱仪A之间。该多模式全光谱暗场显微镜通过在光路中设置并切换具有不同波长的第一滤片M1和第二滤片M2，以同时提供不同波长上的荧光成像模式，可实现细胞内荧光与纳米金散射图像的共定位，这为纳米金颗粒在细胞内的分布和定位提供了依据。

步骤S2：采用与实施例2同样的方法制备纳米金。

步骤S3：细胞培养及细胞对纳米金的摄取，并得到待测样品：

将HeLa细胞铺在单孔玻璃底培养皿上，用1×PBS将细胞洗涤2-3次，再加入0.2mL含有0.1nM纳米金的培养基(gibco MEM)，在培养箱中培养2小时。观察之前用1×PBS洗涤3-4次，并更换为不含酚红的培养基。

步骤S4：将待测样品放置于步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的载物台41上，在其第一反射镜ID1和凹面反射镜CM之间插入一第一遮光板K1，遮挡在第一中孔反射镜ID1背面的第一光轴I上的光路，并开启光源1。

步骤S5：由步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的CCD相机B采集待测样品的信号，得到待测样品的多模式共定位成像结果。

(2)细胞内荧光与纳米金散射图像的共定位：

图5(a)-图5(c)为本发明的多模式全光谱暗场显微镜采用多模式(光片照明模式和荧光成像模式)共定位成像方法采集到的金纳米颗粒进入细胞的过程。图5(a)是本发明的多模式全光谱暗场显微镜用Cy3标记获得的溶酶体荧光成像结果；5(b)为本发明的多模式全光谱暗场显微镜在光片照明模式下的暗场成像结果，其示出了纳米金颗粒的分布信息；5(c)是二者的多模式共定位成像结果。从中可以看出，溶酶体和纳米金有很好的共定位，初步反映纳米金进入细胞后会被溶酶体吞噬。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (15)

1.一种多模式全光谱暗场显微镜，其特征在于，其具有相互平行的

第一光轴(I)，沿该光轴(I)具有光路的第一方向(100)，且沿该第一方向(100)在该光轴上同轴依次排布有光源(1)、空间滤波系统(2)、第一中孔反射镜(ID1)和凹面反射镜(CM)；和

第二光轴(II)，沿该光轴(II)具有与第一方向(100)相反的光路的第二方向(200)，且沿该第二方向(200)在该光轴上同轴依次排布有扫描系统(4)、物镜(W)、第二中孔反射镜(ID2)、第二滤片(M2)和光谱仪(A)；

所述第一中孔反射镜(ID1)和第二中孔反射镜(ID2)之间的光路垂直于第一光轴(I)和第二光轴(II)且设有相位传递系统(3)。

2.根据权利要求1所述的多模式全光谱暗场显微镜，其特征在于，所述第二滤片(M2)和光谱仪(A)之间设有一可移除的光分路器(FC)，该分路器(FC)设置为将在第二光轴(II)上沿第二方向传播的光反射至一CCD相机(B)。

3.根据权利要求2所述的多模式全光谱暗场显微镜，其特征在于，所述光谱仪(A)和所述CCD相机(B)分别与所述光分路器(FC)之间设有透镜(L5、L6)。

4.根据权利要求2所述的多模式全光谱暗场显微镜，其特征在于，所述第一中孔反射镜(ID1)和凹面反射镜(CM)之间设有第一滤片(M1)，且所述第二中孔反射镜(ID2)和光谱仪(A)之间设有第二滤片(M2)。

5.根据权利要求1所述的多模式全光谱暗场显微镜，其特征在于，所述光源(1)为超连续激光器。

6.根据权利要求1所述的多模式全光谱暗场显微镜，其特征在于，空间滤波系统(2)由两块共轭设置的透镜(L1、L2)与一个设置于这两个透镜的共轭焦点的针孔(P)组成。

7.根据权利要求6所述的多模式全光谱暗场显微镜，其特征在于，所述针孔(P)的直径大小满足如下关系：

d＝λf/r

其中，λ为光源(1)的波长,单位为m，f为空间滤波系统(2)的前透镜(L1)的焦距，单位为m，r为光源(1)的光束半径,单位为m。

8.根据权利要求1所述的多模式全光谱暗场显微镜，其特征在于，所述第一中孔反射镜(ID1)和第二中孔反射镜(ID2)均为中间带有通孔的反射镜，所述第一中孔反射镜(ID1)和第二中孔反射镜(ID2)平行设置且镜面彼此相对，其通孔完全对中。

9.根据权利要求8所述的多模式全光谱暗场显微镜，其特征在于，所述相位传递系统(3)为一组焦距相同的共轭透镜(L3、L4)。

10.根据权利要求1所述的多模式全光谱暗场显微镜，其特征在于，扫描系统(4)包括一载物台(41)，该载物台(41)安装于一XYZPiezo(42)上。

11.一种多模式全光谱暗场显微镜在光片照明模式下的信号采集方法，其特征在于，包括：

步骤S1：搭建根据权利要求2所述的多模式全光谱暗场显微镜；

步骤S2：制备待测样品；

步骤S3：将待测样品放置于步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的载物台(41)上，在其相位传递系统(3)和第二中孔反射镜(ID2)之间插入一第二遮光板(K2)，遮挡在第一中孔反射镜(ID1)背面的第一光轴(I)上的光路，并开启其光源(1)；

步骤S4：采集待测样品在光片照明模式下的信号。

12.根据权利要求11所述的多模式全光谱暗场显微镜在光片照明模式下的信号采集方法，其特征在于，所述步骤S4包括：

步骤S41：由步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的CCD相机(B)采集待测样品的信号，得到待测样品的暗场成像结果；

步骤S42：移除所述光分路器(FC)，并由步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的光谱仪(A)采集待测样品的信号，得到待测样品的暗场光谱图。

13.一种多模式全光谱暗场显微镜在聚焦照明模式下的信号采集方法，其特征在于，包括：

步骤S1：搭建根据权利要求2所述的多模式全光谱暗场显微镜；

步骤S2：制备待测样品；

步骤S3：将待测样品放置于步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的载物台(41)上，在其第一反射镜(ID1)和凹面反射镜(CM)之间插入一第一遮光板(K1)，，并开启其光源(1)；

步骤S4：采集待测样品在聚焦照明模式下的信号。

14.根据权利要求13所述的多模式全光谱暗场显微镜在聚焦照明模式下的信号采集方法，其特征在于，所述步骤S4包括：

步骤S41：由步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的CCD相机(B)采集待测样品的信号，得到待测样品的暗场成像结果；

步骤S42：移除所述光分路器(FC)，并由步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的光谱仪(A)采集待测样品的信号，得到待测样品的暗场光谱图。

15.一种多模式全光谱暗场显微镜的多模式共定位成像方法，其特征在于，包括：

步骤S1：搭建根据权利要求4所述的多模式全光谱暗场显微镜；

步骤S2：制备纳米金；

步骤S3：细胞培养及细胞对纳米金的摄取，并得到待测样品：

步骤S4：将待测样品放置于步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的载物台(41)上，在其第一反射镜(ID1)和凹面反射镜(CM)之间插入一第一遮光板(K1)，并开启其光源(1)；

步骤S5：由步骤S1所述的多模式全光谱暗场显微镜的CCD相机(B)采集待测样品的信号，得到待测样品的多模式共定位成像结果。