CN108853578A - 一种3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架及其制备方法 - Google Patents

一种3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种3D打印Ti‑水凝胶‑成骨细胞骨组织工程支架及其制备方法。通过SLM技术将Ti6Al4V粉末加工成为具有多孔结构的3D打印Ti支架；随后在一定条件下将水凝胶‑成骨细胞混合物填充进入3D打印Ti支架的孔隙，从而制备3D打印Ti‑水凝胶‑成骨细胞骨缺损修复支架。本发明具有结构简单可靠，外形与微结构可控，力学性能可靠，植入方便，创伤小、成本低的优点。

Description

一种3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架及其制备 方法
技术领域
本发明属于骨组织修复及重建领域，涉及一种3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架及其制备方法。
背景技术
骨缺损的修复和重建是骨科临床面临的问题之一。众所周知，自体骨被认为是骨移植的金标准，但其来源有限且可能导致供给部位的坏死、术后的慢性疼痛、过敏反应和感染等并发症。而同种异体骨和异种骨由于来源广泛且不需要额外的手术操作而被广泛应用，但同时也存在缓慢的整合与重塑、免疫排斥反应和疾病传播等并发症，尤其是降低了移植物的骨诱导性和骨传导性。
目前支架材料有生物活性磷酸钙陶瓷、磷酸钙骨水泥(CPC)、羟基磷灰石(HA)、珊瑚、石膏；聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)；胶原、脱钙骨基质(DBM)、纤维蛋白凝块(FC)等。而理想的骨基质材料应具备以下几个条件:(1)良好的生物相容性,在植入体内以后,无论其本身或其降解产物都应对机体无毒副作用,不会产生炎症反应,不会引起宿主的移植排斥反应。(2)材料的降解速率必须与新骨的生成速率相匹配，材料完成支架作用后,可被完全吸收。(3)具有孔隙率至少达90％以上的三维立体结构和一定的坚韧性,为组织细胞提供高比率的接触表面积和生长空间。(4)材料不仅能维持细胞形态和表型,而且能促进细胞粘附、增殖,诱导组织再生。虽然目前研究的多孔陶瓷材料、高分子材料及其他们的复合材料等能够作为有潜力的骨移植支架材料，但是它们均存在种种弊端，尤其是不能满足承重部位骨组织修复的要求。近几年来，三维多孔结构的金属支架的潜在应用吸引了越来越多的研究者的注意力，三维多孔结构的金属支架被认为一种很有前景的骨移植材料而广泛应用于骨科和牙科领域。和陶瓷、聚合物材料相比，金属因其较高的机械强度和断裂韧性而适合承重部位的应用。在众多金属材料中，钛及其合金因其良好的生物相容性、生物安全性、良好的机械特性以及耐腐蚀性等优点而被广泛应用。
但钛金属作为支架材料，同样具有生物活性较低的问题，因此，目前已开展众多基于材料本身的改性及种子细胞及骨生成和吸收相关的生长因子的复合的研究。材料本身改性主要依靠理化因素的处理，包括酸碱处理，电磁及氧化还原的方式引入其他元素以期待提升支架的生物活性。这些方法在支架制备过程中即较为复杂，且均一性难以得到控制。而种子细胞是组织工程化骨的关键问题。理想的种子细胞具有取材容易,对机体损伤小；体外扩增容易，表达稳定；植入体内无免疫排斥，具有成骨较强能力，而无致瘤性。目前研究较多的有成骨细胞、骨髓基质细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞及胚胎干细胞等。但是对于金属支架而言，较低的细胞携带率仍是阻碍其进一步发展的瓶颈。至于生长因子，目前发现认识的骨生成相关的有骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、类胰岛素生长因子(insulin-like growthfactor,IGF)、碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factorFGF)、血小板衍生因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、血管内皮细胞生长因子(vascu2larendothelial growth factor,VEGF)等。但是生物活性因子存在免疫排斥、病原体传播、过敏反应、潜在致肿瘤、致畸形可能性，生物安全性得不到保证，而且临床级的rhBMP-2、TGF-β等生物因子往往需要进口，且价格昂贵，每毫克的采购价就达到近千美元。
综上所述，开发出一种结构简单可靠，力学强度合适，手术植入方便，对人体创伤小，低成本、可诱导骨长入的组织工程化骨以行骨缺损的修复治疗对我国的卫生事业发展、对建设创新性国家都有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架。
本发明的另一目的是提供该3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架的制备方法。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架，由Ti6Al4V经3D打印技术制备的具有多孔结构的3D打印Ti支架，及在Ti支架的孔隙内填充的水凝胶-成骨细胞混合物组成。
本发明所述的3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架，优选通过SLM技术将Ti6Al4V粉末加工成为具有多孔结构的3D打印Ti支架；随后在一定条件下将水凝胶-成骨细胞混合物填充进入3D打印Ti支架的孔隙，从而制备3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨缺损修复支架。
所述的3D打印Ti支架内部排列为0-90°正交行结构、0-60-120°三角形结构在内的规律性孔隙，或依据实际需要形成特殊的梯度化、层次化相交结构。
本发明所述的3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架的制备方法，以Ti6Al4V粉末为原料，通过激光烧结技术形成纤维网格状结构的Ti支架，将携带成骨细胞的琼脂糖水凝胶固化在网状纤维格内得到3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架。
本发明所述的制备方法优选包含以下步骤：
(1)制备3D打印Ti支架；
(2)成骨细胞培养：将成骨细胞扩增培养至三代后取5×104/ml细胞待用；
(3)配制携带成骨细胞的水凝胶：取琼脂糖以质量体积比1:25g/ml加入双蒸水，高压蒸汽灭菌冷却至40℃时每个支架加入1×104个成骨细胞，均匀搅拌后获得携带成骨细胞的水凝胶；
(4)将携带成骨细胞的水凝胶填充入3D打印Ti支架：将步骤(1)中获取的3D打印Ti支架高温灭菌后加入前端可调的密封容器中，并加入未固化的携带成骨细胞的水凝胶，排尽空气并使用推杆加压，促进含成骨细胞的水凝胶填充进入3D打印Ti支架的孔隙内，在琼脂糖水凝胶冷却固化后，将3D打印支架取出，去除支架表面多余水凝胶即得所述的3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架。
步骤(1)制备3D打印Ti支架的具体方法优选：将钛合金粉末通过选择性激光烧结3D打印机，依照三维软件设计的外形及孔隙微结构，制作多孔的3D打印Ti支架。
所述的多孔的3D打印Ti支架外形可依据不同的待修复区的骨缺损形态进行3D打印个性化制造，也可以通过打印机制造为固定外形的通用支架材料，并在手术中依据实际骨缺损的要求进行填充，还可以设计为复杂的几何结构，甚至包含可以辅助支架固定的螺钉工作通道。通过SLM 3D打印技术构建，可以实现外形、内部孔隙结构的精细控制
3D打印Ti支架内部排列为0-90°正交行结构、0-60-120°三角形结构在内的规律性孔隙，或依据实际需要形成特殊的梯度化、层次化相交结构。
有益效果：
本发明的目的是提供一种结构简单可靠，外形与微结构可控，力学性能可靠，植入方便，创伤小，有我国自主知识产权的组织工程化骨修复材料－“3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架”，用于骨创伤、骨肿瘤、骨感染后骨缺损的修复治疗。
本发明具备以下有益效果：
本发明是以激光烧结的纤维通过不同层次与角度的逐层累积与拼接架构而成的多孔隙结构，孔隙中的各层纤维可以在0-180°的范围内相交并累积而形成，每个纤维之间的距离也可以影响孔隙的大小，这样就最终可以形成多种交叉结构的规律性孔隙，亦可以依据实际需要形成特殊的梯度化、层次化相交结构；具有微结构可控特性。
本发明通过改变制作过程中成骨细胞与水凝胶混合的浓度，可调控支架内成骨细胞的携带量，而且初期，水凝胶结构稳定，能够保证支架内足够的细胞数目。整个制备过程均可以达到无菌处理，便于直接体内接种；具有成骨细胞携带的高效性与便携性。
本发明的钛合金、水凝胶材料均具有一定的弹性模量与强度，通过对3D打印形成的孔隙微结构的调控使得3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨缺损修复支架的力学特性更满足骨缺损部位的力学要求；具有良好的力学性能。
本发明填充于3D打印Ti支架内的水凝胶在植入后会不断降解，细胞及其营养成分渗透，周围新生的骨组织将逐步生长并填充孔隙，就能够形成在宿主部位良好的骨整合性能。本发明采用的Ti、水凝胶均为高生物相容性与生物安全性材料，均已被国家食药监局批准用于作为可临床使用的内植入物；而成骨细胞本身为体内成分，三者复合后无生物有害物质的生成，使得3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨缺损修复支架具备良好的组织整合特性及生物安全性。
本发明提供的新型3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架，在具备了现有骨修复材料优点的同时还充分发挥了3D打印技术、支架材料本身的性能，使得本发明具有结构简单可靠，外形与微结构可控，改性简便高效，力学性能可靠，生物活性及安全性高，植入方便，创伤小、成本低的优点，可以用于骨创伤、骨肿瘤所致骨缺损的修复治疗。
附图说明：
图1为利用本发明3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架进行骨修复的技术路线图。
如图1所示的技术路线，对于骨缺损患者，去除金属异物等可能影响CT扫描图像的干扰因素外，通过CT扫描获得解剖数据，并结合骨缺损的病情严重程度，设计具备个性化外形与理化特性的3D打印支架并植入骨缺损区域。对于无法获取精确解剖数据的患者，使用预先准备好的3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架，依据实际缺损情况决定植入支架的数量。支架植入后新生骨组织则不断长入，最终实现修复骨缺损修复的目标。
图2、3为本发明的纤维层叠排列、建立三维多孔结构的示意图。
如图2、3所示，支架的多孔结构由不同层次排列的Ti纤维束叠加形成，图2A、B为支架纤维依不同层次叠加排列的二维示意图，可以看到支架的孔隙形态由支架纤维的层叠确定，包括孔大小、孔形状、孔取向、孔隙率和连通性等。图2C、D为提供了采用0-90°层叠排列形成具有正方形的3D打印Ti支架的结构示意图。图3提供了采用0-60-120°层叠排列形成的3D打印Ti支架的结构示意图。在实际工作中，亦可以依据不同待修复区力学环境、骨缺损程度等的实际要求，通过对支架纤维层叠的调控，进而制备个性化设计、具备特定孔隙微结构的支架。
图4为本发明植入骨缺损区后发挥促进骨组织长入生物学作用的示意图。
1为钛合金粉末；2为使用钛合金粉末制备3D打印Ti支架的示意图，将钛合金粉末通过SLM金属3D打印机制备3D打印Ti支架；3、4为将琼脂糖粉末加入双蒸水中，进行高压蒸汽灭菌后；5为待冷却至40℃加入成骨细胞后形成琼脂糖-成骨细胞溶液；6、7为将3D打印Ti支架加入前端可调的密封容器中，并加入琼脂糖-成骨细胞溶液，使用推杆加压，促进混合物填充入3D打印Ti支架的孔隙内；8为冷却后去除支架表面多余水凝胶，获取通用的3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨缺损修复支架。
图5为本发明植入骨缺损区后发挥骨缺损修复的生物学作用的示意图1为支架植入骨缺损部位；2为支架局部的放大图，可以看到3D打印支架孔隙内水凝胶填充；3显示3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨缺损修复支架植入后，水凝胶渐渐降解，细胞渗透，骨组织长入。
图6为按照前述技术路线，制备的通用型3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架的实物图，纤维排列为分别为0-90°(6A)，0-60-120°(6D)。
图7A-E为本发明的体内骨修复实验的结果图，其中A为骨缺损区域；B为将支架植入骨缺损区域，显示3D打印支架完全嵌入骨缺损区域；C为支架植入1月后骨组织逐渐生长；D、E分别为支架植入2月、3月的照片，显示新生骨骨组织长入。
具体实施方式：
实施例1
步骤一：制备3D打印Ti支架
首先通过激光烧结技术(Selective Laser Sintering,SLM)技术将Ti6L4V粉末烧结出成型纤维束、通过纤维束0-90°、0-60-120°等排列拼接，制备3D打印Ti支架(图2、3)；
步骤二：成骨细胞提取与培养
取幼龄白兔颅盖骨，剪碎后加入0.25％EDTA胰酶5ml，消解30min，离心去上清，10ml0.1％II型胶原酶消解4h,取上清液离心去上清，培养液悬浮细胞并接种，培养，待细胞贴壁后换液，进行茜素红染色及ALP染色鉴定，扩增至三代后取5x104/ml细胞待用；
步骤三：配制携带成骨细胞的水凝胶：
取琼脂糖以质量体积比1:25g/ml加入双蒸水，高压蒸汽灭菌冷却至40℃时每个支架加入1×104个成骨细胞，均匀搅拌后获得携带成骨细胞的水凝胶；
步骤四：将携带成骨细胞的水凝胶填充入3D打印Ti支架：
将步骤一中获取的3D打印Ti支架高温灭菌后加入前端可调的密封容器中，并加入未固化的携带成骨细胞的水凝胶，排尽空气并使用推杆加压，促进含成骨细胞的水凝胶填充进入3D打印Ti支架的孔隙内，在琼脂糖水凝胶冷却固化后，将3D打印支架取出，去除支架表面多余水凝胶待用，制备的通用型3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架的实物图如图6所示。
通过手术将制备的3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架植入兔的骨缺损区域，结果如图7所示。
本发明3D打印Ti支架植入人体后Ti作为金属材料可以实现缺损的负重，填充于3D打印Ti支架内的水凝胶在植入后会不断降解，细胞及其营养成分渗透，周围新生的骨组织将逐步生长并填充孔隙，就能够形成在宿主部位良好的骨整合性能，最终可修复骨创伤、肿瘤等所致缺损。

Claims (8)

1.一种3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架，其特征在于由Ti6Al4V经3D打印技术制备的具有多孔结构的3D打印Ti支架，及在Ti支架的孔隙内填充的水凝胶-成骨细胞混合物组成。
2.根据权利要求1所述的3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架，其特征在于通过SLM技术将Ti6Al4V粉末加工成为具有多孔结构的3D打印Ti支架；随后在一定条件下将水凝胶-成骨细胞混合物填充进入3D打印Ti支架的孔隙，从而制备3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨缺损修复支架。
3.根据权利要求1所述的3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架，其特征在于所述的3D打印Ti支架的规律性孔隙，或依据实际需要形成特殊的梯度化、层次化相交结构。
4.权利要求1-3中任一项所述的3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架的制备方法，其特征在于以Ti6Al4V粉末为原料，通过激光烧结技术形成纤维网格状结构的Ti支架，将携带成骨细胞的琼脂糖水凝胶固化在网状纤维格内得到3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)制备3D打印Ti支架；
(2)成骨细胞培养：将成骨细胞扩增培养至三代后取5×104/ml细胞待用；
(3)配制携带成骨细胞的水凝胶：取琼脂糖以质量体积比1:25g/ml加入双蒸水，高压蒸汽灭菌冷却至40℃时每个支架加入1×104成骨细胞，均匀搅拌后获得携带成骨细胞的水凝胶；
(4)将携带成骨细胞的水凝胶填充入3D打印Ti支架：将步骤(1)中获取的3D打印Ti支架高温灭菌后加入前端可调的密封容器中，并加入未固化的携带成骨细胞的水凝胶，排尽空气并使用推杆加压，促进含成骨细胞的水凝胶填充进入3D打印Ti支架的孔隙内，在琼脂糖水凝胶冷却固化后，将3D打印支架取出，去除支架表面多余水凝胶即得所述的3D打印Ti-水凝胶-成骨细胞骨组织工程支架。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤(1)制备3D打印Ti支架的具体方法为将钛合金粉末通过选择性激光烧结3D打印机，依照三维软件设计的外形及孔隙微结构，制作多孔的3D打印Ti支架。
7.根据据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的多孔的3D打印Ti支架外形依据不同的待修复区的骨缺损形态进行3D打印个性化制造，或通过打印机制造为固定外形的通用支架材料，或设计为复杂的几何结构，或包含可以辅助支架固定的螺钉工作通道。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于3D打印Ti支架为包括0-90°正交行结构、0-60-120°三角形结构在内的规律性孔隙，或依据实际需要形成特殊的梯度化、层次化相交结构。
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