CN108841923A - 一种基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器及其制备方法和检测方法 - Google Patents

一种基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器及其制备方法和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于DSN酶的量子点‑磁珠miRNA传感器及其制备方法和检测方法，通过量子点和磁珠表面共价偶联的链霉亲和素和DNA末端修饰的生物素的连接，构建QD‑DNA生物探针和MB‑DNA生物探针。本发明利用量子点优良的光学特性，基于磁珠的磁分离更省时、分离效果更理想的特点，并且利用DSN酶能够高选择性地识别并切割完全匹配的DNA双链或者RNA/DNA杂交双链中的DNA，从而可以实现信号的放大的特点，制备了一种基于DSN酶的量子点‑磁珠miRNA传感器。本发明可以实现对miRNA的高灵敏、高特异性的检测，在分子生物学和医学等领域将有潜在的应用。

Description

一种基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器及其制备方法和 检测方法
技术领域
本发明属于纳米生物医学领域，具体涉及一种基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器及其制备方法和检测方法。
背景技术
微小核糖核酸(microRNA或miRNA)是一类由18-25个核苷酸构成的非编码单链RNA。miRNA的异常表达在肿瘤中普遍存在，且具有组织特异性，因而可以作为肿瘤检测的标志物。在肿瘤的早期，血清中的肿瘤miRNA标志物的浓度是非常低的，因此需要设计检测灵敏度足够高的传感器来检测微量的miRNA。因为miRNA具有超低浓度、序列较短、高的序列同源性和易降解的特性，这些缺点限制了miRNA在临床检测中应用，但是也进一步促使人们设计简单的技术来灵敏地、选择性地、方便地检测miRNA。现如今，很多光学、电化学、拉曼分析方法结合各种放大策略已经被用来检测miRNA。尽管这些方法可以实现高灵敏和多元检测，但是一些缺点仍需要被解决，包括实验时间长、液体或温度控制设备操作复杂、因放大程序而引起的序列偏差等。荧光检测因为其操作简单方便、低消耗、高灵敏度和不需要复杂仪器的特点已经吸引了人们注意。
与传统的荧光染料相比，量子点(QD)具有许多优良的光学性质，例如：高量子产率、高摩尔消光系数、宽范围的吸收谱、窄而且对称的荧光光谱、大的斯托克斯位移、抗光漂白、抗光和抗化学降解能力强。特殊的光学特性使它们在生物成像、传感和诊断领域吸引了人们广泛关注。
磁珠(Magnetic Baeds，MB)由一些磁性金属氧化物组成，磁分离可以实现磁珠的快速聚集，并且磁分离方法与传统的离心分离方法相比更省时、分离效果更理想还可以起到富集样品的作用，已经广泛应用于蛋白质、核酸、多肽等的分离。
双链特异性核酸酶(Duplex-specific nuclease或DSN)能够高选择性地识别并剪切DNA双链或DNA-RNA双链中的DNA，但是对于单链DNA和RNA却几乎没有作用。基于DSN酶这一个特点使其在生物和医学等方面得到了广泛应用。
利用DSN酶信号放大来检测miRNA已经变成了miRNA检测的热点。用DSN酶进行信号放大的原理是用目标miRNA与DNA探针通过杂交形成双链，加入DSN酶剪切DNA-miRNA双链中的DNA，然后，释放出miRNA与DNA探针杂交，进入下一个循环。循环往复从而将尽可能多的DNA探针剪切，然后检测DNA探针数量的改变实现miRNA浓度定量检测。该检测方法的优点是通过DSN酶的剪切作用，放大检测信号。该检测方法不需要进行聚合酶链式反应(PCR)，很大程度上避免了非特异性扩增，提高了检测的特异性。用DSN信号放大机制与不同原理的生物传感器结合，可以实现对miRNA的超灵敏检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器及其制备方法和检测方法，用于实现对肺癌miRNA标志物的高灵敏性和高特异性检测。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器的制备方法，其步骤是：
通过量子点表面共价偶联的链霉亲和素和DNA末端修饰的生物素的连接，构建QD-DNA生物探针；
通过磁珠表面共价偶联的链霉亲和素和DNA末端修饰的生物素的连接，构建MB-DNA生物探针。
进一步的，所述QD-DNA生物探针中，QD和DNA的摩尔比为1：10；MB-DNA生物探针中，MB和DNA的比为6×10-2mg：7×10-5μmol。
进一步的，所述构建QD-DNA生物探针的步骤为：取SA-QD、Biotin-DNA、封闭液、Tris-HCl缓冲液，加入低吸附离心管中以转速6000rpm/min振荡1～2小时，构建好QD-DNA探针，然后以转速为4000rpm超滤5min，除去未与QD连接的DNA，超滤过程重复3次，最后一次超滤到得到的QD-DNA探针溶液，加入Tris-HCl缓冲液和封闭液，得到高浓度QD-DNA探针，将构建的高浓度QD-DNA探针分成若干等分，然后每份加入Tris-HCl缓冲液和封闭液，得到QD-DNA生物探针。
进一步的，所述封闭液为牛血清白蛋白和吐温-20的混合水溶液，其中，牛血清白蛋白的浓度为0.1mg/mL，吐温-20的质量浓度为0.1％。
进一步的，所述构建MB-DNA生物探针的步骤为：取MB、Biotin-DNA、MB-DNA缓冲液，加入到低吸附离心管中以转速为6000rpm/min振荡1～2小时，构建好MB-DNA探针，然后磁分离清洗，加入Tris-HCl缓冲液，得到高浓度的MB-DNA探针；将高浓度的MB-DNA探针溶液分成若干等分，每份再加入杂交缓冲液，得到MB-DNA生物探针。
进一步的，振荡过程中，每隔30min将离心管中溶液混匀一次，使MB与DNA能够充分连接。
进一步的，所述MB-DNA缓冲液的组成为：浓度为5mM的Tris-HCl，浓度为1M的NaCl，余量为水；MB-DNA缓冲液的pH＝7.4。
一种由上述方法制备得到的基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器。
一种基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器的检测方法，包括以下步骤：
步骤a，将MB-DNA探针与目标miRNA-21碱基互补配对，形成双链结构，加入DSN非特异性剪切DNA-RNA双链中的DNA，释放出游离的目标miRNA-21，miRNA-21继续与未被剪切的MB-DNA探针杂交形成双链结构，则DSN继续剪切，循环往复直到将MB-DNA剪切完毕；
步骤b，DSN剪切DNA-RNA双链结束后，在剩余的MB-DNA探针中加入QD-DNA探针，通过碱基互补配对形成三明治结构，磁分离后，有些QD-DNA探针未被捕获而游离在上清液中，通过检测上清液中QD的荧光强度，发现随着目标miRNA浓度的增大，量子点的荧光强度逐渐增大，通过对比未加入目标miRNA的荧光强度，来实现对目标miRNA的定性和定量检测。
进一步的，所述步骤a中，加入MB-DNA探针的浓度为3.2mg/mL，反应的温度为50℃，反应时间为90min，反应DSN酶浓度为1U。
进一步的，所述步骤b中，加入的QD-DNA探针的浓度为0.4μM。
有益效果：本发明提供了一种基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器及其制备方法和检测方法，利用量子点优良的光学特性，并且与传统的离心分离方法相比，基于磁珠的磁分离更省时、分离效果更理想，还可以起到富集样品的作用。本发明通过构建量子点-磁珠(QD-MB)传感体系的生物探针，集合DSN酶实现信号放大机制，实现对miRNA的检测。该传感器具有较高的检测灵敏度，较宽的线性范围，较好的检测特异性。本发明的生物探针具有操作灵敏度高、操作方便、成本较低符合环境友好的优点。
附图说明
图1为本发明实施例1所得QD及其连接产物QD-DNA-21探针的琼脂糖凝胶电泳表征(UV)；
图2为本发明实施例3所得QD-DNA-21探针的紫外表征图(UV)；
图3为本发明实施例1所得QD-DNA-21探针的Zeta电位表征图；
图4为本发明实施例4所得MB-DNA-21探针紫外表征图(UV)；
图5为本发明实施例2所得MB-DNA-21探针的zeta电位表征图；
图6为本发明实施例1、2、5所得QD-MB传感器检测目标miRNA的浓度-信号响应曲线；
图7为本发明实施例1、2、5所得QD-MB传感器检测目标miRNA的工作曲线。
具体实施方式
本发明的一种基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器及其制备方法和检测方法，通过量子点和磁珠表面共价偶联的链霉亲和素和DNA末端修饰的生物素的连接，构建QD-DNA生物探针和MB-DNA生物探针。
其中，QD-DNA生物探针中，QD和DNA的摩尔比为1：10；MB-DNA生物探针中，MB和DNA的比为6×10-2mg：7×10-5μmol。
构建QD-DNA生物探针的步骤为：取22.5μL浓度为1μM的SA-QD、22.5μL浓度为10μM的Biotin-DNA、200μL封闭液、600μL Tris-HCl缓冲液加入低吸附离心管中以转速6000rpm/min振荡1～2小时，将构建好的QD-DNA探针超滤，除去未与QD连接的DNA，其中，超滤的转速为4000rpm，时间为5min，超滤过程重复3次，最后一次超滤到剩100μL QD-DNA探针溶液，加入75μL Tris-HCl缓冲液和50μL封闭液，得到高浓度QD-DNA探针，将构建的高浓度QD-DNA探针10等分：每一份取22.5μLQD-DNA探针，加135μL Tris-HCl缓冲液和67.5μL封闭液。
构建MB-DNA生物探针的步骤为：取45μL浓度为10mg/mL的MB、45μL浓度为10μM的Biotin-DNA、600μL Tris-HCl缓冲液，加入到低吸附离心管中以转速为6000rpm/min振荡1～2小时，振荡过程中，每隔30min将离心管中溶液混匀一次，使MB与DNA能够充分连接；将构建好的MB-DNA探针磁分离清洗，加入225μL Tris-HCl缓冲液，得到高浓度的MB-DNA探针；将高浓度的MB-DNA探针溶液10等分：每一份取22.5μL MB-DNA探针溶液，再加入227.5μL杂交缓冲液定容至250μL。
其中，封闭液为牛血清白蛋白(BSA)和吐温-20的混合水溶液，其中，牛血清白蛋白(BSA)的浓度为0.1mg/mL，吐温-20的质量浓度为0.1％。
Tris-HCl缓冲液的组成为：浓度为30mM的Tris-HCl，浓度为0.5M的NaCl，浓度为10mM的MgCl2，余量为水；Tris-HCl缓冲液的pH＝8.0。
MB-DNA缓冲液的组成为：浓度为5mM的Tris-HCl，浓度为1M的NaCl，余量为水，MB-DNA缓冲液的pH＝7.4。
本发明的基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器的检测方法，包括以下步骤：
步骤a，将MB-DNA探针与目标miRNA-21碱基互补配对，形成双链结构，加入DSN非特异性剪切DNA-RNA双链中的DNA，释放出游离的目标miRNA-21，miRNA-21继续与未被剪切的MB-DNA探针杂交形成双链结构，则DSN继续剪切，循环往复直到将MB-DNA剪切完毕；其中，加入MB-DNA探针的浓度为3.2mg/mL，反应的温度为50℃，反应时间为90min，反应DSN酶浓度为1U；
步骤b，DSN剪切DNA-RNA双链结束后，在剩余的MB-DNA探针中加入QD-DNA探针，通过碱基互补配对形成三明治结构，磁分离后，有些QD-DNA探针未被捕获而游离在上清液中，通过检测上清液中QD的荧光强度，发现随着目标miRNA浓度的增大，量子点的荧光强度逐渐增大，通过对比未加入目标miRNA的荧光强度，来实现对目标miRNA的定性和定量检测；其中，加入的QD-DNA探针的浓度为0.4μM。
名词解释：
QD：量子点；
MB：磁珠；
SA：Streptavidin，链霉亲和素。
下面通过实例进一步阐述本发明，但本发明的保护范围并不受限于这些实例。
实施例1
取22.5μL浓度为1μM的SA-QD(Streptavidin QD)、22.5μL浓度为10μM的Biotin-DNA、200μL封闭液、600μLTris-HCl缓冲液加入1.5mL低吸附离心管中以转速6000rpm/min振荡1小时，构建好QD-DNA探针，然后以转速为4000rpm超滤5min，除去未与QD连接的DNA，超滤过程重复3次。最后一次超滤到剩100μLQD-DNA探针溶液，加入75μL Tris-HCl缓冲液和50μL封闭液，得到高浓度QD-DNA探针。将构建的高浓度QD-DNA探针10等分：每一份取22.5μLQD-DNA探针，加135μL Tris-HCl缓冲液和67.5μL封闭液。
量子点表面带负电，DNA表面带负点，QD与DNA连接后负电荷密度增大，在相同电压激发下迁移速率会更快。通过图1可以看出QD和QD-DNA移动速度不同，明显QD-DNA-21移动速度更快，可以证明QD上连接上了DNA。分子或体系中粒子粒径越小，Zeta电位正负值越大，体系将越稳定。相反，Zeta电位正负值越小，越倾向于聚集，即分子或微小粒子之间的吸引力超过了排斥力，使它们发生了凝聚。从图3看出QD和DNA连接产物的电位较明显QD减小，可以证明DNA连接到了QD上。
实施例2
在实验前用连接-洗涤缓冲液(B&W Buffer)清洗3～4次MB，除去母液中叠氮化钠等物质，取45μL浓度为10mg/mL的MB、45μL浓度为10μM的Biotin-DNA、600μL Tris-HCl缓冲液，加入到低吸附离心管中以转速为6000rpm/min振荡2小时，构建好MB-DNA探针。因为MB粒径较大(粒径为1μm)，易产生沉降，所以每隔30min将离心管中溶液混匀一次，使MB与DNA能够充分连接。将构建好的MB-DNA探针磁分离清洗3次，加入225μL Tris-HCl缓冲液，得到高浓度的MB-DNA探针。将MB-DNA探针溶液10等分：每一份取22.5μL高浓度的MB-DNA探针溶液，再加入227.5μL杂交缓冲液定容至250μL。
从上图5可以看到MB-DNA-21探针电位较MB电位明显减小，可以表明MB连接上了DNA。
实施例3
取12μL浓度为1μM SA-QD(Streptavidin QD)、30μL浓度为10mM的Biotin-DNA、200μL封闭液、600μL Tris-HCl缓冲液，加入1.5mL低吸附离心管中以转速为6000rpm/min振荡2小时，以构建QD-DNA生物探针。将连接产物转移到超滤管中以转速为4000rpm超滤5min，以尽可能除去上层液中没有连接在QD上的DNA，连续超滤三次，取出超滤管将上层液用移液枪混匀防止QD在滤膜上粘附。将上层液取出用超纯水将溶液定容到550μL，用超纯水配制同等浓度的QD溶液。
DNA与QD通过链霉亲和素和生物素作用偶连在一起，则对QD-DNA探针进行紫外表征可以观察到DNA的特征吸收峰。从图2中可见，QD与DNA连接产物在260nm处有明显的特征吸收峰，可以表明QD上连接上了DNA。
实施例4
取12μL浓度为10mg/mL的MB、30μL浓度为10μM的Biotin-DNA、600μL Tris-HCl缓冲液，加入1.5mL低吸附离心管中以转速为6000rpm/min振荡2小时。取12μL浓度为10mg/mL的MB、630μL Tris-HCl缓冲液，加入1.5mL低吸附离心管中以转速为6000rpm/min振荡2小时，作为构建的MB-DNA探针的对照组。将构建好的MB-DNA探针和同样处理的MB磁分离，然后用超纯水清洗，重复三次，清除干净游离的DNA，用超纯水定容到640μL，将MB用超纯水清洗三次定容到640μL。
DNA与MB通过链霉亲和素和生物素作用偶连在一起，则对MB-DNA探针进行紫外表征可以观察到DNA的特征吸收峰。从图4中可见，DNA与MB的连接产物在260nm处有明显的DNA特征吸收峰，可以表明MB接上了DNA。
实施例5
将10μL的MB-DNA探针、2μL的10×DSN buffer，1μL酶浓度为1U的DSN，7μL的DEPC水，不同浓度的的miR-21(反应终浓度为1μM、100nM、10nM、1nM、100pM、10pM、1pM)，其中：DSN溶解在Tris-HCl溶液和甘油的溶液中，Tris-HCl溶液中Tris-HCl的浓度为25mM，pH＝8.0，甘油的质量分数为50％，；溶液在恒温混匀仪中振荡90min。反应结束后加入2×DSN stop溶液5μL，在混匀仪中轻微振荡5min，然后磁分离5min，并用超纯水清洗，重复3次。除去上清液，加入构建好的QD-DNA探针10μL和杂交缓冲液80μL，在混匀仪中振荡90min，加灭菌水定容到250μL，磁分离5min，取上清液加入比色皿中测荧光。
图6显示了不同浓度的miRNA-21(100nM、10nM、1nM、100pM、10pM、1pM)与不添加miRNA做对比，在加入miRNA之后通过荧光图谱可以发现随着加入的目标miRNA浓度的增大，荧光强度是逐渐增大的。图7中F是加入不同目标miRNA时的荧光强度，F0是不加入miRNA时的荧光强度，可以发现1-F/F0是随着目标miRNA的指数浓度的增大而逐渐增大的，在1pM-10nM范围内，ΔF与log[CmiRNA-200b]成线性关系，并且ΔF/F0＝0.0426×log[CmiRNA-200b]-0.0226，R2＝0.99572。可以计算出miRNA-200b检测限是0.73fM，检测范围是1pM到10nM，miRNA-21检测限是0.12pM，检测范围是1pM到10nM。
对上述实例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器的制备方法，其特征在于：其步骤是：
通过量子点表面共价偶联的链霉亲和素和DNA末端修饰的生物素的连接，构建QD-DNA生物探针；
通过磁珠表面共价偶联的链霉亲和素和DNA末端修饰的生物素的连接，构建MB-DNA生物探针。
2.根据权利要求1所述的基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器的制备方法，其特征在于：所述QD-DNA生物探针中，QD和DNA的摩尔比为1：10；MB-DNA生物探针中，MB和DNA的比为6×10-2mg：7×10-5μmol。
3.根据权利要求1或2所述的基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器的制备方法，其特征在于：所述构建QD-DNA生物探针的步骤为：取SA-QD、Biotin-DNA、封闭液、Tris-HCl缓冲液，加入低吸附离心管中以转速6000rpm/min振荡1～2小时，构建好QD-DNA探针，然后以转速为4000rpm超滤5min，除去未与QD连接的DNA，超滤过程重复3次，最后一次超滤到得到的QD-DNA探针溶液，加入Tris-HCl缓冲液和封闭液，得到高浓度QD-DNA探针，将构建的高浓度QD-DNA探针分成若干等分，然后每份加入Tris-HCl缓冲液和封闭液，得到QD-DNA生物探针。
4.根据权利要求3所述的基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器的制备方法，其特征在于：所述封闭液为牛血清白蛋白和吐温-20的混合水溶液，其中，牛血清白蛋白的浓度为0.1mg/mL，吐温-20的质量浓度为0.1％。
5.根据权利要求1过2所述的基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器的制备方法，其特征在于：所述构建MB-DNA生物探针的步骤为：取MB、Biotin-DNA、MB-DNA缓冲液，加入到低吸附离心管中以转速为6000rpm/min振荡1～2小时，构建好MB-DNA探针，然后磁分离清洗，加入Tris-HCl缓冲液，得到高浓度的MB-DNA探针；将高浓度的MB-DNA探针溶液分成若干等分，每份再加入杂交缓冲液，得到MB-DNA生物探针。
6.根据权利要求5所述的基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器的制备方法，其特征在于：振荡过程中，每隔30min将离心管中溶液混匀一次，使MB与DNA能够充分连接。
7.根据权利要求5所述的基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器的制备方法，其特征在于：所述MB-DNA缓冲液的组成为：浓度为5mM的Tris-HCl，浓度为1M的NaCl，余量为水；MB-DNA缓冲液的pH＝7.4。
8.一种由权利要求1-7任一所述的方法制备得到的基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器。
9.一种权利要求8所述的基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤a，将MB-DNA探针与目标miRNA-21碱基互补配对，形成双链结构，加入DSN非特异性剪切DNA-RNA双链中的DNA，释放出游离的目标miRNA-21，miRNA-21继续与未被剪切的MB-DNA探针杂交形成双链结构，则DSN继续剪切，循环往复直到将MB-DNA剪切完毕；
步骤b，DSN剪切DNA-RNA双链结束后，在剩余的MB-DNA探针中加入QD-DNA探针，通过碱基互补配对形成三明治结构，磁分离后，有些QD-DNA探针未被捕获而游离在上清液中，通过检测上清液中QD的荧光强度，发现随着目标miRNA浓度的增大，量子点的荧光强度逐渐增大，通过对比未加入目标miRNA的荧光强度，来实现对目标miRNA的定性和定量检测。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：
所述步骤a中，加入MB-DNA探针的浓度为3.2mg/mL，反应的温度为50℃，反应时间为90min，反应DSN酶浓度为1U；
所述步骤b中，加入的QD-DNA探针的浓度为0.4μM。
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