CN108827923B - 一种低成本无酶免标快速检测有机磷农药的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低成本无酶免标快速检测有机磷农药的新方法,主要是基于富含鸟嘌呤碱基序列的DNA[G3T]5与镧系金属Tb3+形成的复合材料,由于发生能量转移效应,[G3T]5能量转移给Tb3+,使Tb3+产生荧光,再加入一定量的银纳米粒子(AgNPs)溶液后Tb3+荧光显著增强,加入有机磷农药可引起Tb3+荧光的降低,其荧光降低与加入有机磷农药的浓度呈线性相关。本发明提供的方法非常简单、造价低、稳定性好、检测速度快,可进一步研制相应的试剂盒和试纸条,以满足现场快速、准确的检测要求。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析领域,具体涉及一种低成本无酶免标快速检测有机磷农药的新方法,本发明属于检测技术领域。
背景技术
有机磷农药(OPs)因具有品种多、药效高等特点,已逐渐成为我国应用最广、使用量最大的一类杀虫剂,是农作物病虫害防治的主要措施。其发挥作用的主要机理是在体内与胆碱酯酶形成磷酰化胆碱酯酶,胆碱酯酶活性受抑制,从而不再分解乙酰胆碱,导致组织中乙酰胆碱过量蓄积,胆碱使得神经过度兴奋,引起毒蕈碱样、烟碱样和中枢神经系统症状。由于农药具有毒性高、持久性长的特点,不仅对环境造成极大的污染,农产品中农药残留过多也严重威胁着国民身体健康。
目前对于有机磷农药检测方法主要有气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法以及酶抑制法、电化学法等(Journal of separation science 2016,39,2164-2171.;Food Chemistry,2010,122,327-332.;Food Chemistry,2012,131,1569-1576.;Analytical Chemistry,2014,86,11727-11733.;Biosensors andBioelectronics,2015,68,168-174.;ACS applied materials&interfaces,2016,8,58-8067),这些方法均存在一定不足。色谱类分析方法需要大型分析仪器,过程操作繁琐,不能实现现场检测。酶抑制法被应用于构建电化学传感器、荧光传感器及比色传感器用于对农药的检测,其主要是基于有机磷对乙酰胆碱酶的抑制作用,而酶不仅价格高,且容易变性不易保存,酶的使用不仅增加检测成本,对检测结果的准确度也有一定的影响。这类检测方法已无法满足大批量农产品快速检测和国内外有关食品的现场快速检测需要。因此,亟需开发简单、无酶、灵敏度高、且成本低的快速检测有机磷农药的方法。
发明内容
对目标物有机磷农药实现高灵敏、高精准、简单的快速检测方法是分析化学的一个重要发展方向。针对以上存在的问题,我们开发了一种无酶、免标、成本低的快速检测有机磷农药的新方法。其操作过程简单、成本低,且检测结果具有良好的重现性,确保了检测结果的准确度。为达到上述目的,本发明创造的技术方案如下:
本发明提供了一种低成本无酶快速检测有机磷农药的新方法。将Tb3+和[G3T]5两种溶液混合(物质的量的浓度比为1:50),然后向混合溶液中加入一定量的银纳米颗粒(AgNPs),三者共同在室温下孵育10min,有机磷农药检测的传感体系([G3T]5/Tb3+/AgNPs)即构建完成,此种情况下Tb3+产生很强的荧光。在加入甲基对硫磷后,Tb3+荧光强度显著降低,其荧光降低与甲基对硫磷浓度呈线性相关,通过检测Tb3+荧光强度即可实现对甲基对硫磷的快速检测。该方法避免了乙酰胆碱酯酶的使用,不仅降低了检测成本,还简化了实验操作,提高了检测结果的准确性、可靠性。
本发明具体包括以下步骤:
(1)制备[G3T]5/Tb3+/AgNPs的生物传感体系,其中[G3T]5、Tb3+及AgNPs的终浓度分别为0.2μM,10μM,15ρM。加入0-150μg/L不同浓度的OPs,室温下孵育10min,然后用荧光分光光度仪检测Tb3+的荧光强度,所用激发波长为290nm。
(2)以Tb3+荧光响应为纵坐标,以甲基对硫磷浓度为横坐标对检测数据进行处理,然后进行线性拟合,得到线性回归方程。
进一步,本发明所述AgNPs的合成
制备方法为:取50mL 40%甘油加进烧瓶中,在油浴锅(1200rpm)中加热至95℃,9.0mg的硝酸银和1.0mL 3%的柠檬酸钠,依次加入烧瓶中,在1200rpm和95℃下反应一小时,制得AgNPs胶体种子溶液。另准备一个烧瓶,依次加入138mL去离子水,23mL甘油和0.58g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),置于磁力搅拌器上1200rpm反应10min,加入上述合成的AgNPs胶体种子溶液14.4mL继续搅拌1min,最后加入9.2mg的抗坏血酸,继续搅拌10min后得到粒径在44nm左右的AgNPs。所制备的AgNPs具有很好的分散性,且粒径分布均匀。最主要的优点是不需要酶的参与,传统的检测方法大都是用农药来抑制乙酰胆碱酯酶活性,间接检测农药,而酶对环境(如温度)要求高且价格高昂;且我们这个传感体系只需一步简单混合,操作简单,加入农药后,反应灵敏且快速。
本发明所述的方法是一种快速检测有机磷农药的新方法。相对于现有技术,本发明创造所述的OPs检测方法具有以下优势:本发明利用[G3T]5/Tb3+/AgNPs混合纳米材料检测OPs,具有操作简单、无酶、免标记、灵敏度高、方法简单且成本低的优势。
附图说明
构成本发明创造的附图用来提供对本发明创造的进一步理解,本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造,并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中:
图1为本发明创造实施例所述的[G3T]5/Tb3+/AgNPs生物传感体系检测甲基对硫磷的原理验证相关实验数据。
图2为本发明创造实施例所述的优化构建有机磷农药生物传感体系所用AgNPs浓度情况下Tb3+的荧光响应数据。
图3为本发明创造实施例所述的为检测甲基对硫磷的反应时间优化数据。
图4为本发明创造实施例所述的生物传感体系荧光强度随甲基对硫磷浓度变化的荧光曲线。
图5为本发明创造实施例所述的生物传感体系荧光强度随甲基对硫磷浓度变化在545nm处荧光值的线性拟合曲线及方程。
具体实施方式
为了使本发明上述特征和发明创造中优化条件更加清楚和容易理解,下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步详细描述。
[G3T]5/Tb3+,AgNPs与甲基对硫磷三者反应的体系是600μL(包括[G3T]5/Tb3+,AgNPs和不同浓度的甲基对硫磷),下面给出的三者的浓度都是在600μL体系下的终浓度。
实施例1
50mL 40%甘油于油浴锅(1200rpm)中加热至95℃,分别加入9.0mg的硝酸银和1.0mL 3%的柠檬酸钠,继续反应一小时,制得AgNPs胶体种子溶液备用。分别取138mL去离子水,23mL甘油和0.58g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),充分混合,置于磁力搅拌器上1200rpm反应10min,加入上述合成的AgNPs胶体种子溶液14.4mL继续搅拌1.0min,最后加入9.2mg的抗坏血酸,继续搅拌10min后得到粒径在AgNPs的粒径控制在40-50nm。后面选择44nm的AgNPs做后面的试验,效果最好。
实施例2
检测原理可行性验证:在以下各情况下利用荧光分光光度仪检测Tb3+荧光强度(如图1所示):a):[G3T]5/Tb3+混合溶液([G3T]5:0.2μM,Tb3+:10μM);b):15pM AgNPs与[G3T]5/Tb3 +混合后;c):[G3T]5/Tb3+/AgNPs与100μg/L甲基对硫磷混合后。激发波长为290nm,发射波长范围为475~560nm。
实施例3
优化AgNPs浓度(见图2):[G3T]5/Tb3+混合溶液([G3T]5:0.2μM,Tb3+:10μM)加入不同浓度AgNPs(0,2.5,5,7.5,10,12.5,15,17.5,20ρM)后测定Tb3+的荧光强度。激发波长290nm,发射波长范围为475~560nm。以Tb3+在545nm处荧光强度为输出信号,以AgNPs浓度为横坐标进行数据处理。
实施例4
优化反应时间(见图3):0.2μM[G3T]5,10μM Tb3+,15pM与100μg/L甲基对硫磷混合孵育不同的时间(0,2,5,10,15,20,25min),测定Tb3+的荧光强度。激发波长290nm,发射波长范围为475~560nm。以Tb3+在545nm处荧光强度为输出信号,以反应时间为横坐标进行数据处理。
实施例5
有机磷农药的灵敏度检测(见图4):0.2μM[G3T]5,10μM Tb3+,15ρM与0-150μg/L的甲基对硫磷混合反应10min,测定Tb3+的荧光强度。激发波长290nm,发射波长范围为475~560nm。
实施例6
0.2μM[G3T]5,10μM Tb3+,15ρM与0-150μg/L的甲基对硫磷混合反应10min,以Tb3+的发射波长范围内545nm处的荧光强度值为输出信号,对实施例5所得数据进行线性拟合获得线性方程:
y=-0.194x+0.742 (R2=0.993) 式(1)
实施例7
实际样品检测:以标准加入法对所发展检测新方法在实际样品检测中的应用进行验证,在待测苹果汁和西红柿汁中分别添加甲基对硫磷量为:0.25,1.0,7.5μg/L;再加入0.2μM[G3T]5,10μM Tb3+和15pM的混合溶液,在相同条件下进行样品检测。根据检测结果利用所得线性方程式(1)计算得出实际检出浓度,据此计算加标回收率(见表1)、
表1
检测回收率在91-110%范围内,说明此方法可应用于有机磷农药的实际样品检测。
本方法检测有机磷农药,同样也可以将其应用在试纸条的开发,可将[G3T]5、Tb3+和AgNPs进行混合浸泡在不同的材质的试纸条上,将不同浓度的有机磷农药进行点样,在紫外灯下Tb3+的绿色荧光随着农药浓度的加大,肉眼可明显观察到绿色荧光逐渐减弱。根据本方法检测原理也可开发相应试剂盒,以来满足现场等快速、灵敏检测有机磷农药的需求。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例,并不用于限制本发明创造,凡在本发明创造的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明创造的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种快速检测甲基对硫磷的方法,将[G3T]5和Tb3+两种溶液混合,两种溶液的摩尔浓度比为1:50,再向混合溶液中加入AgNPs溶液,Tb3+由于被敏化产生荧光,通过加入甲基对硫磷后Tb3+荧光显著降低,从而实现对有机磷农药浓度的检测,其特征在于:
具体操作方法如下:
(1) 在0.2μM [G3T]5和 10μM Tb3+混合溶液中,加入15pM的AgNPs溶液,反应10 min后,加入不同浓度的甲基对硫磷溶液,而后用荧光分光光度仪器检测传感体系的荧光强度,其激发波长为290 nm,发射波长为490nm和545nm;所述AgNPs溶液制备方法为:取50 mL 40 %甘油加进烧瓶中,在油浴锅加热至95 ℃,同时以1200 rpm 的速度不断搅拌,9 mg的硝酸银和1 mL 3 %的柠檬酸钠,依次加入烧瓶中,继续在搅拌速度1200 rpm,温度95 ℃条件下反应一小时,制得AgNPs胶体种子溶液;另准备一个烧瓶,依次加入138 mL去离子水,23 mL甘油和0.58 g 聚乙烯吡咯烷酮, 置于磁力搅拌器上1200 rpm反应10 min,加入合成的AgNPs胶体种子溶液14.4 mL 继续搅拌1 min,最后加入9.2 mg的抗坏血酸,在常温下搅拌10 min以制得粒径在40-50 nm的AgNPs;
(2) 以传感体系荧光响应为纵坐标,以甲基对硫磷浓度为横坐标对检测数据进行处理,然后进行线性拟合,得到线性回归方程。
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