CN108823194B - 一种尘螨蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种尘螨蛋白，所述尘螨蛋白包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少98％同源性的氨基酸序列中的至少一种，所示尘螨蛋白可以用于预防、缓解和治疗过敏性疾病，尤其是尘螨引起的过敏性疾病的药物中的应用。本发明通过基因克隆、蛋白表达和纯化，得到重组尘螨蛋白，其蛋白纯度高、产量丰富，有利于后续科研使用和大量制备应用，尤其在制备诊断、预防、治疗过敏性疾病的药物中的应用。

Description

一种尘螨蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种尘螨蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

过敏性哮喘是临床上常见病和多发病，发病率逐年上升，目前世界上有近3亿人受过敏性哮喘困扰，是目前社会面临的重大公共卫生问题。其中尘螨是最主要的过敏原，是导致呼吸道过敏性疾病的最重要因素。近20年来T细胞亚群中Th1/Th2细胞的平衡失调被认为是诱发过敏性哮喘的主要机制之一。在自然界存在众多过敏原的情况下，过敏性哮喘患者对尘螨过敏原阳性率高达70-80％，而对其它过敏原阳性率一般低于＜40％。目前，虽然对治疗过敏性哮喘有了一定的研究，但是有效的特异性手段却相对较少。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种尘螨蛋白，通过基因克隆、蛋白表达和纯化，得到重组的尘螨蛋白，所述尘螨蛋白在预防、缓解和治疗过敏性疾病，尤其涉及尘螨引起的过敏性疾病的药物中具有广泛的应用前景。

第一方面，本发明提供了一种尘螨蛋白，所述尘螨蛋白包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少98％同源性的氨基酸序列中的至少一种。

可选的，所述尘螨蛋白为粉尘螨来源。

可选的，所述尘螨蛋白为蛋白质二硫键异构酶。

可选的，所述尘螨蛋白的编码基因包括编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

可选的，所述尘螨蛋白的编码基因包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

可选的，所述尘螨蛋白的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:2具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:1。

在本发明中，术语“同源性”表明任何两个(或两个以上)肽、多肽或蛋白质序列具有一定程度上(“％同源”)与彼此“相同”的氨基酸序列。这种同源性程度可以使用已知的计算机程序来确定。具体的，可以但不限于NCBI数据库中的BLAST工具可被用于确定同源性。在本发明中，所述同源性至少为98％。进一步可选的，所述同源性至少为99％。

可选的，所述尘螨蛋白为非过敏原蛋白。进一步可选的，所述尘螨蛋白与过敏原相互竞争抑制过敏反应。在本发明中，所述尘螨蛋白不具有过敏原性。

第二方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体包含编码如第一方面所述的尘螨蛋白的核苷酸序列。

可选的，所述重组载体包括重组表达载体和重组克隆载体中的至少一种。进一步可选的，所述重组载体中含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，具体的，所述尘螨蛋白的编码基因插入至BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间。可选地，所述尘螨蛋白的编码基因插入到载体时，所述尘螨蛋白的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)，3’端可加入终止密码子(如TAA)。

可选的，所述重组载体中含有纯化标签，具体的可以但不限于为His标签、GST标签、SUMO标签。

可选的，所述重组载体可以但不限于为pET-32a、pGEX-6P-1、pPIC-9K、pPIC-Zα中的至少一种。

第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如第二方面所述的重组载体。

可选的，所述宿主细胞包括克隆宿主细胞和表达宿主细胞中的至少一种。具体的，所述宿主细胞可以但不限于为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、动物细胞、植物细胞。具体的，可以但不限于为大肠杆菌DH5α、大肠杆菌Top10、大肠杆菌Orgami(DE3)、毕赤酵母GS115、毕赤酵母SMD1168。

第四方面，本发明提供了一种尘螨蛋白的制备方法，包括：

(1)提取尘螨总蛋白，分离并鉴定得到尘螨蛋白，通过PCR获得所述尘螨蛋白的编码基因，所述尘螨蛋白的编码基因包括编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)将所述尘螨蛋白的编码基因插入到表达载体中，得到重组质粒；

(3)将所述重组质粒转至表达宿主细胞中，进行蛋白质表达和纯化，获得尘螨蛋白。

可选的，如第三方面所述的宿主细胞为表达宿主细胞时，所述制备尘螨蛋白的方法，还可以为：培养如第四方面所述的宿主细胞，经过蛋白质的表达和纯化，得到所述尘螨蛋白。具体的，可以但不限于当所述宿主细胞为大肠杆菌表达宿主细胞时，将所述大肠杆菌在LB培养基中培养，并在培养过程中加入异丙基硫代半乳糖苷进行尘螨蛋白诱导表达，经离心、裂解、溶菌、超声后，经过镍柱进行分离纯化，得到尘螨蛋白。

可选的，所述提取尘螨总蛋白可以但不限于为提取粉尘螨总蛋白。

第五方面，本发明提供了一种组合物，包括如第一方面所述的或如第四方面所述的制备方法制得的尘螨蛋白。

可选的，所述组合物还包括药学上可接受的载体。进一步可选的，所述药学上可接受的载体包括溶剂、聚合物和脂质体中的至少一种，但不限于此。更进一步可选的，所述溶剂包括但不限于水、生理盐水，以及其他非水性溶剂。具体的，所述聚合物可以但不限于为聚赖氨酸、聚乙烯亚胺及其改性物、壳聚糖、聚乳酸、明胶、环糊精。具体的，所述脂质体可以但不限于为胆固醇、豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂。更进一步可选的，所述药学上可接受的载体还包括稀释剂和赋形剂中的一种或多种。可选的，所述稀释剂包括淀粉类、糖类、纤维素类和无机盐中的一种或多种。所述赋形剂包括片剂中的黏合剂、填充剂、润滑剂，半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分，液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、着色剂中的至少一种。

在本发明中，所述组合物还可以包括其他活性成分，所述活性成分根据所述组合物的用途进行选择，在此不作限定。

第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述的尘螨蛋白、如第二方面所述的重组载体、如第三方面所述的宿主细胞、如第四方面所述的制备方法制得的尘螨蛋白、或如第五方面所述的组合物在预防、缓解、治疗过敏性疾病的药物中的应用。

尤其是在预防、缓解、治疗尘螨引起的过敏性疾病中的应用。进一步可选的，在预防、缓解、治疗过敏性哮喘、鼻炎、慢性荨麻疹的药物中的应用。

具体的，可以但不限于，所述尘螨蛋白通过与过敏原相互竞争抑制过敏症状的产生，所述过敏症状可以但不限于为炎症反应；所述尘螨蛋白用于预防、缓解、治疗过敏性疾病的药物中，所述过敏性疾病的药物可以但不限于通过增强免疫耐受型细胞因子表达来减弱过敏反应。

可选的，所述药物为生物药物和化学药物中的至少一种。所述生物药物为多肽类药物、蛋白药物和基因药物中的一种或多种。

可选的，所述药物还包括其他药学上可接受的预防、缓解、治疗过敏性疾病的活性成分。

可选的，所述药物的形式包括片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、溶液剂或混悬剂。

所述应用具体可以但不限于为：提供一种试剂盒，所述试剂盒中包括了如第一方面所述的尘螨蛋白、如第二方面所述的重组载体、如第三方面所述的宿主细胞、或如第四方面所述的组合物、或如第五方面所述的制备方法制得的尘螨蛋白。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的尘螨蛋白不具有过敏原性，同时能够与过敏原相互竞争抑制过敏症状的产生，减弱过敏原诱发的过敏反应，在预防、缓解和治疗过敏性疾病，特别是尘螨引起的过敏性疾病的药物中具有广泛的应用前景；

(2)本发明通过基因克隆、蛋白表达和纯化，得到重组尘螨蛋白，蛋白纯度高、产量丰富，有利于后续大量制备和研究使用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的尘螨蛋白SDS-PAGE图；

图2是本发明实施例提供的尘螨蛋白免疫学特性鉴定图，其中图2中(a)为Westernblotting分析图，图2中(b)为Elisa分析图；

图3是本发明实施例提供的尘螨蛋白与OVA诱导的气道高反应的关系图；

图4是本发明实施例提供的尘螨蛋白与肺部炎症反应的关系图；

图5是本发明实施例提供的尘螨蛋白与小鼠血清中sIgE，sIgG1，sIgG2a含量的关系图，其中图5中(a)为小鼠血清中sIgE的测定图，图5中(b)为小鼠血清中sIgG1的测定图，图5中(c)为小鼠血清中sIgG2a的测定图；

图6是本发明实施例提供的尘螨蛋白与血清中细胞因子含量的关系图，其中图6中(a)为干扰素γ表达的测定图，图6中(b)为IL-4细胞因子的测定图，图6中(c)为IL-5细胞因子的测定图，图6中(d)为IL-10细胞因子的测定图，图6中(e)为IL-13细胞因子的测定图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一 尘螨蛋白的制备

1、尘螨蛋白的克隆

提取粉尘螨总蛋白，分离并鉴定得到尘螨蛋白，通过PCR的方法获得其编码基因，如SEQ ID NO.1所示，经过基因合成技术将所述尘螨蛋白的核苷酸序列合成，并在所述尘螨蛋白的核苷酸序列N端添加BamHⅠ酶切位点及其保护碱基，在C端添加EcoRⅠ酶切位点及其保护碱基，对其进行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，同时对PET-32a进行BamHⅠ和和EcoRⅠ双酶切，两者的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收后将两者的双酶切产物混合在一起并加入T4DNALigase(连接酶)，16℃下进行连接反应16h，然后转化至大肠杆菌DH5α，将菌液涂布至LB平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落，提取质粒后双酶切验证。

2、尘螨蛋白的表达和纯化

将连接有尘螨蛋白编码基因的PET-32a重组载体转化至大肠杆菌DH5α经鉴定之后，进行培养，提取质粒，并转化至大肠杆菌BL21中，挑去阳性克隆培养，然后按1％接种量与LB培养基中培养，待菌生长至OD₆₀₀在0.6-0.9时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，诱导表达的重组蛋白，经离心、裂解、溶菌、超声，将上清液以2ml/min的速度上样于已平衡好的Ni-NTA柱。然后用平衡液充分洗柱，再分别用含40mmol/L、300mmol/L咪唑平衡缓冲液进行洗脱，收集各次洗脱液进行SDS-PAGE分析，结果如图1所示，其中图1中M表示蛋白质分子量标准(marker)，1泳道表示纯化后的尘螨蛋白，所述尘螨蛋白的相对分子量约为75KD，等电点为4.75。对制备得到的尘螨蛋白序列分析，发现其于蛋白质二硫键异构酶的同源性高，推测制备得到的尘螨蛋白为尘螨蛋白质二硫键异构酶(protein disulfideisomerase，PDI)。

效果实施例

为了评估本发明所描述的上述方法制备的尘螨蛋白的效果，进行如下效果实施例。

效果实施例1尘螨蛋白的免疫学特性鉴定

1、Western blotting分析

将制备得到的尘螨蛋白进行常规SDS-PAGE电泳，经湿法转移电泳使蛋白转至硝酸纤维素膜上，然后进行蛋白质印迹(Western blotting)分析，实验组中一抗为尘螨哮喘患者，对照组中一抗为正常人的血清，二抗均为标记生物素的羊抗人IgE，再与链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP)进行结合，利用DAB显色后水终止反应，根据显色结果判断其免疫原性。结果如图2中(a)所示，其中M为蛋白质分子量标准(marker)，1-2为正常人血清的实验结果，3-16为尘螨哮喘患者血清的实验结果，可以看出经过Western blotting的检测发现正常人和尘螨哮喘患者均未出现条带。

2、ELISA分析

在96孔板中每孔包被制备得到的尘螨蛋白100μl(1μg/ml)，3％BSA4℃封闭过夜进行ELISA实验，实验组以尘螨哮喘患者的血清(1:50的比例稀释)为一抗，对照组中一抗为正常人的血清，均在37℃孵育2h。之后每孔加入100μl生物素标记的抗人IgE(1:2000比例稀释)，37℃孵育2h。清洗5次，每孔加入100μl HRP标记的链霉亲和素(1:5000比例稀释)，37℃孵育1h。显色后37℃孵育10min，然后用2mol/L的浓硫酸终止反应。用自动酶标仪检测其在450nm处的吸光度，分析数据，结果如图2中(b)所示，其中P1-P2为正常人血清的实验结果，P3-P7为尘螨哮喘患者血清的实验结果，可以看出在ELSIA实验结果中尘螨患者与正常人相比并无显著性差异。

3、皮试检测分析

用生理盐水溶解尘螨蛋白，滴在尘螨患者前臂掌侧皮肤，用特制的点刺针刺破皮肤，使少量的尘螨蛋白进入皮肤内，擦干遗留的尘螨蛋白，15min后读结果，分别用生理盐水和组胺做阴性和阳性对照，以尘螨粗提蛋白和组胺所致风团面积比确定其反应级别，没有反应或者与阴性对照相同为“-”，比值为组胺风团的1/4以上时为“+”，等于或者大于组胺风团的1/2时为“++”，等于组胺风团时为“+++”，大于组胺风团的2倍时为“++++”，结果如表1

表1皮试检测尘螨蛋白的过敏原性

上述皮试实验显示，本发明制备得到的尘螨蛋白在尘螨敏感患者的皮试结果均为阴性，由此证明了该尘螨蛋白不具有过敏原性。

效果实施例2尘螨蛋白抑制OVA诱导的过敏性哮喘反应

1、尘螨蛋白抑制OVA诱导的气道高反应性和肺部炎症反应

将28只4-6周龄的BALB/c雌性小白鼠随机分为4组，利用磷酸缓冲盐溶液(PBS)为空白对照组，卵清蛋白(OVA)做阳性对照组，本发明制备的尘螨蛋白(以下效果实施例中均简称为“PDI”)做实验组，以及PDI与OVA混合物(PDI+OVA)做对照实验组分别免疫小鼠，在第0、7、14天在小鼠皮下分别注射100μl的PBS、OVA、PDI、PDI与OVA混合物，第21-23天激发：50μl/只，不同浓度的乙酰甲胆碱激发，检测气道高反应(AHR)，结果如图3所示，OVA组与PBS组相比，气道高反应性明显增强，尤其在25mg/mL、50mg/mL和100mg/mL三个乙酰甲胆碱的浓度增强的更明显；同时发现PDI组与PBS组相比没有显著性差异，而PDI+OVA组小鼠气道高反应性明显低于OVA组。

在第24天时处死小鼠并收集血清和肺组织。肺组织的固定：将取下的小鼠右中页放入多聚甲醛固定液中，往复摇床上放置24小时候后，进行脱水、石蜡包埋、HE染色。脱水步骤：将固定过夜的组织放在50％的乙醇中2h；70％乙醇2h；80％的乙醇Ⅰ、Ⅱ各30min；95％乙醇Ⅰ、Ⅱ各30min；100％乙醇Ⅰ、Ⅱ各15min；乙醇：二甲苯(1：1)10min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min；二甲苯：石蜡(1：1)10min；石蜡Ⅰ30min、Ⅱ1h、Ⅲ1.5h。石蜡包埋、切片后放于37℃过夜后进行HE染色。HE染色步骤：二甲苯染15min；无水乙醇二甲苯染10min；100％乙醇5分钟；95％乙醇5分钟；80％的乙醇2分钟；70％的乙醇2分钟；50％的乙醇2分钟；水洗1分钟；苏木素3分钟；1％的盐酸酒精20s；PBS(pH＝7.4)浸洗5分钟；50％的乙醇1分钟；80％的乙醇1分钟；伊红30s；95％乙醇1分钟；无水乙醇2分钟；二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各浸洗2分钟；中性塑胶封片。小鼠肺组织经过固定、脱水、包埋、切片、HE染色，如图4所示，OVA组小鼠肺组织显示肺组织和支气管结构紊乱，有内出血和水肿，支气管和血管管壁增厚，周围有大量炎症细胞浸润；而PDI+OVA组的肺部病理变化比OVA组显著减轻，但是单独使用PDI组与PBS组比较肺部病变程度并无差异，表明本发明制备得到的尘螨蛋白可以与OVA相互竞争而抑制OVA诱导产生的炎症反应。

2、小鼠血清sIgE，sIgG1，sIgG2a的测定

小鼠眼球取血后，室温静置2小时，3500转速离心9分钟，吸取上清-80℃储存。通过ELISA法测定血清中sIgE、sIgG1和sIgG2a抗体水平的变化，结果如图5显示，其中“*”表示OVA组与PDI+OVA组相比P<0.05，“**”表示OVA组与PDI+OVA组相比P<0.01，“***”表示OVA组与PDI+OVA组相比P<0.001，“ns”表示OVA组与PDI+OVA组相比无差异。OVA组与PBS组相比sIgE与sIgG1明显升高，有显著差异(图5中(a)、(b))，而PDI+OVA组的sIgE含量明显低于OVA组(P<0.01)(图5中(a))，而sIgG1和sIgG2a的含量并无差异(图5中(b)、(c))。PDI组的sIgE、sIgG1和sIgG2a相对PBS组无明显变化(P>0.05)(图5中(a)、(b)、(c))。这说明本发明制备得到的尘螨蛋白具有减弱OVA诱发sIgE介导的过敏反应。

3、血清中细胞因子的检测

通过ELISA试剂盒对血清中的细胞因子进行检测，结果如图6所示，其中“*”表示OVA组与PDI+OVA组相比P<0.05，“**”表示OVA组与PDI+OVA组相比P<0.01，“***”表示OVA组与PDI+OVA组相比P<0.001，“ns”表示OVA组与PDI+OVA组相比无差异。结果表明，PDI+OVA组比OVA组更能够引起IL-4、IL-5等TH2型细胞因子表达的降低(图6中(b)、(c))，而TH1型细胞因子干扰素γ(INF-γ)和免疫耐受型IL-10升高(图6中(a)、(d))。说明本发明制备得到的尘螨蛋白可能通过增强免疫耐受型IL-10的表达来减弱OVA诱发的过敏Th2反应。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 刘志刚

<120> 一种尘螨蛋白及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 509

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Val Gln Ile Lys Phe Glu Thr Leu Val Leu Ala Thr Ile Phe Leu

1 5 10 15

Ala Phe His Cys Thr Asn Ala Ser Asp Val Leu Asp Leu Thr Gln Glu

20 25 30

Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gln Gln His Asp Thr Ile Leu Val Lys Phe

35 40 45

Phe Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Arg Leu Ala Pro Glu Tyr Glu

50 55 60

Ser Ala Ala Ala Lys Leu Lys Asn Asn Asp Pro Pro Ile Pro Leu Ala

65 70 75 80

Lys Val Asp Cys Thr Thr Asp Glu Gly Lys Glu Val Cys Ser Gln Tyr

85 90 95

Gly Val Ser Gly Tyr Pro Thr Leu Lys Ile Phe Lys Asn Gly Glu Phe

100 105 110

Ser Ser Glu Tyr Asn Gly Pro Arg Gln Ala Asp Gly Ile Val Lys Tyr

115 120 125

Met Arg Ser Lys Val Gly Pro Ala Ser Arg Leu Phe Thr Asp Lys Ser

130 135 140

Ser Leu Glu Ser Val Ile Glu Lys Ala Thr Asp Val Ile Ile Leu Gly

145 150 155 160

Ile Phe Glu Lys Asp Gly Ser Ser Asp Met Gln Thr Ser Phe Met Lys

165 170 175

Ser Ala Asp Lys Leu Arg Glu Asn Val Tyr Phe Ala His Val Phe Gln

180 185 190

Asn Asp Val Glu Asp Val Tyr Lys Ile Asp Arg Leu Ala Lys Leu Asp

195 200 205

Glu Gln Ile Arg Leu Asn Ser Asn Asn Val Leu Val Ile Arg Pro Lys

210 215 220

Ile Ser Met Asn Lys Phe Glu Ser Asn Ile Val Asp Tyr Ser Gly Ser

225 230 235 240

Gly Asp Leu Thr Glu Phe Ile Arg Ser Asn Tyr His Gly Leu Val Gly

245 250 255

His Arg Thr Gln Glu Asn Met Gly Asp Phe Lys Pro Pro Met Ile Val

260 265 270

Ala Phe Tyr Asp Val Asp Tyr Val Lys Asn Pro Lys Gly Thr Asn Tyr

275 280 285

Trp Arg Asn Arg Ile Leu Lys Val Ala Gln Asn Tyr Lys Asp Ser Met

290 295 300

Ser Phe Ala Val Ser Asn Ala Gln Gln Phe Ala Gly Glu Leu Glu Glu

305 310 315 320

Phe Gly Ala Glu Pro Pro Arg Asp Arg Asp Ala Thr Pro Val Val Thr

325 330 335

Ala Arg Asn Glu Lys Gly Glu Lys Tyr Lys Met Glu Asp Lys Phe Ser

340 345 350

Val Glu Asn Leu Glu Lys Phe Val Glu Asp Phe Arg Ala Gly Lys Leu

355 360 365

Glu Pro Phe Leu Lys Ser Glu Pro Leu Pro Glu Asn Asn Asp Asn Ala

370 375 380

Asn Val Lys Thr Ala Val Ala Lys Asn Ile Gln Asp Leu Val Ile Asn

385 390 395 400

Asn Asp Lys Asp Val Leu Ile Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His

405 410 415

Cys Lys Asn Leu Ala Pro Thr Tyr Glu Asp Leu Gly Gln Ala Met Lys

420 425 430

Asp Glu Pro Asn Val Leu Val Val Lys Met Asp Ala Thr Ala Asn Asp

435 440 445

Val Pro Ser Glu Phe Thr Val His Gly Phe Pro Thr Ile Tyr Trp Tyr

450 455 460

Pro Lys Ser Lys Val Ala Gln Lys Tyr Glu Gly Gly Arg Asp Leu Gln

465 470 475 480

Asn Phe Ile Asp Tyr Ile Ala Glu His Ser Thr Glu Glu Leu Val Gly

485 490 495

Tyr Asp Arg Lys Gly Gln Lys Lys Ser Lys Glu Glu Leu

500 505

<210> 2

<211> 1527

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggtgcaga ttaagtttga aacgctggtg ctggcaacga ttttcctggc attccactgt 60

acgaacgcct ccgatgtgct ggacctgacc caggaacaat ttaacagcgc aattcagcaa 120

catgatacga tcctggtgaa atttttcgca ccgtggtgcg gccactgtaa acgtctggct 180

ccggaatatg aatctgcggc cgcaaaactg aagaacaatg atccgccgat tccgctggcg 240

aaagttgatt gcaccacgga cgaaggcaag gaagtctgta gccagtatgg cgtgtctggt 300

tacccgaccc tgaagatctt caagaacggt gaatttagca gcgaatataa tggcccgcgc 360

caagcagatg gtatcgtgaa atacatgcgt agtaaggttg gtccggcttc ccgcctgttt 420

accgataaaa gttccctgga atccgtcatt gaaaaagcca cggacgtgat tatcctgggc 480

atctttgaaa aagatggttc atcggacatg cagacgtcat tcatgaaatc ggcggataag 540

ctgcgtgaaa acgtgtactt tgcccatgtt ttccagaacg atgtggaaga cgtttacaag 600

atcgatcgtc tggcaaagct ggacgaacaa atccgcctga acagtaacaa tgttctggtc 660

attcgcccga agatctcaat gaacaagttc gaatcgaaca ttgtggatta cagcggctct 720

ggtgacctga ccgaatttat ccgtagcaac tatcatggcc tggtgggtca ccgcacgcag 780

gaaaatatgg gcgattttaa accgccgatg attgttgcgt tctatgatgt cgactacgtg 840

aaaaatccga agggtaccaa ctattggcgt aatcgcatcc tgaaagtcgc ccagaactac 900

aaggatagta tgtcctttgc tgtttctaat gcgcagcaat ttgccggcga actggaagaa 960

tttggtgcag aaccgccgcg tgatcgtgac gcaaccccgg tggttacggc tcgtaacgaa 1020

aaaggcgaaa agtacaagat ggaggataag ttctcagttg aaaatctgga aaagtttgtc 1080

gaagacttcc gcgcaggtaa actggaaccg ttcctgaagt cggaaccgct gccggaaaac 1140

aatgataacg ctaatgttaa aaccgctgtc gcgaagaaca ttcaggatct ggtgatcaac 1200

aacgataagg acgttctgat cgaattttac gccccgtggt gtggtcactg taaaaatctg 1260

gcgccgacct atgaagatct gggtcaagcc atgaaagacg aaccgaacgt gctggtcgtg 1320

aaaatggatg ccacggcaaa tgacgttccg agtgaattta ccgtccatgg cttcccgacg 1380

atctattggt acccgaaatc caaggtggcg cagaaatatg aaggcggtcg tgatctgcaa 1440

aatttcattg actacatcgc cgaacacagc accgaagaac tggttggcta tgatcgcaag 1500

ggtcagaaaa agtctaagga agaactg 1527

Claims (10)

1.一种尘螨蛋白，其特征在于，所述尘螨蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的尘螨蛋白，其特征在于，所述尘螨蛋白的编码基因为编码如SEQID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的尘螨蛋白，其特征在于，所述尘螨蛋白的编码基因为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

4.如权利要求1所述的尘螨蛋白，其特征在于，所述尘螨蛋白为非过敏原蛋白。

5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含编码如权利要求1-4任一项所述的尘螨蛋白的核苷酸序列。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求5所述的重组载体。

7.一种尘螨蛋白的制备方法，其特征在于，包括：

（1）提取尘螨总蛋白，分离并鉴定得到尘螨蛋白，通过PCR获得所述尘螨蛋白的编码基因，所述尘螨蛋白的编码基因为编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

（2）将所述尘螨蛋白的编码基因插入到表达载体中，得到重组质粒；

（3）将所述重组质粒转至表达宿主细胞中，进行蛋白质表达和纯化，获得尘螨蛋白。

8.一种组合物，其特征在于，包括如权利要求1-4任一项所述的尘螨蛋白或如权利要求7所述的制备方法制得的尘螨蛋白。

9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括药学上可接受的载体。

10.如权利要求1-4任一项所述的尘螨蛋白、如权利要求5所述的重组载体、如权利要求6所述的宿主细胞、如权利要求7所述的制备方法制得的尘螨蛋白、或如权利要求8-9任一项所述的组合物在制备预防、缓解和治疗过敏性疾病的药物中的应用。

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