CN108823128A - 一种硫氧化菌培养和活性强化方法及应用 - Google Patents

一种硫氧化菌培养和活性强化方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种硫氧化菌培养和活性强化方法及应用,所述硫氧化菌的培养方法包括将硫氧化菌接种于液体培养基中进行培养;其中,所述液体培养基中Na+的浓度为1.0M‑2.5M,SO4 2‑的浓度为10g/L‑100g/L。本发明在硫氧化菌培养基中添加适量的SO4 2‑,对硫氧化菌的生长和硫氧化菌的硫转化能力具有促进作用,随着SO4 2‑浓度的升高,硫氧化菌的生长速率加快,脱硫效率提高;添加的SO4 2‑引发了硫氧化菌在基因转录水平和蛋白翻译水平上的调整,更加有利于硫氧化菌在高盐环境下生长和进行硫物质的转化。

Description

一种硫氧化菌培养和活性强化方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种硫氧化菌培养和活性强化方法及应用,尤其涉及一种嗜盐嗜碱硫碱弧菌培养和活性强化方法及应用。
背景技术
硫化氢是一种剧毒、强腐蚀性气体,具有恶臭气味,广泛存在于天然气、沼气以及炼化厂的废气和废水中。硫化氢对钻井设备和运送管道有严重腐蚀作用,在极低浓度泄露的情况下对人体有致死作用,其氧化产物二氧化硫对大气有污染作用。近年来,随着我国冬季采暖煤改气、煤改电政策的实施,天然气成为越来越重要的清洁能源;此外,天然硫磺的存储量有限,主要通过氧化硫化氢制备得到,硫化氢是生产硫磺的重要原料。因此,以硫化氢为原料制备单质硫,不仅解决了污染问题,而且节约了能源。
目前,硫化氢的去除方法主要包括物理法、化学法和生物法,其中,应用较为广泛的为物理法和化学法,包括有机溶剂吸收法,多孔材料吸附法,碱性溶液或固体吸收法,以及氧化剂氧化法等。生物脱硫是指在常温常压下,采用微生物将S2-转化为单质硫,或进一步氧化为硫酸盐的方法。与物理法和化学法相比,生物脱硫方法具有设备简单、反应温和、操作简捷、脱除效率高和无二次污染等优点。然而目前工业中采用的嗜中性pH、低盐度耐受的脱硫微生物存在硫化氢吸收量少和高盐离子不耐受等缺点。
嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌属于光合硫细菌中紫色硫细菌一类,是一种革兰氏阴性菌,从盐碱土壤中分离得到,可以在pH为7-11、钠离子为0.3-4M的环境中生长,但是随着盐浓度和pH值的升高,硫碱弧菌的生长速率同样会受到抑制。嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌是一种化能自养型微生物,以二氧化碳为碳源,硫化钠或硫代硫酸钠等硫物质为电子供体,在氧化硫物质的过程中产生单质硫或硫酸盐。相比于其他生物脱硫微生物,嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌对高盐高碱环境具有耐受性,克服了传统脱硫微生物脱硫率低的缺陷,但是存在生长速度慢的缺点,增加氧气量可以加快嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌的生长速率,但会降低单质硫的回收率,造成硫酸盐大量积累,形成二次污染。
CN 104857842 A公开了一株嗜盐嗜碱性硫氧化菌及其在气体生物脱硫-硫回收中的应用,所述嗜盐嗜碱性硫氧化菌具有在高盐高碱条件下(pH11.0,4.0M Na+)氧化硫化物产单质硫的能力,单质硫产率>90%,硫磺纯度>99%。在较宽pH和盐度范围内(pH9.0~12.0,0.5~4.0M Na+)保持稳定的该能力,可处理<3,000mg/L的硫化物,该菌株在气体生物脱硫-硫回收中具有很好的应用。然而,如何提高嗜盐嗜碱性硫氧化菌的生长速度和脱硫速率,该专利并未公开。
因此,如何在高浓度、高pH的条件下提高硫碱弧菌的硫转化效率,是生物脱硫技术领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供了一种硫氧化菌培养和活性强化方法及应用,所述硫氧化菌培养于添加有硫酸根离子的培养基中,生长速率和脱硫效率均得到提高和增强。
为达此目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种硫氧化菌的培养方法,所述方法包括将硫氧化菌接种于液体培养基中进行培养;
其中,所述液体培养基中Na+的浓度为1.0M-2.5M,SO4 2-的浓度为10g/L-100g/L。
本发明中,高浓度Na+对硫氧化菌的生长和脱硫能力具有抑制作用,当在矿物质培养基中添加适量的SO4 2-,则会促进硫氧化菌的生长和增强硫氧化菌的硫转化能力,随着SO4 2-浓度的升高,硫氧化菌的生长速率加快,脱硫效率提高,在硫氧化菌培养基中添加适量的SO4 2-,有效地提高了硫氧化菌在高盐环境中的生长速率和脱硫速率,为生物脱硫提供了新思路。
优选地,所述液体培养基中Na+的浓度为1.0M-2.5M,例如可以是1.0M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M、2.0M、2.1M、2.2M、2.3M、2.4M或2.5M,优选为1.6M-2.2M,进一步优选为1.6M-1.8M。
优选地,所述液体培养基中SO4 2-的浓度为10g/L-100g/L,例如可以是10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L或100g/L,优选为50g/L-90g/L,进一步优选为70g/L-90g/L。
优选地,所述培养的温度为30-35℃,例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃。
优选地,所述培养的时间为18-24h,例如可以是18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h。
第二方面,本发明提供了一种如第一方面所述的方法培养得到的硫氧化菌。
优选地,所述硫氧化菌包括嗜盐嗜碱硫碱弧菌。
第三方面,本发明提供了一种如第二方面所述的硫氧化菌在生物脱硫中的应用。
第四方面,本发明提供了一种生物脱硫方法,所述方法包括以下步骤:
将如第二方面所述的硫氧化菌与待脱硫的含硫样品充分接触,进行生物脱硫反应。
优选地,所述含硫样品包括硫代硫酸钠和/或硫化钠。
第五方面,本发明提供了一种硫氧化菌的活性强化方法。
第六方面,本发明提供了一种促进硫氧化菌生长和硫转化能力的方法。
第七方面,本发明提供了一种调整硫氧化菌基因转录和蛋白翻译的方法。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明在硫氧化菌培养基中添加适量的SO4 2-,对硫氧化菌的生长和硫氧化菌的硫转化能力具有促进作用,随着SO4 2-浓度的升高,硫氧化菌的生长速率加快,脱硫效率提高;
(2)添加的SO4 2-引发了硫氧化菌在基因转录水平和蛋白翻译水平上的调整,更加有利于在高盐环境下生长和进行硫物质的转化;
(3)利用本发明的硫氧化菌进行脱硫反应,得到的单质硫纯度高达98%。
附图说明
图1(A)为Na+浓度对硫氧化菌生长速度的影响,图1(B)为Na+浓度对硫氧化菌脱硫速率的影响;
图2(A)为Na+浓度为1.3M时,0g/L或30g/L SO4 2-对硫氧化菌生长速度的影响(S2O3 2-为硫源),图2(B)为Na+浓度为1.6M时,0g/L、30g/L或50g/L SO4 2-对硫氧化菌生长速度的影响(S2O3 2-为硫源),图2(C)为Na+浓度为1.8M时,0g/L、30g/L、50g/L或70g/L SO4 2-对硫氧化菌生长速度的影响(S2O3 2-为硫源),图2(D)为Na+浓度为2.2M时,0g/L、30g/L、50g/L、70g/L或90g/L SO4 2-对硫氧化菌生长速度的影响(S2O3 2-为硫源);
图3(A)为Na+浓度为1.3M时,0g/L或30g/L SO4 2-对硫氧化菌脱硫速率的影响(S2O3 2-为硫源),图3(B)为Na+浓度为1.6M时,0g/L、30g/L或50g/L SO4 2-对硫氧化菌脱硫速率的影响(S2O3 2-为硫源),图3(C)为Na+浓度为1.8M时,0g/L、30g/L、50g/L或70g/L SO4 2-对硫氧化菌脱硫速率的影响(S2O3 2-为硫源),图3(D)为Na+浓度为2.2M时,0g/L、30g/L、50g/L、70g/L或90g/L SO4 2-对硫氧化菌脱硫速率的影响(S2O3 2-为硫源);
图4(A)为Na+浓度为1.8M时,0g/L、30g/L、50g/L或70g/L SO4 2-对硫氧化菌生长速度的影响(S2-为硫源),图4(B)为Na+浓度为1.8M时,0g/L、30g/L、50g/L或70g/L SO4 2-对硫氧化菌脱硫速率的影响(S2-为硫源);
图5(A)为单质硫分离单峰图,图5(B)为根据标准品测定得到的标准曲线;
图6为硫氧化菌蛋白的SDS-PAGE电泳图,其中,0-对比例4的蛋白量,70-实施例6的蛋白量。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是,此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明,而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1菌体培养
Thioalkalivibrio versutus D301是分离自中国内蒙古盐碱湖的嗜盐嗜碱硫氧化菌。
将-80℃保存的1mL菌株添加到100mL矿物质液体培养基中,30℃、180rpm下培养24h,硫源为硫代硫酸钠,得到种子;
取5mL培养好的种子菌液,8000rpm离心10min,接种于液体培养基中,30℃、180rpm下培养24h,其中,液体培养基中Na+的浓度为1.3M,SO4 2-的浓度为30g/L。
实施例2菌体培养
将-80℃保存的1mL菌株添加到100mL矿物质液体培养基中,30℃、180rpm下培养24h,硫源为硫代硫酸钠,得到种子;
取5mL培养好的种子菌液,8000rpm离心10min,接种于液体培养基中,30℃、180rpm下培养24h,其中,液体培养基中Na+的浓度为1.6M,SO4 2-的浓度为30g/L。
实施例3菌体培养
将-80℃保存的1mL菌株添加到100mL矿物质液体培养基中,30℃、180rpm下培养24h,硫源为硫代硫酸钠,得到种子;
取5mL培养好的种子菌液,8000rpm离心10min,接种于液体培养基中,30℃、180rpm下培养24h,其中,液体培养基中Na+的浓度为1.6M,SO4 2-的浓度为50g/L。
实施例4菌体培养
将-80℃保存的1mL菌株添加到100mL矿物质液体培养基中,30℃、180rpm下培养24h,硫源为硫代硫酸钠,得到种子;
取5mL培养好的种子菌液,8000rpm离心10min,接种于液体培养基中,30℃、180rpm下培养24h,其中,液体培养基中Na+的浓度为1.8M,SO4 2-的浓度为30g/L。
实施例5菌体培养
将-80℃保存的1mL菌株添加到100mL矿物质液体培养基中,30℃、180rpm下培养24h,硫源为硫代硫酸钠,得到种子;
取5mL培养好的种子菌液,8000rpm离心10min,接种于液体培养基中,33℃、180rpm下培养20h,其中,液体培养基中Na+的浓度为1.8M,SO4 2-的浓度为50g/L。
实施例6菌体培养
将-80℃保存的1mL菌株添加到100mL矿物质液体培养基中,30℃、180rpm下培养24h,硫源为硫代硫酸钠,得到种子;
取5mL培养好的种子菌液,8000rpm离心10min,接种于液体培养基中,33℃、180rpm下培养20h,其中,液体培养基中Na+的浓度为1.8M,SO4 2-的浓度为70g/L。
实施例7菌体培养
将-80℃保存的1mL菌株添加到100mL矿物质液体培养基中,30℃、180rpm下培养24h,硫源为硫代硫酸钠,得到种子;
取5mL培养好的种子菌液,8000rpm离心10min,接种于液体培养基中,33℃、180rpm下培养20h,其中,液体培养基中Na+的浓度为2.2M,SO4 2-的浓度为30g/L。
实施例8菌体培养
将-80℃保存的1mL菌株添加到100mL矿物质液体培养基中,30℃、180rpm下培养24h,硫源为硫代硫酸钠,得到种子;
取5mL培养好的种子菌液,8000rpm离心10min,接种于液体培养基中,33℃、180rpm下培养20h,其中,液体培养基中Na+的浓度为2.2M,SO4 2-的浓度为50g/L。
实施例9菌体培养
将-80℃保存的1mL菌株添加到100mL矿物质液体培养基中,30℃、180rpm下培养24h,硫源为硫代硫酸钠,得到种子;
取5mL培养好的种子菌液,8000rpm离心10min,接种于液体培养基中,35℃、180rpm下培养18h,其中,液体培养基中Na+的浓度为2.2M,SO4 2-的浓度为70g/L。
实施例10菌体培养
将-80℃保存的1mL菌株添加到100mL矿物质液体培养基中,30℃、180rpm下培养24h,硫源为硫代硫酸钠,得到种子;
取5mL培养好的种子菌液,8000rpm离心10min,接种于液体培养基中,35℃、180rpm下培养18h,其中,液体培养基中Na+的浓度为2.2M,SO4 2-的浓度为90g/L。
实施例11菌体培养
将-80℃保存的1mL菌株添加到100mL矿物质液体培养基中,30℃、180rpm下培养24h,硫源为硫代硫酸钠,得到种子;
取5mL培养好的种子菌液,8000rpm离心10min,接种于液体培养基中,35℃、180rpm下培养18h,其中,液体培养基中Na+的浓度为1.0M,SO4 2-的浓度为10g/L。
实施例12菌体培养
将-80℃保存的1mL菌株添加到100mL矿物质液体培养基中,30℃、180rpm下培养24h,硫源为硫代硫酸钠,得到种子;
取5mL培养好的种子菌液,8000rpm离心10min,接种于液体培养基中,35℃、180rpm下培养18h,其中,液体培养基中Na+的浓度为2.5M,SO4 2-的浓度为100g/L。
实施例13
与实施例4相比,硫氧化菌的硫源为硫化钠,其他条件与实施例4相同。
实施例14
与实施例5相比,硫氧化菌的硫源为硫化钠,其他条件与实施例5相同。
实施例15
与实施例6相比,硫氧化菌的硫源为硫化钠,其他条件与实施例6相同。
对比例1
与实施例1相比,液体培养基中不添加SO4 2-,Na+的浓度为1.0M,其他条件与实施例1相同。
对比例2
与实施例1相比,液体培养基中不添加SO4 2-,Na+的浓度为1.3M,其他条件与实施例1相同。
对比例3
与实施例1相比,液体培养基中不添加SO4 2-,Na+的浓度为1.6M,其他条件与实施例1相同。
对比例4
与实施例1相比,液体培养基中不添加SO4 2-,Na+的浓度为1.8M,其他条件与实施例1相同。
对比例5
与实施例1相比,液体培养基中不添加SO4 2-,Na+的浓度为2.2M,其他条件与实施例1相同。
对比例6
与实施例1相比,硫氧化菌采用S2-作为硫源,液体培养基中不添加SO4 2-,Na+的浓度为1.0M,其他条件与实施例1相同。
对比例7
与实施例1相比,硫氧化菌采用S2-作为硫源,液体培养基中不添加SO4 2-,Na+的浓度为1.8M,其他条件与实施例1相同。
嗜盐嗜碱硫氧化菌的生长速率
将实施例1-12和对比例1-5的菌液每隔5h取样一次,测定菌液的OD600和S2O3 2-浓度;将实施例13-15和对比例6-7的菌液每隔8h取样一次,测定菌液的OD600和S2-的浓度。
OD600采用分光光度计检测;S2O3 2-浓度采用DIONEX色谱法测定,离子柱为DionexIonPacTMAS14A分析柱(4×250mm),流动相为Na2CO3/NaHCO3缓冲液(8mM Na2CO3和1mMNaHCO3),流速为1.0mL/min;S2-的测定按照国家标准《水质硫化物-亚甲基蓝分光光度法(GB/T16489-1996)》测定。
如图1(A)和图1(B)所示,随着Na+浓度的增加,OD600减小,S2O3 2-浓度增加,说明硫氧化菌的生长速度减慢,脱硫速率下降,高Na+环境不利于硫氧化菌的生长和硫物质转化,当Na+浓度为2.2M时,硫氧化菌的生长速度和脱硫速率达到最小值。
如图2(A)、图2(B)、图2(C)和图2(D)所示,随着SO4 2-浓度的增加,OD600提高,说明硫氧化菌的生长速度加快;如图3(A)、图3(B)、图3(C)和图3(D)所示,随着SO4 2-浓度的增加,S2O3 2-浓度降低,说明硫氧化菌的脱硫速率增强。
将硫氧化菌的硫源更换为S2-,硫氧化菌表现出类似的生长趋势和脱硫能力,如图4(A)所示,随着SO4 2-浓度的增加,OD600提高,说明硫氧化菌的生长速度加快;如图4(B)所示,随着SO4 2-浓度的增加,S2-浓度降低,说明硫氧化菌的脱硫速率增强。
单质硫的测定
将硫碱弧菌产生的单质硫在8000rpm下离心15min进行回收,平铺于培养皿中,自然风干;
称取相同质量的硫磺干粉分别溶解于10mL丙酮中,溶解完全后取1mL丙酮液体过0.22μm有机膜过滤,采用高效液相色谱进行单质硫的定性定量检测;
高效液相色谱条件为:
流动相甲醇:水=85:15,UV吸收波长为263nm,色谱柱为Agilent,SB-C18(4.6mm×250mm),进样量为10μL,柱温为40℃。
图5(A)为单质硫分离单峰图,图5(B)为根据标准品测定得到的标准曲线,单质硫纯度计算公式为:单质硫纯度=高效液相色谱测定值/实际称量值×100%。
结果发现,得到的单质硫的纯度为98%,标准曲线为y=-12.83+13722.42x(R2=0.998)。
SO4 2-影响蛋白量的表达
选取实施例6和对比例4的硫氧化菌进行培养,离心收集OD600为0.5的硫氧化菌,此时的硫氧化菌处于对数生长期,粘连的硫颗粒较少;将收集的硫氧化菌采用纯水清洗2次,初步破碎细胞,再用超声波破碎,震荡1s,停歇2s,持续10min,待细胞破碎完成后,取上清;样品进行SDS-PAGE检测。
结果如图6所示,实施例6的硫氧化菌的蛋白量明显多于对比例4的硫氧化菌的蛋白量,说明SO4 2-引发了硫氧化菌在基因转录水平和蛋白翻译水平上的调整,更加有利于在高盐环境下生长和进行硫物质的转化。
综上所述,本发明在硫氧化菌培养基中添加适量的SO4 2-,对硫氧化菌的生长和硫氧化菌的硫转化能力具有促进作用,随着SO4 2-浓度的升高,硫氧化菌的生长速率加快,脱硫效率提高;添加的SO4 2-引发了硫氧化菌在基因转录水平和蛋白翻译水平上的调整,更加有利于在高盐环境下生长和进行硫物质的转化;利用本发明的硫氧化菌进行脱硫反应,得到的单质硫纯度高达98%。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种硫氧化菌的培养方法,其特征在于,所述方法包括将硫氧化菌接种于液体培养基中进行培养;
其中,所述液体培养基中Na+的浓度为1.0M-2.5M,SO4 2-的浓度为10g/L-100g/L。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述液体培养基中Na+的浓度为1.6M-2.2M,优选为1.6M-1.8M。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述液体培养基中SO4 2-的浓度为50g/L-90g/L,优选为70g/L-90g/L。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法,其特征在于,所述培养的温度为30-35℃。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于,所述培养的时间为18-24h。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的方法培养得到的硫氧化菌。
7.根据权利要求6所述的硫氧化菌,其特征在于,所述硫氧化菌包括嗜盐嗜碱硫碱弧菌。
8.一种如权利要求6或7所述的硫氧化菌在生物脱硫中的应用。
9.一种生物脱硫方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
将如权利要求6或7所述的硫氧化菌与待脱硫的含硫样品充分接触,进行生物脱硫反应。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述含硫样品包括硫代硫酸钠和/或硫化钠。
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