CN108823083A - 一种细菌生化鉴定系统及其制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细菌生化鉴定系统及其制作方法。本发明提供了一种细菌生化鉴定测试片以及和细菌生化鉴定测试片配套使用的压板。细菌生化鉴定测试片包括覆膜、底板，位于两者之间的离型纸，生化鉴定试纸和指示贴；压板包括压板平面和弹性压框。本发明的细菌生化鉴定测试片能使生化鉴定试纸处于一个密闭环境中，有效减少水分散失，同时可形成厌氧环境，克服了常规和市场上同类产品在氨基酸脱羧酶、氰化钾等检测项目中滴加液体石蜡油以形成厌氧环境的缺点；本发明的细菌生化鉴定测试片培养结束后可直接观察细菌分解糖类产气情况，制作工艺简单，准确性高。

Description

一种细菌生化鉴定系统及其制作方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体属于微生物快速生化鉴定领域，尤其涉及一种用于细菌生化鉴定的系统及其制作方法。
背景技术
目前，我国细菌生化鉴定主要采用国标法，沿用传统的鉴定技术，这些常规鉴定方法需要检测者做大量的准备工作，包括准备材料，配制试剂，有些还需要分装、灭菌、处置废弃物等，增加了检测人员的劳动量，还对操作者的技能、经验有较高要求。由于检测步骤多，检测结果判断经验性强，结果的准确性不易控制。
测试片以其制作工艺简单，操作简便，结果准确，检测时间短等优点赢得了广大检测人员的青睐。测试片不需要做实验前的准备工作，节省了劳动力。直接吸取样液滴加于测试片上培养检测，对操作者技能要求低，结果重复性好。
目前市场上涉及细菌生化鉴定的产品主要有2种，一种是安瓿瓶装的液体生化鉴定试剂，使用者打开安瓿瓶直接接种待检菌于安瓿瓶中，培养后观察，有些培养后还需要再添加指示剂。此产品因是液体试剂，保质期短。因安瓿瓶是玻璃材质，打开时存在安全隐患。培养时只能敞开口，无法做到严格的无菌培养，且培养过程中试剂中的致病菌易逃逸到环境中，污染环境。因敞口培养水分散失严重，影响结果的准确性；另一种是干制的生化鉴定板，板上有0.2mL-0.5mL的微孔，生化试剂加到微孔中再烘干，板上设有盖子，此产品保质期长，使用者将待检液菌直接加入相应的微孔，盖上盖子培养，加菌液后需小心移动，否则易漏出，污染环境。上述2种产品做厌氧生化鉴定时需额外滴加液体石蜡油；因是敞口培养无法观察细菌分解糖类产气情况。本人于2017年四月申请过生化鉴定测试片，此次申请的细菌生化鉴定系统在此基础上有所改进：吸附材料由滤纸改为无纺布，吸液量大，吸收速度快；上层采用覆膜覆盖，底板直接为胶带，不使用凝胶，工艺简化；加样后通过压板压合使覆膜和底板粘合，生化鉴定试纸处于一个密闭环境中，有效减少水分散失；可形成厌氧环境，克服了常规和市场上同类产品在氨基酸脱羧酶、氰化钾等检测项目中滴加液体石蜡油以形成厌氧环境的缺点，能使阴性或阳性结果保持48h以上；因测试片中的生化鉴定试纸密闭培养，可截留细菌分解糖类产生的气体，培养结束后可直接观察产气情况；密闭培养也可防止致病菌逃逸到环境中，对环境和操作者安全性较高。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种细菌生化鉴定测试片。
本发明提供的细菌生化鉴定测试片，该细菌生化鉴定测试片包括覆膜、底板，位于两者之间的离型纸，生化鉴定试纸和指示贴；
上述细菌生化鉴定测试片中，所述底板为胶带；
和/或，所述胶带具体为PET聚丙烯酸压敏胶胶带；
所述PET聚丙烯酸压敏胶胶带厚度为0.10mm-0.30mm；
所述底板大小及长短比例与所要粘贴的生化鉴定试纸大小及数量相适应。
上述细菌生化鉴定测试片中，所述离型纸上设有1个或数个方孔；
所述离型纸上的方孔边长为1.1cm-2.2cm，方孔数量根据细菌生化鉴定数目而定；
所述有孔的离型纸有离型膜一面于一边对齐粘贴于底板胶带的胶面，离型纸宽度同底板，长度短于底板，使底板一侧边有裸露的胶面。
上述细菌生化鉴定测试片中，所述生化鉴定试纸由生化鉴定试剂和吸附片材组成；
和/或，所述吸附片材具体为无纺布；
生化鉴定试纸按照包括如下步骤的方法制备：将无纺布浸泡于生化鉴定试剂中，达到饱和后取出，烘干，裁切成大小与离型纸上方孔相适应的正方形，形成生化鉴定试纸；
所述生化鉴定试纸边长短于离型纸上方孔边长1mm-2mm；
所述生化鉴定试纸通过离型纸上的方孔粘贴于底板胶面上；同一细菌不同生化鉴定试纸可粘贴于同一底板上，制成该细菌的生化鉴定测试片。
上述生化鉴定测试片中，所述生化鉴定试剂为1×-3×常规生化鉴定试剂，具体为缓冲蛋白胨水（MR、VP试验）、色氨酸肉汤（吲哚试验）、枸橼酸盐培养基（枸橼酸盐利用试验）、1%盐酸四甲基对苯二胺试剂（氧化酶试验）、乙酰胺肉汤（乙酰胺试验）、七叶苷培养基（七叶苷水解试验）、酚红葡萄糖肉汤（葡萄糖利用试验）、硝酸盐肉汤（硝酸盐还原试验）、克氏双糖铁培养基（硫化氢试验）、氨基酸脱羧酶培养基（氨基酸脱羧酶试验）、Rustigian氏尿素酶培养基（尿素酶试验）、苯丙氨酸培养基（苯丙氨酸脱氨酶试验），淀粉培养基（淀粉水解试验）、甘油复红肉汤（甘油复红试验），丙二酸盐培养基（丙二酸盐利用试验）或醋酸盐试验培养基（醋酸盐试验）。
在本发明的实施例中，采用的生化鉴定试剂为1×大肠埃希氏菌生化鉴定试剂,具体为：缓冲蛋白胨水（MR、VP试验）、色氨酸肉汤（吲哚试验）、枸橼酸盐培养基（枸橼酸盐利用试验）。
上述细菌生化鉴定测试片中，所述覆膜一侧边与所述底板有裸露胶面的一侧边粘合，粘合宽度为裸露胶面宽度的一半，使底板仍有一部分胶面裸露于空气中；
所述覆膜宽度、长度与所述底板相同。
和/或，所述覆膜具体为PVC薄膜；
所述PVC薄膜厚度为0.05mm-0.10mm。
上述细菌生化鉴定测试片中，所述指示贴粘于底板有裸露胶面的一侧边，并与之对齐，所述指示贴宽度与底板覆盖离型纸后裸露的胶面宽度相同，使指示贴一半宽度粘贴在底板上，一半粘贴在覆膜上；
和/或，所述指示贴具体为彩色胶带。
上述的生化鉴定测试片在细菌生化鉴定中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的第二个目的是提供一种细菌生化鉴定系统，它包括上述的细菌生化鉴定测试片和与所述细菌生化鉴定测试片配套使用的压板；
所述压板由压板平面和弹性压框组成，所述弹性压框是由四条同等长度的弹性板条组成的中间镂空的正方形，所述弹性压框一个平面与压板平面于一面粘合连接，可通过万能胶粘合。
上述系统中，所述压板平面为透明硬质塑料片材；
和/或，所述透明硬质塑料片材具体为聚丙烯片材；
和/或，所述弹性板条具体为热塑性聚氨酯弹性体板条。
上述系统中，所述压板平面形状可根据需要设计，面积大于弹性压框面积，厚度为1mm-5mm；所述弹性板条横切面高1.5mm-3.0mm，宽3.0mm-5.0mm；板条组成的正方形内框边长长于生化鉴定试纸2.0mm-5.0mm。
上述透明硬质塑料片材由深圳市康美达塑胶材料有限公司加工定做，为3cm×5cm长方形透明聚丙烯片材，厚度为3mm；上述弹性板条为热塑性聚氨酯弹性体板条，由东莞市建国环保塑胶薄膜有限公司提供，横切面高2mm，宽4mm。
本发明还提供制备所述细菌生化鉴定系统的方法，包括如下步骤：制备所述细菌生化鉴定测试片和所述压板；
所述制备细菌生化鉴定测试片的步骤包括：
1）制备生化鉴定试纸
将无纺布浸泡于生化鉴定试剂中，达到饱和后取出，烘干；
2）裁切
将底板裁切成大小与生化鉴定试纸大小及数量相适应的长方形或者正方形，长度长于所粘贴试纸边缘1.0cm-2.0cm；宽度长于所粘贴试纸边缘1.0cm-2.0cm；
将离型纸裁切成宽度与底板相同，长度短于底板1cm的长方形或者正方形，离型纸上镂空剪切出边长为1.1cm-2.2cm的方孔，方孔数量根据细菌生化鉴定数目而定；。
将生化鉴定试纸裁切成1.0cm-2.0cm正方形；
将覆膜裁切成长度和宽度与底板相同的长方形或者正方形；
将指示贴裁切成宽1.0cm，长度与要粘贴的底板一边的长度相同的长方形；
3）组装
所述离型纸有离型膜一面于一边对齐粘贴于底板胶带的胶面，使底板仍有1cm宽胶面裸露于空气中；
所述生化鉴定试纸通过离型纸上的方孔粘贴于底板胶面上；同一细菌不同生化鉴定试纸可粘贴于同一底板上，制成该细菌的生化鉴定测试片。
所述覆膜一侧边与所述底板有裸露胶面的一侧边粘合，粘合宽度为0.5cm，使底板仍有0.5cm宽胶面裸露于空气中。
所述指示贴粘于底板有裸露胶面的一侧边，并与之对齐，使指示贴有0.5cm宽度粘贴在底板上，0.5cm宽度粘贴在覆膜上。
所述制备压板的步骤包括：
4）将弹性板条剪切成长度合适的四条，首尾相连，组成正方形的弹性压框，通过透明万能胶粘附于压板平面上。
上述的细菌生化鉴定系统中的压板也是本发明保护的范围。
上述的细菌生化鉴定测试片或上述的细菌生化鉴定系统或上述的压板在细菌生化鉴定中的应用也是本发明保护的范围。
上述细菌为卫生指标菌或致病菌，所述卫生指标菌为乳酸菌、双歧杆菌中至少一种；所述致病菌为大肠埃希氏菌、大肠埃希氏菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌中至少一种。
本发明的第三个目的是提供一种细菌生化鉴定的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1）揭起上述的细菌生化鉴定测试片的覆膜，将离型纸剥离底板再将待检细菌菌液滴加在所述测试片的生化鉴定试纸上，滴加量与该试纸吸附的试剂量相同，盖上所述覆膜；
2）将压板有弹性压框的一面，对准生化鉴定试纸，使生化鉴定试纸位于弹性压框内，用力压下，使覆膜与底板裸露的胶面粘合，得到待检测测试片；
3）按各生化鉴定项目要求或直接观察，或培养后观察，或培养后揭起覆膜，在生化鉴定试纸上滴加相应试剂后进行观察，判断结果。
本发明的实验证明，本发明的细菌生化鉴定测试片将生化鉴定试剂吸附于无纺布上，制成干式试纸，保质期长；将同一细菌的不同生化鉴定试纸粘贴于同一生化鉴定测试片上，一次可进行多项生化指标检测，便于操作，便于观察；本发明的细菌生化鉴定测试片，上层采用覆膜覆盖，底板直接采用胶带，加样后通过压板压合使覆膜和底板粘合，生化鉴定试纸处于一个密闭环境中，有效减少水分散失；同时可形成厌氧环境，克服了常规和市场上同类产品在氨基酸脱羧酶、氰化钾等检测项目中滴加液体石蜡油以形成厌氧环境的缺点；本发明的细菌生化鉴定测试片培养结束后可直接观察细菌分解糖类产气情况，制作工艺简单，准确性高。
附图说明
图1为细菌生化鉴定测试片的产品图。
图2为压板的产品图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、细菌生化鉴定系统
用于细菌生化鉴定的系统包括细菌生化鉴定测试片和与其配套使用的压板；
一、细菌生化鉴定测试片
本发明的细菌生化鉴定测试片的结构示意图如图1所示。
图1所示的细菌生化鉴定测试片，包括覆膜1，底板2，位于覆膜和底板之间的离型纸3，生化鉴定试纸4和指示贴5。
生化鉴定试纸为将无纺布浸泡于生化鉴定试剂中，达到饱和后取出，烘干，裁切成大小合适的正方形，形成生化鉴定试纸。离型纸上有1个或数个方孔，且有离型膜一面于一边对齐粘贴于底板胶带的胶面。生化鉴定试纸通过离型纸上的方孔粘贴于底板胶面上。覆膜一侧边与底板有裸露胶面的一侧边粘合，粘合宽度为裸露胶面宽度的一半，使底板仍有一部分胶面裸露于空气中。指示贴粘于底板有裸露胶面的一侧边，并与之对齐，指示贴宽度与底板覆盖离型纸后裸露的胶面宽度相同，使指示贴一半宽度粘贴在底板上，一半粘贴在覆膜上。
二、压板
1、结构
本发明的与细菌生化鉴定测试片配套使用的压板的结构示意图如图2所示。
图2所示的压板，由压板平面1和弹性压框2组成。弹性压框是由四条同等长度的弹性板条组成的中间镂空的正方形，弹性压框一个平面与压板平面于一面粘合连接。压板平面材质具体为聚丙烯片材，弹性板条具体为热塑性聚氨酯弹性体板条。
上述压板平面由深圳市康美达塑胶材料有限公司加工定做，材料为透明聚丙烯片材，为3cm×5cm长方形，厚度为3mm；热塑性聚氨酯弹性体板条由东莞市建国环保塑胶薄膜有限公司提供，横切面高2mm，宽4mm。
2、制备
剪切：将热塑性聚氨酯弹性体板条剪切成4条长度为2.1cm长条，首尾依次连接拼接成正方形，宽度为4mm的板条面在正方形平面上，板条组成的正方形内框边长为1.7cm。将拼接好的弹性压框一面均匀涂抹透明万能胶，粘贴在压板平面的一个平面上，制作成如图2所示的压板。
上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、设置位置及其连接方式等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。
实施例2、大肠埃希氏菌生化鉴定测试片制备及应用
一、大肠埃希氏菌生化鉴定测试片的制备
1、大肠埃希氏菌生化鉴定试纸的制备
将无纺布（佛山市顺德区龙江镇德涛海家具材料商行，100g/m2）分别浸泡于缓冲蛋白胨水（MR、VP试验）、色氨酸肉汤（吲哚试验）、枸橼酸盐培养基（枸橼酸盐利用试验）中，0.05mL/cm2，取出50℃烘干，得到大肠埃希氏菌生化鉴定试纸。
2、裁切
将底板裁切成长7.2cm，宽6.2cm的长方形；
将离型纸裁切成边长6.2cm的正方形，离型纸上裁切出4个边长1.6cm的正方形，正方形之间，以及正方形和任一离型纸边缘的距离均为1.0cm；
将生化鉴定试纸裁切成边长1.4cm的正方形；
将覆膜裁切成长7.2cm，宽6.2cm的长方形；
将指示贴裁切成宽1.0cm，长6.2cm的长方形。
3、大肠埃希氏菌生化鉴定测试片的组装
将离型纸有离型膜一面于一侧边与底板一边对齐粘贴；
分别将缓冲蛋白胨水试纸、色氨酸肉汤试纸、枸橼酸盐培养基试纸通过离型纸上的方孔粘贴在底板上，其中缓冲蛋白胨水试纸粘贴2片；
将覆膜一侧边与所述底板有裸露胶面的一侧边粘合，粘合宽度为0.5cm，使底板仍有0.5cm宽度胶面裸露于空气中；
将指示贴粘贴于底板有裸露胶面的一侧边，并与之对齐，使指示贴有0.5cm宽度粘贴在底板上，0.5cm宽度粘贴在覆膜上。
4、灭菌
铝箔袋包装后，环氧乙烷灭菌备用，得到大肠埃希氏菌生化鉴定测试片。
二、大肠埃希氏菌生化鉴定测试片的应用
1、接种
从营养琼脂平板上挑取可疑菌落于2mL无菌生理盐水中，吹吸均匀，制成待检菌液。将大肠埃希氏菌生化鉴定测试片置于水平平台，揭开上层覆膜，将离型纸剥离底板，再将待检细菌菌液滴加在生化鉴定试纸上，每种试纸滴加0.1mL，盖上覆膜。将压板有弹性压框的一面，对准生化鉴定试纸，使生化鉴定试纸位于弹性压框内，用力压下，使覆膜与底板裸露的胶面粘合，得到待检测测试片。同时以北京陆桥大肠埃希氏菌生化鉴定试剂盒（DBI-01）作为对照，按产品说明书进行操作，分别对10个可疑菌落进行鉴定。
2、培养
36℃±1℃培养24h±2h。
3、结果判断
培养结束后取出大肠埃希氏菌生化鉴定测试片，枸橼酸盐试纸直接观察颜色变化，绿色为枸橼酸盐试验阴性，蓝色为枸橼酸盐试验阳性；揭开上层覆膜，其中的一个缓冲蛋白胨水试纸滴加2滴0.1%甲基红指示剂后，立即观察颜色变化，红色为MR试验阳性，黄色为MR试验阴性；另一个缓冲蛋白胨水试纸滴加2滴40% KOH溶液，再滴加1滴5%α-萘酚溶液，30min内观察颜色变化，红色为VP试验阳性，无色为VP试验阴性；色氨酸肉汤试纸滴加2滴Koser靛基质试剂，立即观察颜色变化，红色为吲哚试验阳性，无色为吲哚试验阴性。陆桥大肠埃希氏菌生化鉴定试剂盒按说明书进行结果判断。IMViC试验（吲哚试验、MR试验、VP试验和枸橼酸盐利用试验）结果++--或-+--判断为大肠埃希氏菌阳性，其它为大肠埃希氏菌阴性。
结果测试片鉴定有9个菌落为大肠埃希氏菌阳性，1个为大肠埃希氏菌阴性，与陆桥试剂盒检测结果完全一致。

Claims (8)

1.一种细菌生化鉴定测试片，该生化鉴定测试片包括覆膜、底板，位于两者之间的离型纸，生化鉴定试纸和指示贴；
所述生化鉴定试纸按照包括如下步骤的方法制备：将吸附片材浸泡于生化鉴定试剂中，吸附饱和后取出烘干，裁切成大小合适的正方形，形成生化鉴定试纸。
2.根据权利要求1所述的细菌生化鉴定测试片，其特征在于：
所述离型纸上有1个或数个方孔，所述离型纸有离型膜一面于一边对齐粘贴于底板上，离型纸宽度同底板，长度短于底板，使底板一侧边有裸露的胶面；
所述生化鉴定试纸通过离型纸上的方孔粘贴于底板胶面上，同一细菌不同生化鉴定试纸可粘贴于同一底板上，制成该细菌的生化鉴定测试片；
所述覆膜粘贴于底板上有裸露胶面的一边，粘贴宽度为裸露胶面宽度的一半；
所述指示贴于底板有裸露胶面一侧边对齐粘贴。
3.根据权利要求1所述的细菌生化鉴定测试片，其特征在于：
和/或，所述吸附片材具体为无纺布；
和/或，所述底板具体为PET聚丙烯酸压敏胶胶带；
和/或，所述覆膜具体为PVC薄膜；
和/或，所述指示贴具体为彩色胶带。
4.一种细菌生化鉴定系统，它包括权利要求1所述的细菌生化鉴定测试片和与所述细菌生化鉴定测试片配套使用的压板；
所述压板包括压板平面和弹性压框。
5.根据权利要求4所述的细菌生化鉴定系统，其特征在于：
所述弹性压框是由四条同等长度的弹性板条组成的中间镂空的正方形；
所述弹性压框一个平面与压板平面于一面粘合连接；
所述压板平面面积大于弹性压框面积。
6.根据权利要求5所述的细菌生化鉴定系统，其特征在于：
所述压板平面为透明硬质塑料片材；
和/或，所述透明硬质塑料片材具体为聚丙烯片材；
和/或，所述弹性板条具体为热塑性聚氨酯弹性体板条。
7.权利要求4-6中任一所述的细菌生化鉴定系统中的压板。
8.一种细菌生化鉴定的方法，包括如下步骤：
1）揭起上述的细菌生化鉴定测试片的覆膜，将离型纸剥离底板再将待检细菌菌液滴加在所述测试片的生化鉴定试纸上，滴加量与该试纸吸附的试剂量相同，盖上所述覆膜；
2）将压板有弹性压框的一面，对准生化鉴定试纸，使生化鉴定试纸位于弹性压框内，用力压下，使覆膜与底板裸露的胶面粘合，得到待检测测试片；
3）按各生化鉴定项目要求或直接观察，或培养后观察，或培养后揭起覆膜，在生化鉴定试纸上滴加相应试剂后进行观察，判断结果。
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