CN108815534A - 一种具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物及其制备与应用 - Google Patents

一种具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物及其制备与应用，属于生物医药材料技术领域。所述衍生物由亲水的丝胶蛋白、疏水的维生素E琥珀酸酯组成，中间由二硫键连接；所述的丝胶蛋白和维生素E琥珀酸酯的质量比为20：1～100：1，平均每一百个氨基酸单元二硫键含量在10％～25％。本发明制备的具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物，在水溶液环境下可以自组装形成内部为疏水空腔的纳米胶束，可负载疏水性抗癌药物，在高还原型谷胱甘肽浓度下会发生断键，可实现肿瘤微环境下药物的快速释放。该胶束体系能够有效增强药物对癌细胞的杀伤效果，在癌症的治疗领域具有很好的研究价值和应用前景。

Description

一种具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物及其制 备与应用
技术领域
本发明属于生物医药材料技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物及其制备方法与应用。
背景技术
丝胶蛋白是一种天然高亲水性球蛋白，来源于绢丝昆虫，过去被视为蚕茧工业中的废物。近年来，丝胶蛋白被发现具有诸多生物活性，如细胞粘附性、低免疫原性和体内可生物降解等，在生物医学领域得到极大关注。目前，丝胶蛋白已经被制成各种形式的生物材料，包括膜、微球、水凝胶、电纺纤维和纳米粒子(LallepakLamboni.BiotechnologyAdvances,2015,33:1855-1867)。
丝胶蛋白分子本身具有两亲性特质，在水溶液中发生自组装，但是纯丝胶蛋白组装形成的粒子大小在500～1000nm之间，体内循环容易累积在肝脏和被网状内皮系统吞噬。近年来，有很多将丝胶蛋白设计成纳米粒子用于癌症治疗的尝试。比如将疏水性药物阿霉素偶联到丝胶蛋白上构建酸敏感的前药，用于宫颈癌治疗(Wang Lin,et al,ACS AppliedMaterials&Interfaces,2016,8,6577-6585)。比如通过丝胶蛋白与壳聚糖静电复合制备具有电荷反转性质的纳米粒子用作阿霉素药物的载体(DoudouHu,et al,ACS SustainableChemistry&Engineering,2017,5,1638-1647)。比如利用静电吸附硅氧烷并通过硅氧烷水解制备外壳交联的丝胶蛋白纳米粒子，负载阿霉素药物进行抗肿瘤治疗(DoudouHu,et al,ActaBiomaterialia,2018,74,385-396)。目前的国内外研究存在许多不足和改善空间，比如，针对肿瘤微环境如偏酸、高谷胱甘肽浓度、金属蛋白酶活性异常等进行更精细的设计，设计多重响应载体以应对复杂的体内环境，如何改善抗癌药物的治疗效果，等等。
作为天然维生素E的衍生物，维生素E琥珀酸酯能抑制多种肿瘤细胞的增殖，但对正常细胞组织无毒副作用，同时维生素E琥珀酸酯具有疏水性，目前市面上已有协同抗肿瘤的聚乙二醇-维生素E琥珀酸酯的产品，利用的就是其对癌细胞的抑制能力。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物。
本发明的另一目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物，由亲水的丝胶蛋白、疏水的维生素E琥珀酸酯组成，中间由二硫键连接；所述的丝胶蛋白和维生素E琥珀酸酯的质量比为20：1～100：1，平均每一百个氨基酸单元二硫键含量在10％～25％。
作为优选实施方式，上述一种具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.丝胶蛋白胱胺衍生物的制备：将干燥的丝胶蛋白粉末分散于超干DMSO溶剂中，搅拌至充分溶解，溶液澄清透亮，加入适量CDI活化若干小时，加入去离子水，猝灭没有反应的CDI；将上述丝胶蛋白溶液滴入胱胺水溶液，继续反应，反应结束在纯水中透析除去有机溶剂和水溶性杂质，冷冻干燥得到丝胶蛋白-胱胺衍生物(Ser-SS)；
S2.维生素E琥珀酸酯酰氯衍生物的制备：先将适量维生素E琥珀酸酯溶于干燥的良溶剂中，加入酰氯化试剂，避光反应一段时间，减压蒸馏除去溶剂和过量的酰氯化试剂，得到维生素E琥珀酸酯酰氯衍生物；
S3.氧化还原敏感丝胶蛋白-维生素E琥珀酸酯衍生物的制备：将S1得到的丝胶蛋白-胱胺衍生物溶于适量的DMSO，加入催化剂，继续加入适量S2得到的维生素E琥珀酸酯酰氯衍生物，反应一段时间后，用不良溶剂沉淀，真空干燥得到氧化还原敏感丝胶蛋白-维生素E琥珀酸酯衍生物，即具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物。
优选地，为有效制备均一的纳米胶束，步骤S1中丝胶蛋白粉分子量在3万～4万Da。
优选地，为更好的活化丝胶蛋白上的氨基或羟基，步骤S1中选用的活化剂CDI(N,N′-羰基二咪唑)用量为丝胶蛋白质量的1～5倍，胱胺的质量为丝胶蛋白质量的2～3倍。
优选地，步骤S1中所述的活化的时间为12～48h；更优选为12h。
优选地，步骤S1中所述的继续反应的时间为12h。
优选地，步骤S1中所述的透析是指用截留分子量为3500～10000Da的透析袋进行透析；更优选为5000Da的透析袋进行透析。
优选地，步骤S1中，加料条件为4～10℃低温。
优选地，为有效地将维生素E琥珀酸酯酰氯化，步骤S2中选用的酰氯化试剂为三光气或二氯亚砜，用量为维生素E琥珀酸酯摩尔分数的50％～100％，选用的溶剂为二氯甲烷，反应温度在0～100℃(更优选为10～25℃)，反应时间0.5～12h(更优选为6h)。
优选地，步骤S2中所述干燥的良溶剂为甲苯或二氯甲烷；更优选为二氯甲烷。
优选地，为有效控制丝胶蛋白胶束的粒径，步骤S3中维生素E琥珀酸酯酰氯衍生物的质量为丝胶蛋白质量的1％～10％(更优选为2％～10％)，选用催化剂为三乙胺和二甲氨基吡啶，三乙胺的用量为维生素E琥珀酸酯酰氯衍生物摩尔分数的1％～5％，二甲氨基吡啶的用量为维生素E琥珀酸酯酰氯衍生物摩尔分数的10％～100％。
更优选为，所述的三乙胺和二甲氨基吡啶的摩尔比1：10～1：20；进一步的，为1：16。
优选地，步骤S3中所述的反应的时间为12～24h；更优选为12h。
优选地，步骤S3中所述的不良溶剂为乙酸乙酯。
优选地，步骤S3中所述的丝胶蛋白-胱胺衍生物与维生素E琥珀酸酯的质量比为20：1～100：1。
所述的具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物在作为抗肿瘤药物载体上的应用。
所述药物载体为纳米药物载体，包括胶束、微乳、微球和纳米粒中一种或两种以上组合；
所述纳米药物载体为具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白胶束，其可通过透析法制备。
所述的具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白胶束，包括如下步骤：
将具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物的DMSO溶液转移至透析袋中，在水中透析，过滤，得到具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白胶束。
所述的透析袋的截留分子量为3500Da；
所述的透析的时间为24h。
所述的过滤是指用0.45μm微孔滤膜进行过滤。
制备得到的具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白胶束结构是核壳结构，亲疏水部分通过具有氧化还原响应的连接键连接，疏水空腔由具有协同增强抗肿瘤药物疗效的疏水分子组成，并可负载疏水性抗肿瘤药物。所述纳米胶束为球形，直径大小在100～200nm。
所述氧化还原敏感基团为二硫键。
所述的疏水性抗肿瘤药物为阿霉素。
一种负载抗肿瘤药物的具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白胶束的制备方法，包括如下步骤：
将具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物和适量阿霉素药物溶于DMSO，并加入三乙胺中和，在PBS溶液中透析除去有机溶剂，得到负载抗肿瘤药物的具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白胶束。
所述的透析是指用截留分子量为3500Da的透析袋进行透析。
优选地，为有效增强阿霉素对癌细胞的治疗效果，阿霉素的负载率为10～15％。
如上述制备的负载抗肿瘤药物的具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白胶束在生物医药领域进行应用，用于肿瘤治疗。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明公开的一种具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物，由亲水的丝胶蛋白和疏水的维生素E琥珀酸酯组成，利用维生素E琥珀酸酯抑制癌细胞增殖的作用有效提高阿霉素药物的抗肿瘤效果。
(2)本发明制备的具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物，在高谷胱甘肽浓度下会发生断键，可以实现肿瘤微环境下药物的快速释放。
(3)本发明的具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物的制备方法，以生物相容性良好、可生物降解的水溶性天然蛋白丝胶蛋白为原料，通过化学偶联的办法连接上具有氧化还原响应的胱胺基团，接着通过酰卤-胺反应连接疏水性具有协同增强抗癌药效作用的维生素E琥珀酸酯，制备得到的具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物，在水溶液环境下可以自组装形成内部为疏水空腔的纳米胶束，可以负载疏水性抗癌药物，在高还原型谷胱甘肽浓度下，能快速释放药物。该胶束体系能够有效增强药物对癌细胞的杀伤效果，在癌症的治疗领域具有很好的研究价值和应用前景。
附图说明
图1是实施例1中的氧化还原敏感的丝胶蛋白-胱胺衍生物的1HNMR谱图。
图2是实施例2中的氧化还原敏感丝胶蛋白-维生素E琥珀酸酯衍生物的1HNMR谱图。
图3是实施例3中负载阿霉素药物的氧化还原敏感丝胶蛋白-维生素E琥珀酸酯胶束的透射电镜图的药物释放曲线。
图4是实施例4中氧化还原敏感丝胶蛋白-维生素E琥珀酸酯胶束的的细胞存活率图。
图5是实施例4中负载阿霉素药物的氧化还原敏感丝胶蛋白-维生素E琥珀酸酯胶束的的细胞存活率图；其中，Ser-SS-VES/DOX表示Ser-SS-VES-3/DOX。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所涉及的试剂、方法，如无特殊说明，均为本领域常用的试剂和方法，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
实施例1具有氧化还原响应性质的丝胶蛋白-胱胺衍生物的制备
将5g干燥的丝胶蛋白粉末分散于50mL超干DMSO溶剂中，搅拌至充分溶解，溶液澄清透亮，将12g CDI溶于20mL干燥的DMSO，冰浴中滴加至上述丝胶蛋白溶液，滴加完成撤去冰浴，氮气保护下，室温搅拌反应12h，加入10mL去离子水，猝灭没有反应的CDI。冰浴中将上述丝胶蛋白溶液滴入50mL胱胺(15g)水溶液，撤去冰浴继续反应12h，反应结束在纯水中透析除去有机溶剂和水溶性杂质(透析袋截留分子量为5000Da)，冷冻干燥得到丝胶蛋白-胱胺衍生物(Ser-SS)。
通过1H NMR对相应产物的结构进行分析，核磁氢谱结果如图1所示，可以看出，Ser-SS在2.5～3.0ppm出现属于胱胺上亚甲基的质子峰。
实施例2氧化还原敏感丝胶蛋白-维生素E琥珀酸酯衍生物的制备
将100mg(0.19mmol)维生素E琥珀酸酯溶于20mL的无水二氯甲烷，加入30mg三光气(0.10mmol)，100μL DMF，避光25℃反应6h，反应结束后减压蒸馏除去有机溶剂，得到油状物，即维生素E琥珀酸酯酰氯衍生物；用10mL无水DMSO溶解维生素E琥珀酸酯酰氯衍生物，得到维生素E琥珀酸酯酰氯衍生物的DMSO溶液；将实施例1制备的500mg丝胶蛋白-胱胺衍生物，溶于15mL的超干DMSO，加入0.2mL(0.001mmol)超干的三乙胺和2mg(0.016mmol)二甲氨基吡啶，加入1、2.5、5mL的上述维生素E琥珀酸酯酰氯衍生物的DMSO溶液(即：维生素E琥珀酸酯酰氯衍生物的质量为丝胶蛋白质量的分别2％、5％、10％；三乙胺的用量分别为维生素E琥珀酸酯酰氯衍生物摩尔分数的5％、2％、1％；二甲氨基吡啶的用量为维生素E琥珀酸酯酰氯衍生物摩尔分数的84％、34％、19％)，反应12h，在乙酸乙酯中沉淀，反复三次，真空干燥得到氧化还原敏感的丝胶蛋白-维生素E琥珀酸酯衍生物。根据投料比不同制备三种氧化还原敏感的丝胶蛋白-维生素E琥珀酸酯衍生物，分别记作Ser-SS-VES-1、Ser-SS-VES-2，Ser-SS-VES-3。
通过1H NMR对相应产物的结构进行分析，核磁氢谱结果如图2所示，可以看出，在2.0ppm附近出现了属于维生素E琥珀酸酯亚(VES)甲基质子的峰，说明VES经化学偶联到丝胶蛋白主链上，随着反应中VES的增加，偶联到丝胶蛋白骨架上的维生素E琥珀酸酯的共振峰随之增强。
实施例3负载阿霉素药物的氧化还原敏感丝胶蛋白-维生素E琥珀酸酯胶束
分别称取20mg实施例2中制备的Ser-SS-VES-3溶于2mL DMSO中，充分溶解，装进截留分子量为3500Da的透析袋于500mL纯水中透析24h，3h、6h和12h换水，经450nm的针系过滤头过滤，定容至20mL，保存于4℃冰箱，留待检测。包裹阿霉素的胶束制备方法稍有不同，称取20mg Ser-SS-VES-3溶于2mL DMSO中，按照载药量不同，加入3mg盐酸阿霉素(DOX)，并加入100μL三乙胺中和，装进截留分子量为3500Da的透析袋透析，得到包裹阿霉素的丝胶蛋白衍生物胶束记作Ser-SS-VES-3/DOX。
通过紫外分光光度计测量释放液中阿霉素的浓度，并计算阿霉素在不同释放也条件下的累积释放率，结果如图3所示。负载阿霉素的Ser-SS-VES胶束具有氧化还原响应释放的能力，在10mM还原型谷胱甘肽浓度下，24小时内阿霉素累积释放达53％。
实施例4负载阿霉素的氧化还原敏感丝胶蛋白-维生素E琥珀酸酯胶束的细胞毒性分析
将肝癌细胞消化重悬，细胞密度调整为2×104个/mL，在96孔培养板加入培养液为200μL/孔。细胞贴壁生长后，分别加入不同浓度梯度的氧化还原敏感丝胶蛋白-维生素E琥珀酸酯胶束或负载了阿霉素药物的氧化还原敏感丝胶蛋白-维生素E琥珀酸酯胶束，37℃孵育24或48h，吸出培养基，每孔加入200μL DMEM培养基。每孔加入20μL CCK-8工作液，37℃孵育2h。吸去上清液，酶标仪测定450nm波长各孔的吸光度(A)值。实验重复3次。
用什么都没加的孔作为空白组，加了相应量细胞培养液、CCK-8溶液和细胞的孔作为对照组。
在图4的细胞存活率图中，可以看出氧化还原敏感丝胶蛋白-维生素E琥珀酸酯胶束具有良好的生物相容性，浓度高至500μg/mL，细胞存活率依然接近80％。
在图5的细胞存活率图中，可以看出，相比纯阿霉素药物，负载阿霉素药物的氧化还原敏感丝胶蛋白-维生素E琥珀酸酯胶束在相同浓度下，对细胞的杀伤效果差一点，因为经过包裹，阿霉素药物进核的速度会减慢，但对于产生阿霉素抗耐药性的癌细胞，这会是一个优势。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物，其特征在于：所述的衍生物由亲水的丝胶蛋白、疏水的维生素E琥珀酸酯组成，中间由二硫键连接；所述的丝胶蛋白和维生素E琥珀酸酯的质量比为20：1～100：1，平均每一百个氨基酸单元二硫键含量在10％～25％。
2.权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：
S1.丝胶蛋白胱胺衍生物的制备：将干燥的丝胶蛋白粉末分散于超干DMSO溶剂中，搅拌至充分溶解，溶液澄清透亮，加入适量CDI活化若干小时，加入去离子水，猝灭没有反应的CDI；将上述丝胶蛋白溶液滴入胱胺水溶液，继续反应，反应结束在纯水中透析除去有机溶剂和水溶性杂质，冷冻干燥得到丝胶蛋白-胱胺衍生物；
S2.维生素E琥珀酸酯酰氯衍生物的制备：先将适量维生素E琥珀酸酯溶于干燥的良溶剂中，加入酰氯化试剂，避光反应一段时间，减压蒸馏除去溶剂和过量的酰氯化试剂，得到维生素E琥珀酸酯酰氯衍生物；
S3.氧化还原敏感丝胶蛋白-维生素E琥珀酸酯衍生物的制备：将S1得到的丝胶蛋白-胱胺衍生物溶于适量的DMSO，加入催化剂，继续加入适量S2得到的维生素E琥珀酸酯酰氯衍生物，反应一段时间后，用不良溶剂沉淀，真空干燥得到氧化还原敏感丝胶蛋白-维生素E琥珀酸酯衍生物，即具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
步骤S1中丝胶蛋白粉分子量在3万～4万Da；
步骤S1中选用的活化剂CDI用量为丝胶蛋白质量的1～5倍，胱胺的质量为丝胶蛋白质量的2～3倍；
步骤S1中所述的活化的时间为12～48h；
步骤S1中所述的继续反应的时间为12h；
步骤S1中所述的透析是指用截留分子量为3500～10000Da的透析袋进行透析；
步骤S1中，加料条件为4～10℃低温。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
步骤S2中选用的酰氯化试剂为三光气或二氯亚砜，用量为维生素E琥珀酸酯摩尔分数的50％～100％，选用的溶剂为二氯甲烷，反应温度在0～100℃，反应时间0.5～12h；
步骤S2中所述干燥的良溶剂为甲苯或二氯甲烷。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
步骤S3中维生素E琥珀酸酯酰氯衍生物的质量为丝胶蛋白质量的1％～10％，选用催化剂为三乙胺和二甲氨基吡啶，三乙胺的用量为维生素E琥珀酸酯酰氯衍生物摩尔分数的1％～5％，二甲氨基吡啶的用量为维生素E琥珀酸酯酰氯衍生物摩尔分数的10％～100％；
步骤S3中所述的反应的时间为12～24h；
步骤S3中所述的不良溶剂为乙酸乙酯。
6.权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物在作为抗肿瘤药物载体上的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述药物载体为纳米药物载体，包括胶束、微乳、微球和纳米粒中一种或两种以上组合。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述纳米药物载体为具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白胶束，其通过透析法制备。
9.根据权利要求6～8任一项所述的应用，其特征在于：
一种负载抗肿瘤药物的具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白胶束的制备方法，包括如下步骤：
将具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白衍生物和适量阿霉素药物溶于DMSO，并加入三乙胺中和，在PBS溶液中透析除去有机溶剂，得到负载抗肿瘤药物的具有抗肿瘤活性的氧化还原敏感丝胶蛋白胶束。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：
所述的透析是指用截留分子量为3500Da的透析袋进行透析；
所述的阿霉素的负载率为10～15％。
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