CN108811577A - 一种减少草莓土壤病原菌含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种减少草莓土壤病原菌含量的方法，所述方法具体为定植前将B1619按6克/株的用量均匀的撒入定植沟穴中，再按每亩1500kg的标准灌注1.25％红糖水溶液，然后再按照15L/m²的标准灌注62～68℃的太阳能热水，活苗后按4克/株的量将B1619施于植株根部。或将重茬克星与土改按1∶1的比例均匀混合，定植前按每亩1.5kg的标准均匀穴施，之后再按每亩1500kg的标准灌注浓度为1.25％红糖水溶液。该方法有机环保，能够有效减少影响草莓生长的土壤病原菌，尤其是放线菌，轮枝菌以及镰刀菌的含量，进而减少由这些菌引起的病害。

Description

一种减少草莓土壤病原菌含量的方法

技术领域

本发明涉及土壤处理技术领域，具体涉及一种通过对种植草莓的土壤进行处理来减少草莓土壤病原菌含量的方法。

背景技术

土壤中含有大量的病原微生物。它们能够引起草莓的根腐病、萎凋病、青枯病、炭疽病、病毒病以及线虫病等土传病虫害等。盛茹媛对近些年来日益严重的草莓根腐病进行研究，通过田间病样采集、病原菌分离，共得到105个菌株。经形态学观察，初步认定为6个属，它们是镰刀菌属(Fusariumspp.)、腐霉菌属(Pythium spp.)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani.)、疫霉属(Phytophthora spp.)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis clavispora)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum.)。而曹奎荣等通过分离草莓根腐病病原菌并将其中的优势菌株重新接种到健康植株。发现接种后植株会染病并且病状与田间采集的病株样本基本一致。通过对培养的优势菌株进行分析，发现他们是尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kuhn)。草莓青枯病的病原菌为青枯假单胞菌，属细菌，这是一种维管束病害，最明显的症状就是植株枯萎，一旦草莓染上青枯病便会造成草莓全株的死亡(Kawaguchi et al.，1981)。康黎芳等对仙客来萎凋病病原菌分离及回接到健康植株，通过形态学分析具有致病性的菌株确定其为尖孢镰刀菌翠菊专化型(FusariumOxysporum Sehl fSp Callistephii(Beach)Snyder etHansen)。李菲菲等通过分离柑橘炭疽病病原菌并回接到健康植株、利用形态学分析有致病性的菌株，并通过rDNA-ITS序列分析法对有致病性的菌株进行分子鉴定。确定其为胶孢炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)。

目前常见减少土壤病原菌的方法包括轮作、高温闷棚或通过选育抗逆品种和交换品种移植等方式，采用化学药剂减少土壤病原菌是最常用的方法，但是化学药剂对人体有害，不符合现代有机农业的发展理念，因此采用有机环保的方法是现代农业发展的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种减少草莓土壤病原菌含量的方法，该方法有机环保，能够有效减少影响草莓生长的土壤病原菌，尤其是放线菌，轮枝菌以及镰刀菌的含量，进而减少由这些菌引起的病害。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种减少草莓土壤病原菌含量的方法，最佳方案为：所述方法具体为定植前将B1619按6克/株的用量均匀的撒入定植沟穴中，再按每亩1500kg的标准灌注1.25％红糖水溶液，然后再按照15L/m²的标准灌注62～68℃的太阳能热水，活苗后按4克/株的量将B1619施于植株根部。

本发明所述的病原菌优选地包括放线菌、轮枝菌和镰刀菌。

并且上述减少草莓土壤病原菌含量的方法，还可以为将重茬克星与土改按1∶1的比例均匀混合，定植前按每亩1.5kg的标准均匀穴施，之后再按每亩1500kg的标准灌注浓度为1.25％红糖水溶液。试验证明该方法也能够在一定程度上减少草莓土壤放线菌、轮枝菌和镰刀菌的含量。

另外，上述减少草莓土壤病原菌含量的方法，还可以为：定植前用宁盾一号A型剂2.5％稀释液100kg灌注土壤，宁盾一号B型剂1.25％稀释液100kg灌注土壤，最后再按每亩1500kg的标准灌注1.25％红糖水溶液。试验证明该方法也能够在一定程度上减少草莓土壤放线菌、轮枝菌和镰刀菌的含量。

本发明具有如下优点：

该方法简单易操作，并且环保无污染，符合有机草莓种植的发展理念，通过对土壤进行消毒处理，能够有效的减少某些病害的病原菌，进而减少有其带来的一些病害，进一步地可以减少防治这些病害产生的额外支出。

附图说明

图1是草莓根区土壤过氧化氢酶活性对比；

图2是草莓根区土壤蔗糖酶活性对比；

图3是草莓根区土壤脲酶活性对比。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例

一、材料与方法

1试验材料

实验材料为从八个不同处理中植株根系附近离地表5-20cm的土壤，荧光PCR分析仪、超净工作台、TE缓冲液、紫外分光光度记、土壤DNA提取试剂盒以及真菌细菌DNA提取试剂盒。

重茬克星(由北京天助益农科有限公司生产的一种每克中含有26亿个微生物菌群和病菌干扰素以及对镰刀菌有特效杀灭作用的专利成分ADT的生物菌素肥，其剂型为粉剂。其在土壤中迅速裂变、繁殖具有以菌克菌生物防治土传病害的功能)、土改(由北京天助益农科有限公司生产的一种高效含微量元素型多功能微生物菌剂。其能解决植株微量元素吸收难、利用率低等问题，其剂型为粉剂)、宁盾一号A型剂(由无锡本元生物科技有限公司生产的一种有效成分为芽孢杆菌的液体菌剂，其能促进农作物生长，提高农作物的免疫能力和抗逆能力)宁盾一号B型剂(由无锡本元生物科技有限公司生产的一种有效成分为芽孢杆菌(有效活菌数≥2亿CFU/ml)的液体菌剂，其能促进农作物生长，提高农作物的免疫能力和抗逆能力)、B1619：2亿活芽孢/克解淀粉芽孢杆菌B1619水分散粒剂(其是由江苏省农业科院植物保护研究所研制并由江苏省苏科农化有限责任公司生产的一种生防菌剂。B1619可有效控制枯黄萎病和根结线虫病，抑制土传病害发生和侵染，实现以菌治菌和土壤的生态修复)和粘细菌菌液(南京农业大学生命科学学院制备)。

试验用地在镇江农科所草莓高架种植大棚内。

2方法

2.1草莓定植前对土壤进行不同处理

处理1：在西1垄进行试验，设置3次重复，定植前按每亩750kg的标准灌注7.7％红糖水溶液。

处理2：在西2垄和西6垄进行试验，设置3次重复，将重茬克星与土改按1∶1的比例均匀混合，定植前按每亩1.5kg的标准均匀穴施。之后再按每亩1500kg的标准灌注1.25％红糖水溶液。

处理3：在西3、西7和西9垄进行试验，设置3次重复，定植前将B1619按6克/株的用量均匀的撒入定植沟穴中。之后再按每亩1500kg的标准灌注1.25％红糖水溶液。活苗后按4克/株的量将B1619施于植株根部。

处理4：在西10垄进行试验，设置3次重复，所述方法具体为定植前将B1619按6克/株的用量均匀的撒入定植沟穴中，再按每亩1500kg的标准灌注1.25％红糖水溶液，再按照15L/m²的标准灌注62～68℃的太阳能热水，活苗后按4克/株的量将B1619施于植株根部。

处理5：在西4垄和西8垄进行试验，设置3次重复。定植前用宁盾一号A型剂2.5％稀释液100kg灌注土壤，宁盾一号B型剂1.25％稀释液100kg灌注土壤，最后再按每亩1500kg的标准灌注1.25％红糖水溶液。

处理6：在西5垄进行试验，设置3次重复。定植前用太阳能热水(62～68℃，15L/m²)进行灌注。

处理7：在西11垄进行试验，设置3次重复。活苗后用南京农业大学生命科学学院制备的粘细菌菌液对植株进行灌根处理，每株用量25ml。

处理8：在西11垄试验，设置3次重复，作为空白对照。

2.2土壤DNA的提取

在草莓的苗期、蕾期以及采收期多点采集不同处理草莓根系附近距离土壤表层5-20cm的土壤，同一处理中每一次重复所采土壤均匀混合，密封低温保存。用Mobile公司生产的BIO-101 DNA extraction Kit试剂盒提取土壤微生物的总DNA。

2.3标准品的制作

吸取一个所需要参考菌系的菌液，将其稀释成一系列，分别接种于金氏B或马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，在24℃黑暗条件下培养72小时。用直接计数法算出每ml菌液所含细菌或真菌的个数，将菌液稀释至每ml含1000个细菌或真菌的菌液，用真菌DNA提取试剂盒和细菌DNA提取试剂盒提取其DNA。保存于-20℃冰箱备用。目标微生物所对对应的参考菌系见表1。

表1目标微生物的参考菌株

2.4DNA浓度的测定与稀释

取50ul提取的标准品DNA以及提取按一定浓度梯度稀释的提取土壤DNA稀释液。置于紫外分光光度计分别测定它们在波长260nm以及280nm处的吸光值。结果表明标准品的OD260/OD280值均在1.8左右，这说明标准品DNA的纯度很高。而土壤DNA的OD260/OD280均在1.7-2.0之间，OD260/OD280值大于1.9则说明有RNA污染。针对OD260/OD280大于1.9的几个样品，通过重新提取对应土壤样品的DNA，再次测定OD260/OD280，发现均符合要求。根据不同样品OD260的值利用公式DNA样品的浓度(ug/ul)＝OD260×稀释倍数×50/1000算得不同样品的DNA浓度。算得标准品和土壤DNA稀释液的浓度。对土壤DNA进行一系列的稀释，得到10倍浓度梯度由5ng/ul到5fg/ul的DNA稀释液。

2.5标准曲线的建立

用10倍浓度梯度的标准品的DNA模版进行荧光PCR扩增，得到标准曲线。一条合格的标准曲线要满足3个条件：1.R2＞0.980，这说明标准曲线具有较高的一致性。2.S≈-3.32，S代表着斜率。3.E：90％～105％，若结果在这一区间则说明标准品的DNA具有较高的扩增效率。

2.6土壤DNA的荧光PCR定量

荧光PCR定量反应体系为20ul其中含有10ul通用PCR预混试剂，上下游引物各0.2ul和2ul模版DNA以及12.5ul SYBR Premix Ex Taq加入96孔板后放入荧光PCR仪进行检测。引物和热循环参数见表2，引物由安徽通用系统有限公司合成。

表2目标微生物所对应的引物

2.7土壤蔗糖酶活性的测定

蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量、微生物数量及土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。土壤蔗糖酶活性的测定采用3，5-二硝基水杨酸比色法(关松荫，1986)，有改动。

分别吸取5mg/ml葡萄糖标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于试管中，补加蒸馏水至1mL，加3，5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min，取出冷水冷却至室温。将溶液转移至100ml容量瓶中，定容。以空白管调零在波长508nm处比色，以吸光度值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。

称取5g土样置于50mL锥形瓶中，加15ml8％蔗糖溶液，5mlpH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后在37℃恒温下培养24h。完毕取出迅速过滤，从中吸取滤液1ml注入小试管中，加3ml DNS试剂，在沸水浴加热5min，完毕取出冷水冷却3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后将试管内液体转移至50ml容量瓶中，并用蒸馏水定容稀释至50ml。在分光光度计上于508nm处进行比色。为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。蔗糖酶活性以24h，1g干土生成葡萄糖毫克数表示。

2.8土壤脲酶活性的测定

土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。脲酶能酶促尿素的水解形成二氧化碳、氨和水，因此可以测定酶促尿素产生氨或二氧化碳的量以表示脲酶的活性。本试验以测定氨量来检测土壤脲酶活性(林先贵，2009)。

向500mL容量瓶中分别加入0.1mg/mLNH4+-N溶液10、25、40、60、75及90mL于500mL容量瓶中，并用水稀释至刻度，测定和绘制标准曲线。

称取10g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中，向容量瓶中加入2ml甲苯。放置15分钟，再加入10ml 100g/L尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液(pH6.7)，混匀后将容量瓶放入38℃恒温箱中放置3h。培养结束后用加热至38℃蒸馏水稀释至刻度，仔细摇荡，将悬液过滤，滤液备用。对每一土样设置用水代替基质的对照。对整个试验设置无土壤对照，以检验试剂纯度。吸取1ml滤液于50ml容量瓶中，加入10ml蒸馏水，充分震荡，然后加入4ml苯酚钠，仔细混合，再加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度。用1cm比色杯，在分光光度计上于578nm处将显色液进行比色测定。脲酶活性以24小时后5g土壤中NH3-N的毫克数表示土壤脲酶活性。

二、数据与分析

2.1标准曲线

对各标准品模版DNA进行荧光定量PCR扩增，整理数据得到表3。

表3线性回归方程、相关系数及标准曲线得到的PCR效率与实时定量PCR对真菌和细菌的参考菌株

由表3可知，利用4种标准品模版DNA得到的标准曲线均符合1.R2＞0.980，2.S≈-3.32，3.E：90％～105％这3个条件，因此以此4标准品模版DNA得到的标准曲线来分析土壤DNA中所有细菌，防线菌，轮枝菌以及镰刀菌的方法是可靠的。设定阀值为15，根据同一浓度的不同土壤处理的DNA模板构建的PCR体系以及标准品DNA构建的PCR体系分别置于96孔板的3行上进行荧光PCR反应，根据所得到的Ct值在标准曲线上找到所对应的拷贝数，根据拷贝数以及稀释倍数可以推算得稀释前DNA溶中具体微生物DNA的浓度。

2.2草莓苗期土壤所有细菌，放线菌，轮枝菌以及镰刀菌的含量

表4草莓苗期土壤中一些微生物的量

由表4可知处理4、6能显著降低草莓苗期土壤中细菌，放线菌，轮枝菌以及镰刀菌的含量，即定植前对土壤穴施B1619并灌注1.25％红糖水溶液，再用热水灌注以及用太阳能热水灌注能降低草莓苗期所有细菌，放线菌，轮枝菌以及镰刀菌的含量。处理2、3、5能显著降低土壤中放线菌，轮枝菌以及镰刀菌的含量。即对土壤施用重茬克星与土改并灌注1.25％红糖水溶液、施用B1619并灌注1.25％红糖水溶液、施用宁盾一号并灌注1.25％红糖水溶液能显著降低土壤中放线菌，轮枝菌以及镰刀菌的含量。处理7只能降低草莓苗期土壤中轮枝菌与镰刀菌的含量。说明定植后对用粘细菌对土壤进行灌根处理能显著降低草莓苗期土壤中轮枝菌以及镰刀菌的含量。

2.3草莓现蕾期土壤中所有细菌，防线菌，轮枝菌以及镰刀菌的含量

表5草莓现蕾期土壤中一些微生物的量

由表5可知处理4、6能显著降低草莓现蕾期土壤中细菌，放线菌，轮枝菌以及镰刀菌的含量，即定植前对土壤穴施B1619并灌注1.25％红糖水溶液，再用热水灌注以及用太阳能热水灌注能降低草莓苗期所有细菌，放线菌，轮枝菌以及镰刀菌的含量。处理2、3、5、7能显著降低土壤中放线菌，轮枝菌以及镰刀菌的含量。即对土壤施用重茬克星与土改并灌注1.25％红糖水溶液、施用B1619并灌注1.25％红糖水溶液、施用宁盾一号并灌注1.25％红糖水溶液以及定植后对用粘细菌对土壤进行灌根处理能显著降低草莓现蕾期土壤中放线菌，轮枝菌以及镰刀菌的含量。

2.4草莓采收期土壤中所有细菌，防线菌，轮枝菌以及镰刀菌的含量

表6草莓现采收期土壤中一些微生物的量

由表6可知所有处理均不能显著降低草莓采收期细菌的含量。处理2、3、4、5、6、7均能降低草莓采收期土壤中放线菌，轮枝菌以及镰刀菌的含量，这表明施用重茬克星与土改并灌注1.25％红糖水溶液、施用B1619并灌注1.25％红糖水溶液、施用B1619并灌注1.25％红糖水溶液和热水灌注、施用宁盾一号并灌注1.25％红糖水溶液与用太阳能热水进行灌注(62～68℃，15L/m²)以及草莓定植后用粘细菌菌液对草莓进行灌根处理均能降低草莓采收期土壤中放线菌，轮枝菌以及镰刀菌的含量。

2.5不同处理对土壤酶活性的影响

该实验采用处理2、3、5、6，并且将原处理4改为：将B1619按6克/株的用量均匀的撒入定植沟穴中，而后注入粘细菌菌液15mL/株，再按每亩1500kg的标准灌注1.25％红糖水溶液。

表7草莓根区土壤酶活性

由表7可知，在草莓结果初期，不同制剂处理后土壤过氧化氢酶活性均受到显著抑制，所有处理土壤过氧化氢酶活性都显著小于CK，处理间过氧化氢酶活性也存在显著性差异，处理2、处理4过氧化氢酶活性相对较高，处理3过氧化氢酶活性最低；在结果末期，处理1、处理3、处理4土壤过氧化氢酶活性均显著大于CK。

从图1看出，草莓结果初期到结果末期部分处理土壤过氧化氢酶活性升高，部分活性下降，没有出现明显的变化规律。与CK比较，所有制剂处理土壤蔗糖酶活性在草莓结果初期均显著提高，处理间无显著性差异；在结果末期，处理3土壤蔗糖酶活性小于CK，处理4、处理6蔗糖酶活性大于CK，但均不显著，处理2、处理5蔗糖酶活性显著大于CK。从图2可以看出，所有处理土壤蔗糖酶活性从草莓结果初期到结果末期均明显下降。草莓结果初期除处理2土壤脲酶活性显著大于CK外，其余处理脲酶活性与CK无显著性差异；在结果末期仅处理4脲酶活性显著与于CK，处理5、处理6与CK无显著性差异，处理2、处理3脲酶活性均显著小于CK。从图3发现，草莓结果初期到结构末期处理2、处理3土壤脲酶活性出现显著下降，而处理4则明显提高，其余处理变化不明显。

在草莓整个生长期土壤中各种微生物的含量是不断变化的，大体上所有微生物的含量都在增加。在定植前加入太阳能热水能杀死部分土壤微生物，所以在苗期处理4和处理6土壤中各种微生物含量都较低。但在之后由于处理4中有B1619的存在，能够一定程度的抑制住轮枝菌与镰刀菌的繁殖。因此定植前施用B1619并灌注1.25％红糖水溶液和热水灌注(62～68℃，15L/m²)是众多处理中对一些草莓病原菌抑制效果最好的处理。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种减少草莓土壤病原菌含量的方法，其特征在于，所述方法具体为定植前将B1619按6克/株的用量均匀的撒入定植沟穴中，再按每亩1500kg的标准灌注1.25％红糖水溶液，然后再按照15L/m²的标准灌注62～68℃的太阳能热水，活苗后按4克/株的量将B1619施于植株根部。

2.根据权利要求1所述的减少草莓土壤病原菌含量的方法，其特征在于，所述病原菌包括放线菌、轮枝菌和镰刀菌。

3.根据权利要求1所述的减少草莓土壤病原菌含量的方法，其特征在于，所述方法还可以为将重茬克星与土改按1∶1的比例均匀混合，定植前按每亩1.5kg的标准均匀穴施，之后再按每亩1500kg的标准灌注浓度为1.25％红糖水溶液。

4.根据权利要求1所述的减少草莓土壤病原菌含量的方法，其特征在于，所述方法还可以为：定植前用宁盾一号A型剂2.5％稀释液100kg灌注土壤，以及宁盾一号B型剂1.25％稀释液100kg灌注土壤，最后再按每亩1500kg的标准灌注1.25％红糖水溶液。