CN108778284A - 高纯度游离脂肪酸二十碳五烯酸减少溃疡性结肠炎患者粪便钙卫蛋白水平及预防临床复发 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种给予有效剂量的高纯度游离脂肪酸二十碳五烯酸(EPA‑FFA)以在UC患者中减少粪便钙卫蛋白水平并且降低临床复发风险的方法。呈游离脂肪酸形式的所述二十碳五烯酸(EPA‑FFA)具有至少95％的纯度，更优选具有至少99％的纯度。

Description

高纯度游离脂肪酸二十碳五烯酸减少溃疡性结肠炎患者粪便 钙卫蛋白水平及预防临床复发
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年2月9日提交的美国临时专利申请序列号62/456,816的优先权，所述美国临时专利申请的内容通过引用以整体并入本文。
技术领域
本发明涉及高纯度二十碳五烯酸作为游离脂肪酸(EPA-FFA)用于在患有溃疡性结肠炎的受试者中减少粪便钙卫蛋白水平和复发的用途。
背景技术
溃疡性结肠炎(UC)是一种影响结肠的慢性炎症性病况，它的特征在于交替的活动期和缓解期。1在临床活动之前经常是进行性的无症状的粘膜炎症。临床前病况的有效治疗可以预防临床复发并且可以在UC的管理中潜在地发挥关键作用。
粪便钙卫蛋白(FC)是一种36千道尔顿的钙和锌结合蛋白，占粒细胞中总胞质蛋白的高达60％。它在粪便中保持稳定长达7天，与粪便粒细胞排泄有良好的相关性并且是炎症性肠病(IBD)患者中粘膜炎症的有用的标志物。2确切地说，在患有UC的患者中，高于150μg/g的FC水平与内窥镜下活性3和组织学活性4相关并且可以预测临床复发5-7。
长链膳食n-3多不饱和脂肪酸(PUFA)，特别是二十碳五烯酸(EPA，n-3鱼油的主要组分)在几种慢性炎症性病症中是有益的。8EPA参与免疫和炎症反应的调节。它通过置换n-6PUFA来调节细胞膜的组成，影响细胞信号转导中脂筏的形成，9并且引起抗炎性介质如消退素、防御素以及巨噬细胞消炎介质(maresin)的产生。8
尽管有实验证据表明n-3PUFA在炎症性肠病(IBD)中的作用的生物学合理性，但是关于n-3PUFA在IBD中的有效性的临床数据仍是有争议的和矛盾的，特别是在克罗恩氏病(Crohn's disease，CD)中。10-12值得注意的是，最近的流行病学研究表明n-3PUFA可以防止UC的发展13-15，但是结果是矛盾的。
因此，需要更强效和更具活性的ω-3PUFA，所述ω-3PUFA还表现出更大的体内稳定性和纯度。确切地说，需要使用呈游离脂肪酸形式的分离和纯化的ω-3PUFA，所述ω-3PUFA具有在患有溃疡性结肠炎的受试者中减少粪便钙卫蛋白水平和复发的能力。
发明内容
本发明涉及展示高纯度二十碳五烯酸作为游离脂肪酸(EPA-FFA)在一组无症状UC患者中减少粪便钙卫蛋白水平和预防复发的有效性，所述无症状UC患者有临床复发的风险，其被定义为粪便钙卫蛋白水平≥150μg/g。优选的是，呈游离脂肪酸形式的二十碳五烯酸(EPA-FFA)具有至少90％，并且更优选地至少95％并且最优选地至少99％的纯度。
在一个方面，本发明提供了一种在患有溃疡性结肠炎的受试者中减少粪便钙卫蛋白水平和复发的方法，所述方法通过向所述受试者给药一定量的EPA-FFA来实现，所述EPA-FFA具有至少90％，并且更优选地至少95％并且最优选地至少99％的纯度，所述一定量有效地在六个月的时间内将粪便钙卫蛋白水平减少到低于150μg/g粪便物并且更优选地低于110μg/g粪便物并且最优选地将FC减少约100μg/g或更多。重要的是，本发明已经证实在给药高纯度EPA-FFA的六个月的时间内FC高度纯化至少100μg/g，如结果中所示。
纯化的EPA-FFA可以与或不与药学上可接受的载体一起给药。
在另一个方面，本发明提供了一种在患有溃疡性结肠炎的受试者中减少粪便钙卫蛋白水平和复发的方法，所述方法是通过向所述受试者给药治疗量的EPA-FFA而实现的，所述EPA-FFA具有至少90％，并且更优选地至少95％并且最优选地至少99％的纯度，所述治疗量有效地在六个月的时间内单独或与用于治疗UC的其他治疗剂组合降低粪便钙卫蛋白水平低于150μg/g粪便物并且更优选地低于110μg/g粪便物并且最优选地低于85μg/g粪便物。可以与EPA-FFA组合的治疗剂可以包括氨基水杨酸化物(5-ASA)，如柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、美沙拉嗪(mesalamine)、奥沙拉嗪(olsalazine)、以及巴柳氮(balsalazide)；皮质类固醇，如泼尼松(prednisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)以及布地奈德(budesonide)；免疫调节剂；抗生素，如甲硝唑(metronidazole)、氨苄西林(ampicillin)、环丙沙星(ciprofloxacin)等；以及生物治疗剂，如抗体。
在又一个方面，本发明提供了一种包含治疗量的EPA-FFA的组合物，所述EPA-FFA具有至少90％，并且更优选地至少95％并且最优选地至少99％的纯度，所述治疗量有效地单独或与用于治疗UC的其他治疗剂组合降低粪便钙卫蛋白水平低于150μg/g粪便物并且更优选地低于110μg/g粪便物。可以与EPA-FFA组合的治疗剂可以包括氨基水杨酸化物(5-ASA)，如柳氮磺胺吡啶、美沙拉嗪、奥沙拉嗪、以及巴柳氮；皮质类固醇，如泼尼松、甲泼尼龙以及布地奈德；免疫调节剂；抗生素，如甲硝唑、氨苄西林、环丙沙星等；以及生物治疗剂，如抗体。
在又一个方面，本发明提供了包含治疗量的EPA-FFA的组合物的用途，所述EPA-FFA具有至少90％，并且更优选地至少95％并且最优选地至少99％的纯度，所述治疗量有效降低粪便钙卫蛋白水平低于150μg/g粪便物并且更优选地低于110μg/g粪便物。优选的是，所述治疗量是每天约250毫克至每天4克并且更优选地是每天约1000mg至每天约2g。此外，EPA-FFA可以与以下组合：氨基水杨酸化物(5-ASA)，如柳氮磺胺吡啶、美沙拉嗪、奥沙拉嗪、以及巴柳氮；皮质类固醇，如泼尼松、甲泼尼龙以及布地奈德；免疫调节剂；抗生素，如甲硝唑、氨苄西林、环丙沙星等；以及生物治疗剂，如抗体。
在另一个方面，本发明提供了一种在六个月的时间内相对于在给予高纯度EPA-FFA之前在具有大于约150μg/g至约200μg/g的粪便钙卫蛋白(FC)水平的患者中所测定的FC的量将FC的量降低约100μg/g或更多的方法。所述EPA-FFA具有至少90％，并且更优选地至少95％并且最优选地至少99％的纯度并且以每天约250毫克至每天4克并且更优选地每天约1000mg至每天约2g的治疗量。
再此外，本发明提供了高纯度EPA-FFA的用途，用于在六个月的时间内相对于在给予高纯度EPA-FFA之前在具有大于约150μg/g至约200μg/g的粪便钙卫蛋白(FC)水平的患者中所测定的FC的量将FC的量降低约100μg/g或更多。所述EPA-FFA具有至少90％的纯度，并且更优选地至少95％的纯度，并且最优选地至少99％的纯度，并且以每天约250毫克至每天4克并且更优选地每天约1000mg至每天约2g的治疗量。
本发明的这些和其他优势和特征将更充分地描述于随后的优选实施方式的详细说明中。
附图说明
图1示出了试验概览图。EPA-FFA＝二十碳五烯酸-游离脂肪酸。
图2示出了实现主要终点(A)和次要终点(B)的患者的比例。CI＝置信区间；EPA-FFA＝二十碳五烯酸-游离脂肪酸；OR＝优势比。
图3示出了累积3个月和6个月无复发存活率(卡普兰-迈耶法(Kaplan-Meiermethod))。EPA-FFA＝二十碳五烯酸-游离脂肪酸。
图4示出了根据治疗类型在基线、3个月以及6个月时的中值粪便钙卫蛋白水平。EPA-FFA＝二十碳五烯酸-游离脂肪酸。
具体实施方式
预防临床复发代表了治疗溃疡性结肠炎(UC)患者的主要结果。高粪便钙卫蛋白水平指示了粘膜炎症并且已经显示在许多组的UC患者中预测临床复发。最近的流行病学研究表明n-3多不饱和脂肪酸防止UC的发展。二十碳五烯酸是n-3鱼油的主要组分，已经显示在慢性炎症性病症中具有抗炎特性。本发明的目的在于确定高纯度二十碳五烯酸作为游离脂肪酸(EPA-FFA)在一组无症状UC患者中减少粪便钙卫蛋白水平和预防复发的有效性，所述无症状UC患者有临床复发的风险，其被定义为粪便钙卫蛋白水平≥150μg/g。
如本文所示，发现通过给予高纯度EPA-FFA接受治疗6个月的60名患有UC的患者的安慰剂对照试验降低了钙卫蛋白的粪便水平而没有严重的不良事件。因而，高纯度EPA-FFA在所治疗的患者中有效减少粪便钙卫蛋白FC的量并且这样的用途也可以具有使用高纯度EPA-FFA在患有UC的患者中测试有效性和鉴定无症状缓解的能力。
本发明是基于以下发现：EPA-FFA的给药在体内有效抑制或减少粪便钙卫蛋白水平。
优选的是，用于制备根据本发明的医药制剂、药物或组合物的EPA-FFA具有至少约90％的纯度并且将含有不超过最小量或药学上不显著量的任何其他多不饱和脂肪酸。建议大于95％的纯度，其中基本上不含任何其他多不饱和脂肪酸的最高市售等级(约99％纯度)是最优选的材料。
因此，根据本发明的一个方面，高纯度二十碳五烯酸作为游离脂肪酸被用于制备用于降低所治疗的受试者的粪便钙卫蛋白的医药制剂或药物。
EPA可以作为游离脂肪酸或以缀合形式，如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂存在于鱼油、植物或微生物中，并且可以经由本领域公知的多种手段来提取。这些手段可以包括用有机溶剂如甲醇和氯仿萃取；超声处理；使用例如二氧化碳的超临界流体萃取；以及物理手段，如压榨；或其组合。在期望时，可以将水层酸化以将带负电荷的部分质子化并且从而增加所期望的产物向有机层中的分配。在萃取之后，可以通过在氮气流下蒸发来去除有机溶剂。当以缀合形式分离时，可以对产物进行酶促或化学切割以释放游离脂肪酸或不太复杂的目标缀合物，然后可以进行进一步操作以产生所期望的最终产物。
如果需要进一步纯化，那么可以使用标准方法。这些方法可以包括萃取、用尿素处理、分步结晶、HPLC、分馏、硅胶色谱法、高速离心或蒸馏、或这些技术的组合。可以在任何步骤经由已知的技术，例如烷基化或碘化来对反应性基团，如酸基或烯基进行保护。可以在任何步骤去除保护基。理想的是，可以通过初始酯化、用尿素处理、超临界流体萃取以及色谱法，随后分离游离脂肪酸来完成含有EPA的级分的纯化。
为了从甘油三酯中分离EPA，必须通过水解或酯交换释放脂肪酸以使得可以实现纯化。可以通过诸如分馏、分子蒸馏以及色谱法的技术来实现纯化。特别理想的色谱法使用超临界流体，使用例如二氧化碳作为流动相，如欧洲专利EP 0 712 651中所述。已经发现使用这些技术，EPA可以被纯化到接近100％的水平。出于实际原因，EPA可以被纯化成它的乙酯或甲酯并且水解回到游离脂肪酸形式。纯化使得能够制备高度浓缩的并且不含在成品中不太期望的其他脂肪酸的产物。此外，可以去除其他化学实体，如甘油一酯和甘油二酯、烃、农药残留物等。高纯度EPA因此适用于人类摄入，这是因为它含有显著降低水平的毒素、导致不适口性的化合物或不期望的脂肪酸如饱和脂肪酸。EPA的游离脂肪酸形式可以容易地在肠道中吸收而无需事先的酶促转化。使用这种方法，可以将约150kg的不纯的EPA转化成50kg基本上纯的EPA-FFA，其具有至少90％的纯度。
如果需要进一步纯化，那么可以使用标准方法。这些方法可以包括萃取、用尿素处理、分步结晶、HPLC、分馏、硅胶色谱法、高速离心或蒸馏、或这些技术的组合。可以在任何步骤经由已知的技术，例如烷基化或碘化来对反应性基团，如酸基或烯基进行保护。可以在任何步骤去除保护基。理想的是，可以通过初始酯化、用尿素处理、超临界流体萃取以及色谱法，随后分离游离脂肪酸来完成含有EPA的级分的纯化。
优选的EPA游离脂肪酸是可以以商品名ALFATM(英国的S.L.A.Pharma公司(S.L.A.Pharma,UK))商购获得的。这种PUFA是99％纯的EPA，呈游离脂肪酸形式并且被配制成pH值依赖性肠溶包衣胶囊，所述胶囊被设计成确保在小肠中在pH 5.5下释放内容物。其他成分包括AA(≤0.5％)和痕量的其他脂肪酸。这种EPA制剂的关键优势是与许多鱼油产品相比，它的纯度高；它作为游离脂肪酸的呈现形式使全身生物利用度达到最大；容易在500mg胶囊中给药；以及延迟释放特征，这使胃肠道副作用最小化。
优选的是，99％纯的EPA-FFA以每天约250mg至每天4g并且更优选地每天约1000mg至每天约2g的量给药。所述剂量可以优选地每天给药，但是根据所述剂量，可以延长到每隔一天、每周或持续约1个月至8个月的更长时间。值得注意的是，作为ALFATM胶囊的99％纯的EPA的耐受性是优良的并且EPA的主要小肠递送使先前妨碍用其他鱼油制剂治疗的任何令人不愉快的味觉和嗅觉感知最小化。
单独的EPA-FFA或EPA-FFA与用于治疗UC的其他治疗剂的组合可以被配制用于多种递送方式。活性剂可以以液体或固体组合物形式口服给药。适用于口服给药的组合物包括固体形式，如丸剂、胶囊、颗粒剂、片剂以及粉剂；以及液体形式，如溶液、糖浆、酏剂以及悬浮液。可用于肠胃外给药的形式包括无菌溶液、乳液以及悬浮液。
固体组合物形式可以包括固体载体和一种或多种物质，所述物质也可以用作调味剂、润滑剂、增溶剂、助悬剂、填充剂、助流剂、压缩助剂、粘合剂或片剂崩解剂；它也可以是封装材料。在粉剂中，载体是微细的固体，其与微细的活性成分混合。在片剂中，将活性成分与合适比例的具有必要的压缩特性的载体混合并且压制成所期望的形状和尺寸。合适的固体载体包括例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷、低熔点蜡以及离子交换树脂。
将液体载体用于制备溶液、悬浮液、乳液、糖浆、酏剂以及加压组合物。可以将活性成分溶解或悬浮在药学上可接受的液体载体如水、有机溶剂、这两者的混合物或药学上可接受的油或脂肪中。液体载体可以含有其他合适的药物添加剂，如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、助悬剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透压调节剂。用于口服给药和肠胃外给药的液体载体的合适的实例包括水(部分含有如上的添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)；醇(包括一元醇和多元醇，例如二醇)和它们的衍生物、以及油(例如分级分离的椰子油和花生油)。对于肠胃外给药，载体也可以是油性酯，如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体载体可用于肠胃外给药的无菌液体形式组合物中。用于加压组合物的液体载体可以是卤化烃或其他药学上可接受的推进剂。
已经详细地描述了本发明，将显而易见的是，改动方案和变化方案是可能的而不脱离权利要求书中所限定的本发明的范围。此外，应当了解的是，提供以下实施例作为非限制性实施例。
本发明提供了双盲的随机化的安慰剂对照研究。将具有粪便钙卫蛋白水平≥150μg/g并且在至少前3个月内处于稳定治疗的六十名UC患者按1:1随机化以接受每天2克的EPA-FFA(2剂500mg缓释胶囊，每天两次)或安慰剂(2剂500mg癸酸和辛酸的缓释胶囊，每天两次)，持续6个月的时间。在基线时，患者接受了全结肠镜检查。在基线、3个月以及6个月时或在临床复发时进行粪便钙卫蛋白水平、临床以及实验室评估，所述临床复发已经被定义为伴有部分梅奥(Mayo)评分增加≥2的症状的发生和/或需要改变治疗。复发的患者被转为进行内窥镜评价。
已发现，所述群组在临床和人口统计学特征上没有差异。然而，与安慰剂组相比，在EPA-FFA组中粪便钙卫蛋白水平惊人地和显著地降低(p＝0.004)。在意向治疗分析时，EPA-FFA组中76.7％的患者和安慰剂组中50％的患者在治疗6个月时维持临床缓解(χ2p＝0.03)。二元逻辑回归分析显示EPA-FFA治疗是影响复发患者数量的唯一因素(HR 0.30，95％CI 0.10-0.92，p＝0.03)。在EPA-FFA组中，累积3个月和6个月无复发存活率分别是86.7％和76.7％，相比之下，在安慰剂组中，分别是80％和50％(对数秩检验，p＝0.04)。这两种治疗都是安全的和良好耐受的，没有严重的副作用。因此，令人惊讶和出人意料的是，发现EPA-FFA降低了粪便钙卫蛋白水平并且是维持UC患者无症状缓解的安全的和可接受的治疗。
材料和方法
研究设计和患者
符合条件的患者是18岁以上的个体，他们基于临床、内窥镜和组织学标准被诊断为患有UC；处于稳定的临床缓解，这被定义为在至少最近的3个月内部分梅奥评分<216；具有被定义为FC水平≥150μg/g的粘膜活动程度。允许在前3个月内没有改动的情况下使用用于UC的伴随治疗(如口服美沙拉嗪、免疫调节剂和/或生物药物)。排除标准是：1)最近使用类固醇(<3个月)、局部美沙拉嗪(<3个月)或其他实验药物(<3个月)；2)同时使用非类固醇抗炎药和/或抗凝剂；3)直肠炎；4)妊娠或哺乳；5)已知或疑似对EPA或n-3PUFA过敏；以及6)严重的合并症(严重的心肺、肝、肾、神经系统、精神疾病、糖尿病或出血性病症)。所有患者都提供书面知情同意书。
在基线时，符合纳入标准的患者接受血液检查，包括C反应蛋白(CRP)(正常上限5mg/L)以及全结肠镜检查和多处活检。然后将他们按1:1随机化以接受每天2g的EPA-FFA(2×500mg耐胃酸性缓释胶囊，每天两次)或2g安慰剂(2×500mg作为分级分离的植物脂肪酸的甘油三酯的癸酸和辛酸的耐胃酸性缓释胶囊，每天两次)，持续6个月的时间。随机化列表由医院的研究药物服务单位(Investigational Drug Service Unit，IDS)用计算机生成的，并且所有患者、研究人员以及整个研究团队对治疗分配不知情。
主要终点是在6个月时实现FC水平从基线降低100点(100μg/g或更多)的患者的比例。次要终点是在6个月时实现维持临床缓解的患者数量，所述临床缓解被定义为稳定的部分梅奥评分<2而治疗没有任何改变。还计算了由实现主要终点和次要终点的患者数量组成的组合终点。
在3个月和6个月时或在临床复发时重复临床评估、FC测量以及血液检查，所述临床复发被定义为伴有部分梅奥评分增加≥2的症状的发生和需要改变治疗。改变治疗被定义为通过引入类固醇和/或免疫抑制生物药物升级正在进行的治疗。只有临床复发的患者被转为进行第二次内窥镜评价。在每一次研究访视时验证饮食习惯的任何变化(包括变为绝对素食者或素食饮食)。通过胶囊计数来评价对治疗的依从性：如果80％-100％的处方胶囊没有归还给门诊诊所，那么实现了可接受水平的依从性。
粪便钙卫蛋白定量
在筛选阶段期间、以及在3个月和6个月时、或在临床复发时(在结肠镜检查之前24小时)进行粪便钙卫蛋白分析。FC临界水平≥150μg/g被认为指示了内窥镜下和/或组织学活性以及早期临床复发，如先前所证实。4-7遵循这些假设，认为FC下降100点(μg/g)是有临床意义的变化。
内窥镜和组织学评价
在基线时以及如果发生临床复发的情况下，进行结肠镜检查和多处结肠活检。根据梅奥内窥镜分项评分记录内窥镜下粘膜炎症的分级。16内窥镜下活性被定义为梅奥内窥镜分项评分>0。17根据Geboes分级系统对活检样品进行评分，临界评分≥3.1，这指示活性组织学炎症18。
粪便钙卫蛋白定量
在进行分析之前，将来自早晨第一次排便的粪便样品在冰箱中在2℃-8℃储存最长24小时。使用定量酶联免疫吸附测定(Calprest；意大利的里雅斯特的Eurospital公司(Eurospital,Trieste,Italy))，根据制造商的说明书进行FC水平的定量。使用具有已知浓度的钙卫蛋白的标准品作为参照。测量值在15μg/g至3000μg/g的范围内。
内窥镜和组织学评价
当活检显示不同程度的活性时，考虑最高程度的炎症。内窥镜医生和病理学家都对正在评价的时间点(基线或复发)不知情。
统计分析
假设EPA-FFA组中至少70％的患者以及安慰剂组中30％的患者的FC从基线降低100点(40％的差异)、5％的显著性水平、80％的功效、双侧费舍尔精确检验(Fisher'sexact test)，待招收的患者数量是56。假设7％的退出率，必须招收60名患者。接受至少1剂研究药物的被随机化接受治疗的所有患者都被包括在意向治疗(ITT)分析中。由于不良事件(AE)或其他原因而中止研究的患者被认为是无响应者。报告每一组的描述性统计数据(平均值和标准偏差[SD]或中值和四分位数范围[IQR])；进行二元逻辑回归分析以评价主要目标、次要目标以及组合目标。由于不能假定FC的正态分布，因此使用非参数曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U-test)比较在每一个时间点在组之间FC水平的差异，而使用方差分析和弗里德曼检验(Friedman test)来评估每一组内从基线到3个月和6个月的FC变化。如果弗里德曼检验实现显著性，那么进行使用邦费罗尼校正(Bonferroni correction)的事后威氏符号秩检验(Wilcoxon signed-rank test)。使用卡普兰-迈耶法来估计每一个治疗组在3个月和6个月时的无复发存活率(RFS)，并且使用对数秩检验来对它们进行比较。小于0.05的p值被认为具有显著性。使用IBM SPSS 23.0版(美国伊利诺斯州的芝加哥(Chicago,Illinois,USA))进行统计分析。
结果
研究群体
六十名患者符合纳入标准并且被招收以及被包括在ITT群体中，30名处于活性剂组中并且30名处于安慰剂组中。(图1)两个治疗组在基线人口统计学和临床特征方面是良好匹配的(表1)。在所提出的EPA-FFA组和所提出的安慰剂组中，在基线时的中值FC水平分别是177.5μg/g(IQR 161.5μg/g-210.3μg/g)和181μg/g(IQR 154.5μg/g-208.3μg/g)。在基线结肠镜检查时，所有患者都显示出梅奥内窥镜分项评分≤1；在EPA-FFA组和安慰剂组中，分别有30名患者中的24名(80％)和30名患者中的19名(63.3％)具有梅奥内窥镜分项评分＝1。所有患者都具有3.1至4.1的组织学Geboes评分。
主要终点：在6个月时FC水平降低100点
在3个月时，在EPA-FFA中30名患者中有16名(53.3％)实现了FC水平的100点降低，相比之下，在安慰剂组中30名患者中有4名(13.3％)实现了FC水平的100点降低(优势比[OR]7.59，95％置信区间[CI]2.04-28.15，p＝0.002)。在6个月时，在EPA-FFA组和安慰剂组中分别有30名患者中的19名(63.3％)和30名患者中的4名(13.3％)实现了FC水平的100点降低(OR 12.0，95％CI 3.12-46.24，p<0.001)(图2A)。
次要终点：在6个月时维持临床缓解
在6个月时，60名患者中有38名维持临床缓解：EPA-FFA组中30名患者中的23名(76.7％)和安慰剂组中30名患者中的15名(50％)(OR 3.29，95％CI 1.08-9.95，p＝0.035)(图2B)。在EPA-FFA组中，累积3个月和6个月RFS分别是86.7％和76.7％，相比之下，在安慰剂组中，累积3个月和6个月RFS分别是80％和50％(对数秩p＝0.04)(图3)。
组合终点：在6个月时FC水平降低100点和维持临床缓解
在6个月时，在EPA-FFA组和安慰剂组中分别有30名患者中的19名(63.3％)和30名患者中的4名(13.3％)实现了FC水平的100点降低和维持临床缓解(OR 13，95％CI 2.71-62.9，p＝0.001)。
治疗组之间和治疗组内FC水平的比较
仅考虑实现次要终点的患者，其中3个FC测量值是可获得的(在EPA-FFA组和安慰剂组中分别n＝23和n＝15)，在3个月和6个月时EPA-FFA组中的中值FC水平显著低于安慰剂组中的中值FC水平(曼-惠特尼，分别p＝0.002和p<0.001)。仅在EPA-FFA组内在3个月和6个月时FC水平从基线显著降低(弗里德曼：χ2(df 2)＝24.02，p＝0.001)。使用邦费罗尼校正进行的事后威氏符号秩检验产生设定在p<0.017的显著性水平(3次比较)。在基线、3个月以及6个月时EPA-FFA组中的中值(IQR)FC水平分别是176μg/g(160μg/g-207μg/g)、53μg/g(40μg/g-117μg/g)以及40μg/g(16μg/g-64μg/g)。从基线到3个月(Z＝-3.362；p＝0.001)和从基线到6个月(Z＝-3.711；p<0.001)，中值FC水平有统计显著性降低；在3个月与6个月之间没有观测到FC水平有统计显著性降低(Z＝-1.429；p＝0.153)。然而，在安慰剂组内，在基线、3个月以及6个月时的FC水平之间没有统计显著性差异(弗里德曼：χ2(df 2)＝3.73；p＝0.155)(图4)。
治疗组之间CRP水平的比较
中值CRP水平在3个月和6个月时在两个治疗组之间没有显著差异(曼-惠特尼，分别p＝0.8和p＝0.55)并且在研究期间在每一组内没有显著变化(弗里德曼：对于EPA-FFA和安慰剂分别是χ2(df 2)＝0.44，p＝0.80和χ2(df 2)＝0，p＝1)。
经历复发的患者的特征
排除退出的4名患者(1名由于妊娠并且3名由于轻度的AE)，18名患者经历临床复发(平均随访4.78个月，95％CI 4.11-5.45)。在EPA-FFA组(n＝5)中在复发时的中值(IQR)FC水平显著低于安慰剂组(n＝13)：分别是412μg/g(374μg/g-495μg/g)和535μg/g(476.5μg/g-738μg/g)(曼-惠特尼，p＝0.01)。在复发时在部分梅奥评分、梅奥内窥镜分项评分以及Geboes评分中没有观测到组间差异(表2)。
安全性和依从性
三名患者由于轻度AE而中止研究：2名(每一个治疗组中各1名)分别在治疗1个月和3个月之后由于腹泻而中止，并且1名(在EPA-FFA组中)在3个月之后由于胃气胀而中止。在任何一个治疗组中都没有报告严重AE。完成研究的所有患者都符合依从性标准，80％-100％的处方胶囊没有归还给我们的门诊诊所。
讨论
这是证实了高纯度EPA-FFA在UC患者中减轻粘膜炎症和预防有症状的复发的有益作用的首个临床研究，所述粘膜炎症如由FC水平所指示。所选择的主要终点是FC水平的降低，这是表明临床缓解的组织炎症减轻的标志。作为使用这样的终点的首个随机化安慰剂对照研究，选择FC水平降低100点是任意的；然而，发表的文献中的数据表明FC值<150μg/g指示低级别的组织学活性。4
最近的流行病学数据表明了n-3PUFA在降低UC的发病率方面的潜在有益作用。Ananthakrishnan等在一项进行了历时26年的大型群组研究(护士健康研究(Nurses'Health Study))中前瞻性地分析了UC病例并且发现大量摄入n-3PUFA与发生UC的风险降低有关。14此外，相对于n-3PUFA，食用高比率的促炎性n-6PUFA，已经与UC风险增加相关。15,19
然而，先前在UC中进行的鱼油衍生物的临床试验已经报道了混合的结果。20,21尽管有一些有益的作用，如减轻炎症和对类固醇使用的需求减少，但是这些研究未能证实鱼油衍生物在预防临床复发方面的明确的保护作用。对这些不同结果的可能的解释可能与不同的研究设计、所使用的n-3PUFA的配方、过宽的剂量范围、不佳的患者依从性、错误的给药时间、或使用橄榄油或其他PUFA作为安慰剂有关。22
在本研究中，将活性n-3PUFA配制成在耐胃酸性胶囊中的2g呈游离脂肪酸(FFA)形式的高纯度EPA(>95％)。先前，已经证实23-25，与乙酯和甘油三酯制剂相比，n-3PUFA的FFA形式提供了最有利的药物代谢动力学特征。此外，在对在8周内每天接受2g EPA-FFA的患有IBD的患者和健康志愿者的研究中，EPA一致地被并入血浆磷脂和血红细胞膜中。EPA-FFA经由二十二碳五烯酸快速转化成二十二碳六烯酸并且EPA可以被认为是n-3PUFA的“通用供体”。26
这是其中使用FC作为即将临床复发的替代物来选择有资格接受预防性治疗的患者的首个研究。先前公开的稳健的数据已经确定FC是粘膜炎症的非常可靠的标志物，与内窥镜评分3,5和组织学炎症分级4以及预测临床复发的能力有良好的相关性。5-7FC越来越多地被包括在高质量的良好设计的临床试验中作为对新治疗的响应的预测因子。27尽管，鉴定有在短期内发生有症状的复发的高风险的患者的最佳FC临界水平仍存在争议，但是先前的经验5在其他人公开的数据6,7的支持下表明150μg/g是用于所述目的的合理的临界值。认为重要的是准确地鉴定有复发风险的患者。FC和本文所示的结果提供了在症状发生之前鉴定和治疗该分组的患者的方法，从而减少急性发作事件、住院治疗、对更具毒性的药物的需求以及患者的失能。在EPIC 1试验中可以看到没达到最佳的标志物(对于鉴定有风险的患者)的负面影响。28在研究了n-3PUFA在预防CD复发方面的用途的大型研究中28，包括了363名处于临床缓解的CD患者，其中先前的缓解时间(在3个月与12个月之间)是复发风险的唯一标准。29结果显示在随访1年之后活性剂组(31.6％)和安慰剂组(35.7％)的患者中的同样低的复发率。对这一失败的可能的解释是用于鉴定有高复发风险的患者的标准的低灵敏度。在进入研究时使用CD的可靠炎症标志物如CRP，可以具有更好分层的有高复发风险的患者。
粘膜和组织学炎症是UC病程恶化的预测因子30，而低水平的FC预测持续的临床缓解。31与这些发现一致，在本文显示了FC水平的显著降低是要达到的重要终点，以延长无症状疾病过程。本文的数据支持了以下构思：将EPA-FFA添加到正在进行的UC治疗中可以减轻轻度粘膜炎症并且使疾病的临床活动稳定。此外，在患有长期UC的20名患者中进行的初步研究中，相同的EPA-FFA剂量改善了内窥镜和组织学炎症并且刺激杯状细胞分化。32
在本发明中确定，安慰剂组中的复发率高(在6个月时是50％)，这支持了FC鉴定有高复发风险的患者的能力。5根据其中测试FC作为临床病程6,7和疾病模式的预测因子的其他研究，CRP在整个研究期间没有发生显著变化，这确认了它与FC相比在监测UC疾病活性方面的灵敏度不佳。33
本测试的结果存在几个限制，如所招收的患者数量少、单中心设计以及相对短的随访期。然而，在具有升高的FC的患者中大部分临床复发病例在随访的前6个月期间发生。34尽管，FC是评估UC中的粘膜炎症的可靠的标志物，但是在基线时和在临床复发时另外进行了结肠镜检查和多处活检以提供疾病活性的无可置疑的证据。虽然可以合理地假设在研究结束时保持无症状的与筛选阶段相比具有稳定的FC水平的患者具有不变的梅奥内窥镜分项评分，但是在治疗结束时没有进行第二次结肠镜检查和活检是所述研究的相关限制。所选择的主要终点是FC水平的降低，这是表明临床缓解的组织炎症减轻的标志。作为使用这样的终点的首个随机化安慰剂对照研究，选择FC水平降低100点是任意的；然而，发表的文献中的数据表明FC值<150μg/g指示低级别的组织学活性。4
总之，这些令人鼓舞的数据证实了EPA-FFA的使用降低了粪便钙卫蛋白水平——UC中的重要的炎症标志物，并且是在UC患者中维持无症状缓解的安全且有前景的治疗。
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表1：患者人口统计学和基线特征
1卡方检验
2T检验
3曼-惠特尼U检验
4费舍尔精确检验
EPA-FFA：二十碳五烯酸游离脂肪酸；BMI：身体质量指数；EIM：肠外表现；5ASA：美沙拉嗪；AZA：硫唑嘌呤；FC：粪便钙卫蛋白；BMI：身体质量指数；CRP：C反应蛋白；IQR：四分位数范围；SD：标准偏差；TNF：肿瘤坏死因子。
表2：在临床复发时患者的特征(n＝18)
EPA-FFA：二十碳五烯酸游离脂肪酸；FC：粪便钙卫蛋白；IQR：四分位数范围。

Claims (24)

1.一种在患有溃疡性结肠炎的受试者中减少粪便钙卫蛋白水平和复发的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效降低粪便钙卫蛋白水平低于150μg/g的治疗量的EPA-FFA，所述EPA-FFA具有至少95％的纯度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述EPA-FFA具有至少99％的纯度。
3.根据权利要求1所述的方法，其中将所述粪便钙卫蛋白水平降低到约110μg/g或更低。
4.根据权利要求1所述的方法，其中经纯化的EPA-FFA与或不与药学上可接受的载体一起给药。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗量是每天约250mg至4g的量。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗量是约1000mg至约2g的量。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述治疗量被每天给药、每周给药和/或给药1个月至8个月。
8.一种用于在患有溃疡性结肠炎的受试者中减少粪便钙卫蛋白水平和复发的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效降低粪便钙卫蛋白水平低于150μg/g的治疗量的EPA-FFA，所述EPA-FFA具有至少95％的纯度并与用于治疗溃疡性结肠炎的其他治疗剂组合。
9.根据权利要求8所述的方法，其中可以与所述EPA-FFA组合的所述其他治疗剂选自：氨基水杨酸化物(5-ASA)；皮质类固醇；免疫调节剂；抗生素；以及生物治疗剂。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述EPA-FFA具有至少99％的纯度。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述粪便钙卫蛋白水平被降低到约110μg/g或更低。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述治疗量是每天约250mg至4g的量。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述治疗量是约1000mg至约2g的量。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述治疗量被每天给药、每周给药和/或给药1个月至8个月。
15.一种组合物，所述组合物包含与用于治疗溃疡性结肠炎的其他治疗剂组合并有效降低粪便钙卫蛋白水平低于150μg/g的量的EPA-FFA，所述EPA-FFA具有至少99％的纯度。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述其他治疗剂选自：氨基水杨酸化物(5-ASA)；皮质类固醇；免疫调节剂；抗生素；以及生物治疗剂。
17.具有至少95％纯度的治疗量的EPA-FFA有效降低粪便钙卫蛋白水平低于110μg/g粪便物的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述治疗量是每天500mg至约2g。
19.一种在三个月至六个月的时间内相对于在给予高纯度EPA-FFA之前在具有大于约150μg/g至约200μg/g的粪便钙卫蛋白水平的患者中所测定的粪便钙卫蛋白的量将粪便钙卫蛋白的量降低约100μg/g或更多的方法。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述EPA-FFA具有至少95％的纯度。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述EPA-FFA以每天约250毫克至4克的治疗量给药。
22.高纯度EPA-FFA在三个月至六个月的时间内相对于在给予高纯度EPA-FFA之前在具有大于约150μg/g至约200μg/g的粪便钙卫蛋白水平的患者中所测定的粪便钙卫蛋白的量将粪便钙卫蛋白的量降低至少100μg/g的用途。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述EPA-FFA具有至少95％的纯度。
24.根据权利要求22所述的用途，其中所述EPA-FFA以每天约250毫克至4克的治疗量给药。
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