CN108771685A - 水溶性富勒烯结构在制备治疗糖尿病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水溶性富勒烯结构在制备治疗糖尿病的药物中的应用，还公开了一种治疗糖尿病及其并发症的药物组合物及方法。本发明中治疗糖尿病及其并发症的有效成分为水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、水溶性的富勒烯和水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯、以上三者的可药用盐。本申请涉及的有效成分能在相对较短的时间内有效的降低血糖，经过服用，血糖值可显著降低，糖耐量可显著增加，能从而从根本上预防、缓解和治疗糖尿病引起的肝肾损伤、心血管病等并发症。

Description

水溶性富勒烯结构在制备治疗糖尿病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，特别涉及水溶性富勒烯结构在制备治疗糖尿病及其并发症的药物中的应用。

背景技术

糖尿病(DM)是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，其主要是由胰岛素分泌缺陷、胰岛素生物活性受损中的至少一种引起的糖类、蛋白质、脂肪代谢紊乱。糖尿病分为一型糖尿病，二型糖尿病和妊娠期糖尿病。一型糖尿病主要发于青少年，是胰岛素依赖型的糖尿病；二型糖尿病属于成人发病型糖尿病，多在35-40岁之后发作，占糖尿病患者的90％以上，其主要特点是胰岛素相对不足或胰岛素抵抗，其危害程度也最大，还可以引起许多慢性并发症，包括神经系统病变、循环系统病变、肾病、眼病和心血管疾病等多种并发症，对人类生命健康安全造成极大的伤害。由于由糖尿病并发症引起的死亡人数逐渐增多，糖尿病及其并发症的治疗获得了广泛的关注和研究。

富勒烯是除石墨、金刚石和无定型碳之外碳元素的另一种同素异形体。这类物质指的是由碳原子组成的笼状结构，其含量最多的分子是C₆₀，然后是C₇₀、C₈₄，其次是含量相对较少的C₇₆、C₇₈、C₈₂等。另外由于富勒烯的碳笼内部为空腔结构，因此其内部空腔可内嵌不同原子、离子或原子簇，被称之为内嵌富勒烯，如La@C₆₀，表示La内嵌在C₆₀的笼状结构中，@表示at，形象的表达了内嵌的含义。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、水溶性的富勒烯和水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者对应的可药用的酯或以上三者对应的可药用的盐在制备治疗糖尿病及其并发症的药物中的应用。本发明的另一目的在于提供一种治疗糖尿病及其并发症的药物组合物及方法。本发明的再一目的在于提供一种改善糖尿病及其并发症的保健品。本发明中涉及的有效成分水溶性富勒烯结构能在相对较短的时间内有效的降低血糖，显著增加糖耐量，从而从根本上治疗糖尿病及其引起的肝肾损伤、心脑血管病等并发症。

为了实现目的，本发明提供了以下技术方案：

一种水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、所述水溶性的富勒烯和所述水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯或以上三者的可药用的盐在制备治疗糖尿病及其并发症的药物中的应用。

本发明还提供了一种治疗糖尿病及其并发症的方法，包括向患有糖尿病的受试者施用有效量的至少一种选自下组的有效成分：水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、所述水溶性的富勒烯和所述水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯和以上三者的可药用的盐。

本发明还提供了一种治疗糖尿病及其并发症的药物组合物，包括至少一种选自下组的有效成分：水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、所述水溶性的富勒烯和所述水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯、以上三者的可药用的盐，所述药物组合物还包括可药用的载体、可药用的稀释剂和可药用的赋形剂中的至少一种。

本发明还提供了一种改善糖尿病及其并发症的保健品，包括至少一种选自下组的有效成分：水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、所述水溶性的富勒烯和所述水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯、以上三者的可药用的盐，所述保健品还包括适用于保健品的载体、适用于保健品的稀释剂和适用于保健品的赋形剂中的至少一种。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述水溶性的富勒烯选自下组中的一种或多种：(1)碳笼外表面修饰有亲水基团的富勒烯；(2)碳笼外表面被亲水性生物小分子包裹的富勒烯；(3)被具有生物相容性的载体材料负载的富勒烯；(4)自组装形成的水溶性超分子体系富勒烯。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述水溶性的内嵌金属富勒烯选自下组中的一种或多种：(1)碳笼外表面修饰有亲水基团的内嵌金属富勒烯；(2)碳笼外表面被亲水性生物小分子包裹的内嵌金属富勒烯；(3)被具有生物相容性的载体材料负载的内嵌金属富勒烯；(4)自组装形成的水溶性超分子体系内嵌金属富勒烯。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述富勒烯包括一种或多种通式为C_2m的由碳原子组成的笼状结构，20≤m≤60，可选的30≤m≤60，进一步可选的m为30、35或42。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述内嵌金属富勒烯包括M@C_2n、M₂@C_2n、MA@C_2n、M₃N@C_2n、M₂C₂@C_2n、M₂S@C_2n、M₂O@C_2n和M_xA_3-xN@C_2n中的一种或多种，其中：M、A均代表金属元素且M、A均选自镧系金属元素、Sc和Y中的任意一种，20≤n≤60，可选的30≤n≤60，进一步可选的n为30或35或41；0≤x≤3，例如：Gd@C₈₂。N代表氮元素，C代表碳元素，S代表硫元素，镧系金属元素包括La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述亲水基团包括羟基、羧基、巯基、氨基或亲水性氨基酸残基中的一种或多种。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，水溶性的内嵌金属富勒烯为水溶性羟基化Gd@C₈₂、水溶性氨基化Gd@C₈₂或水溶性羧基化Gd@C₈₂；水溶性的富勒烯为水溶性羟基化C₆₀、水溶性羟基化C₇₀、水溶性氨基化C₆₀、水溶性氨基化C₇₀、水溶性羧基化C₆₀或水溶性羧基化C₇₀。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述水溶性的富勒烯的通式为C_2a(OH)_b；20≤a≤60，可选的30≤a≤60，进一步可选的a为30或35或42；0<b≤50，可选的0<b≤30，10≤b≤30，20≤b≤30，进一步可选的b＝13、20、22、24或26。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述水溶性的内嵌金属富勒烯的通式为metallofullerene-(OH)_c；metallofullerene代表内嵌金属富勒烯本体，0<c≤50，可选的0<c≤30，10≤c≤30，20≤c≤30，进一步可选的c＝13、20、22、24或26。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述水溶性的内嵌金属富勒烯的通式为M@C_2d(OH)_e；M选自稀土金属，可选的稀土金属为Gd或La；20≤d≤60，进一步可选的30≤d≤60，d为41或30或35；0<e≤50，可选的0<e≤30，10≤e≤30，20≤e≤30，还可选的e＝13、20、22、24或26。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，水溶性的改性空心富勒烯为C₇₀(OH)₂₄；水溶性的改性内嵌金属富勒烯为Gd@C₈₂(OH)₂₆。

上述结构通式中C_2a(OH)_b、metallofullerene-(OH)_c和通式M@C_2d(OH)_e表示羟基连接于富勒烯或内嵌金属富勒烯上。通式中b，c，e都是通过检测计算得出的统计平均值。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述亲水性生物小分子包括氨基酸和肽链中的至少一种。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述具有生物相容性的载体材料包括脂质体和细胞膜载体的至少一种。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述水溶性的富勒烯是通过对原料富勒烯进行水溶性改性获得的；所述水溶性的内嵌金属富勒烯是通过对原料内嵌金属富勒烯进行水溶性改性获得的。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述水溶性改性的方法为以下方法中的任一种：(1)表面修饰亲水基团的方法一般在碱的作用下通过固液或者液液反应实现，具体为将原料富勒烯和原料内嵌金属富勒烯中的至少一种与双氧水和碱溶液混合并进行反应，再用乙醇洗涤，然后透析，即可得到与原料相应的水溶性羟基衍生物。如果需要获得水溶性氨基化衍生物，将上述步骤中的氢氧化钠替换成氨水即可。(2)物理包覆的方法可以将原料富勒烯和原料内嵌金属富勒烯中的至少一种与聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和环糊精中的至少一种混合并进行球磨或超声等就可以得到与原料相应的被包覆的水溶性富勒烯结构，如聚乙二醇包覆的富勒烯和/或聚乙二醇包覆的内嵌金属富勒烯，聚乙烯吡咯烷酮包覆的富勒烯和/或聚乙烯吡咯烷酮包覆的内嵌金属富勒烯。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述碱溶液具体可为氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，将原料富勒烯和原料内嵌金属富勒烯中的至少一种与双氧水和碱溶液混合并进行反应的操作为：称取30～200mg、可选的50～200mg、100～200mg的C₆₀或C₇₀或Gd@C₈₂固体，5～15ml 20～40％的双氧水，2～10ml 5～20％的碱溶液，在50～100℃的条件下混合，至相应C₆₀或C₇₀或Gd@C₈₂固体全部溶解。在此描述中，表现的是各物质之间的比例关系，实际应用中并不受50～200mg、5～15ml和2～10ml具体反应规模的限制，可按照比例进行扩大。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述原料富勒烯包括一种或多种通式为C_2m的由碳原子组成的笼状结构，20≤m≤60，可选的30≤m≤60，例如；C₆₀，C₇₀，C₈₄等。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述原料内嵌金属富勒烯包括M@C_2n、M₂@C_2n、MA@C_2n、M₃N@C_2n、M₂C₂@C_2n、M₂S@C_2n、M₂O@C_2n和M_xA_3-xN@C_2n中的一种或多种，其中：M、A均代表金属元素且M、A均选自镧系金属元素、Sc、和Y中的任意一种，20≤n≤60，可选的30≤n≤60，进一步可选的n为30或35或41；0≤x≤3。N代表氮元素，C代表碳元素，S代表硫元素，镧系金属元素包括La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述糖尿病为一型糖尿病或二型糖尿病，尤其为二型糖尿病。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述并发症包括糖尿病心血管并发症、糖尿病性脑血管病、糖尿病肾病、糖尿病眼部并发症、糖尿病足和糖尿病神经病变。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述治疗糖尿病及其并发症包括：1)使糖尿病引起的血糖升高趋于正常；2)使胰岛的大小和胰岛细胞的数量趋于正常；3)使糖耐量和胰岛素耐量趋于正常；4)使糖尿病肾病引起的肾指标失常趋于正常(肾指标包括：血肌酐，尿素氮)；5)治疗糖尿病病足；6)治疗糖尿病性视网膜病变、与糖尿病相关的葡萄膜炎和糖尿病性白内障；7)治疗糖尿病引起的冠心病；8)降低血脂(血脂指标包括：总胆固醇，甘油三酯，高低密度脂)

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，该药物或药物组合物可以是片剂、丸剂、散剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气溶胶、软膏、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液或无菌包装粉针剂的制剂。本发明中将有效成分制备成药物或药物组合物，使其在施用于受试者后速释、缓释或延迟释放有效成分，例如：有效成分可以与载体混合，用载体稀释或者包封在载体中。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，适宜作为载体、赋形剂和稀释剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、树脂、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆(water syrup)、甲基纤维素、尼泊金甲酯和丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和液状石蜡。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，该药物或药物组合物还可以另外包括润滑剂、润湿剂、乳化和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或矫味剂等助剂。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，当所述药物或所述药物组合物以液体形式存在时，有效成分在所述药物或所述药物组合物中的浓度为0.01-100mg/mL，可选的为0.01-10mg/mL，0.01-20mg/mL，0.01-30mg/mL，0.01-40mg/mL，0.01-50mg/mL，50-100mg/mL；当所述药物或所述药物组合物以固体形式存在时，有效成分在所述药物或所述药物组合物中的浓度为0.01-100mg/g，可选的为0.01-10mg/g，0.01-20mg/g，0.01-30mg/g，0.01-40mg/g，0.01-50mg/g，50-100mg/g。

上述方法在另一种实施方式中，所述受试者为人或动物，动物可以为哺乳动物，如小鼠、豚鼠、大鼠、狗、兔子、猴子等。

上述方法在另一种实施方式中，所述有效成分的施用剂量为1mg/kg/d-500mg/kg/d，可选的为1-100mg/kg/d，1-20mg/kg/d，1-10mg/kg/d，10-100mg/kg/d，施用疗程可以为5天-30天，根据病情可短期服用或长期服用；有效成分的施用方式可以为口服、静脉注射或腹腔给药。

上述方法在另一种实施方式中，有效成分的最佳施用方式为腹腔注射给药。与其他施用方式如：静脉注射和口服途径给药相比，腹腔注射给药使得水溶性富勒烯结构在胰腺的富集量大大增加，对糖尿病的疗效也更好。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，优选的，该药物或药物组合物为腹腔注射液。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，所述腹腔注射液中有效成分的浓度为0.01-50mg/ml，可选的为0.5-10mg/ml；所述腹腔注射液包括可药用的载体，所述可药用的载体包括水、生理盐水、PBS缓冲液和Tris-HCl溶液中的至少一种；可选的，所述生理盐水的浓度为0.85-0.90％；可选的，PBS缓冲液的浓度为0.01-0.1mol/L，组成的组分具体为Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和KCl；可选的，Tris-HCl溶液的浓度为0.05mol/L。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，本发明水溶性富勒烯结构可以通过多种机理来治疗糖尿病；其可以作为PI3K调节剂、AKT调节剂和/或AMPK调节剂通过调节PI3K、AKT和/或AMPK的表达、激活来治疗糖尿病，也可以作为糖异生调节剂或糖酵解调节剂来调节糖异生或糖酵解过程从而治疗糖尿病。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述调节PI3K、AKT或AMPK的表达、激活为促进PI3K、AKT或AMPK的表达、激活。

上述应用、方法、药物组合物或保健品在另一种实施方式中，所述调节糖异生为提高糖异生限速酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的含量、降低糖异生限速酶葡萄糖-6-磷酸酯酶的含量；所述调节糖酵解为提高糖酵解限速酶葡萄糖激酶的含量。

本发明所用的术语“治疗”包括其通常被接受的含义，该含义包括阻止、预防、抑制、改善以及减缓、停止或逆转所产生症状或预期病变的发展。照此，本发明涵盖治疗性和预防性的施用。

本发明所用的术语“有效成分”、“有效成分水溶性富勒烯结构”或“水溶性富勒烯结构”均指的是水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、水溶性的富勒烯和水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯和以上三者的可药用的盐中的至少一种。

本发明所用的术语“有效量”指有效成分经单次或多次施用于患者而给所诊断或所治疗的患者提供预期效应的量或剂量。有效量可由所参与的诊断医师作为本领域技术人员通过已知技术以及在类似情形下所得的观察结果而确定。在确定所施用有效成分的有效量或剂量时，所参与的诊断医师应考虑多种因素，所述因素包括但不限于：哺乳动物的种属；体积、年龄及一般健康；所涉及的具体疾病；该疾病的涉入程度或严重程度；个体患者的响应；所施用的具体化合物；给药模式；所施用制剂的生物利用度性质；所选择的给药方案；伴随药物疗法的使用；以及其它相关的情形。

本发明所用的术语“原料富勒烯”或是单独出现的“富勒烯”是指没有经过水溶性改性的富勒烯，即富勒烯本体。

本发明所用的术语“原料内嵌金属富勒烯”或是单独出现的“内嵌金属富勒烯”是指没有经过水溶性改性的内嵌金属富勒烯，即内嵌金属富勒烯本体。

为了方便计量，本发明中所有关于水溶性富勒烯、水溶性金属富勒烯的具体含量、浓度等定量的限定均是以其对应的富勒烯本体或内嵌金属富勒烯本体的具体含量、浓度等来衡量的，例如：有效成分的施用剂量为1mg/kg/d-500mg/kg/d是指每1天每1kg的小鼠要施用的有效成分中对应的富勒烯本体碳笼的量为1mg-500mg。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明中使原料富勒烯和原料内嵌金属富勒烯实现水溶性，是为了使其在生物体内随着血液循环输送至胰腺以及其他脏器发挥作用。有效成分水溶性富勒烯结构进入生物体内后，通过循环系统在胰腺内富集，改善胰腺中胰岛的微环境，修正胰岛的结构，减轻胰腺的功能性损伤，减小胰岛β细胞的损伤，使胰岛素的分泌趋于正常化。有效成分水溶性富勒烯结构具有大量的不饱和键，其在肝脏与肌肉中作用，可以清除自由基作用，改善体内的氧化还原水平，减轻胰岛素抵抗，增加葡萄糖的利用率，达到降低血糖的作用。

2、有效成分水溶性富勒烯结构能够在体内快速代谢，毒副作用小，具有良好的生物相容性。

3、糖尿病诊断指标为空腹血糖大于或等于7.0毫摩尔/升，和/或餐后两小时血糖大于或等于11.1毫摩尔/升，现有技术中糖尿病的治疗都需要药物长期作用，而本发明中有效成分富勒烯结构能在相对较短的时间内有效的降低血糖，经过服用5-30天后，血糖值可显著降低，糖耐量可显著增加，从而从根本上治疗糖尿病及其引起的肝肾损伤、心血管病等并发症。

4、发明人创造性的发现本申请水溶性富勒烯结构以腹腔注射液的形式通过腹腔注射进入生物体内，能够选择性的在胰腺处大量富集。腹腔注射时胰腺处富集的水溶性富勒烯结构是静脉注射时的5倍，口服时的100倍。并且腹腔注射液采用腹腔注射的方式进入生物体，使得本发明水溶性富勒烯结构能够直接与腹腔中的胰腺相作用，效果显著。

5、本发明水溶性富勒烯结构进入机体后，可以调节PI3K和/或AKT的表达和激活；活化的PI3K能产生第二信使PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白AKT和PDK1结合，促使PDK1磷酸化AKT Ser308从而导致AKT活化，活化的AKT可以调节其下游的信号分子，发挥作用，治疗相关的疾病或障碍。本发明水溶性富勒烯结构可以通过促进PI3K和/或AKT的表达和激活来改善胰岛素抵抗。

6、本发明水溶性富勒烯结构可以通过促进AMPK的表达和激活来降低血糖、减少炎性因子。

7、本发明水溶性富勒烯结构可以作为糖异生调节剂或糖酵解调节剂来调节糖异生或糖酵解过程中的关键限速酶从而治疗糖尿病。

根据下面参考附图对示例性实施例的详细说明，本发明的其它特征及方面将变得清楚。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。

图1为Gd@C₈₂(OH)_n材料水溶液的照片。

图2为实施例1所得Gd@C₈₂(OH)_n材料的电子自旋核磁共振(ESR)图，其中，平滑线表示空白对照，非平滑线表示加入Gd@C₈₂(OH)_n。

图3为实施例1所得Gd@C₈₂(OH)_n材料在生物体内的24h的代谢分布。

图4为治疗过程中空腹血糖的变化。

图5治疗两周后的糖耐受曲线。

图6治疗两周后的糖耐受实验中120分钟内的曲线下面积柱状图。

图7治疗两周后小鼠体内过氧化氢酶的含量变化。

图8治疗两周后小鼠体内丙二醛的含量变化。

图9A为实施例1制备得到的C₇₀(OH)_n的热重分析及微商热重曲线。图9B为实施例1制备得到的Gd@C₈₂(OH)_n的热重分析及微商热重曲线。

图10为实施例6中腹腔注射Gd@C₈₂(OH)_n24h后其在生物体内的代谢分布。

图11为实施例6中静脉注射Gd@C₈₂(OH)_n24h后其在生物体内的代谢分布。

图12为实施例6中口服Gd@C₈₂(OH)_n24h后其在生物体内的代谢分布。

图13为实施例6中糖尿病治疗过程中空白组、模型组、腹腔给药组、静脉给药组和灌胃给药组的空腹血糖的变化。

图14为实施例7中小鼠肌肉PI3K的相对mRNA表达水平，即：将空白组的PI3K mRNA表达水平设为1。

图15为实施例7中小鼠肌肉AKT的相对mRNA表达水平，即：将空白组的AKT mRNA表达水平设为1。

图16为实施例7中小鼠肌肉AKT和pAKT的蛋白表达水平。

图17为实施例7中小鼠肌肉pAKT/AKT的蛋白相对表达水平，即：将空白组的pAKT/AKT蛋白表达量比值设为1。

图18为胰岛素耐受实验中血糖的变化。

图19为实施例8中空白组、模型组和Gd@C₈₂(OH)_n实验组的db小鼠在治疗过程中的血糖变化。

图20为实施例8中空白组、模型组、Gd@C₈₂(OH)_n实验组和抑制剂组的小鼠在治疗第14天时的血糖水平。

图21为AMPK的相对mRNA表达水平,即：将空白组的AMPK mRNA表达水平设为1。

图22为AMPK和172位苏氨酸磷酸化AMPK蛋白表达分析示意图。

图23为pAMPK/AMPK的定量蛋白表达，即：将空白组的pAMPK/AMPK蛋白表达量比值设为1。

图24为葡萄糖-6-磷酸酯酶的mRNA相对表达水平。

图25为磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的mRNA相对表达水平。

图26为葡萄糖激酶的mRNA相对表达水平。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、元件未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例所用原料Gd@C₈₂固体粉末购买于厦门福纳新材料科技有限公司，分子量1141，纯度为99.1％。以下实施例所用原料C₆₀固体粉末购买于厦门福纳新材料科技有限公司，分子量720，纯度99％。以下实施例所用原料C₇₀固体粉末购买于厦门福纳新材料科技有限公司，分子量840，纯度99％。

实施例1、水溶性内嵌金属富勒烯C₇₀(OH)_n和Gd@C₈₂(OH)_n的制备

称取100mg C₆₀固体或100mg C₇₀固体或100mg Gd@C₈₂固体，7ml 30％的双氧水，3ml10％的氢氧化钠，在50℃的条件下混合，至C₆₀固体或C₇₀固体或Gd@C₈₂固体全部溶解后用乙醇洗涤，透析，得到富勒烯羟基化衍生物。

将其中的3ml 10％氢氧化钠替换成一定量的30％氨水，其他步骤按照上述方法中的进行，得到对应的氨基化衍生物，即水溶性富勒烯结构。

透析后所得的羟基化衍生物或氨基化衍生物中含有较多液体，也可将其进行浓缩获得Gd@C₈₂(OH)_n或C₇₀(OH)_n固体，但无论是否进行浓缩，原料金属富勒烯Gd@C₈₂的水溶性改性已经完成，是否进行浓缩不影响水溶性内嵌金属富勒烯Gd@C₈₂(OH)_n或C₇₀(OH)_n的使用，使用时只要将其调整至合适的浓度即可。

图1即为200μM的Gd@C₈₂(OH)_n水溶液照片，可以看出其澄清透明，水溶性好，内嵌金属富勒烯浓度可以通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)进行测定。

实施例2、水溶性的内嵌金属富勒烯Gd@C₈₂(OH)_n清除自由基能力检测

本发明通过电子自旋共振波谱(ESR)来检测水溶性内嵌金属富勒烯Gd@C₈₂(OH)_n清除自由基的能力。

检测方法：采用紫外诱导产生羟基自由基的方法，将50μL质量浓度为39％的双氧水、50μLPBS缓冲溶液(pH＝7.4)和微量(0.133mM)的二甲基吡啶N-氧化物(DMPO，自由基捕获剂)溶液混合，对照组直接照射紫外，而实验组立即加入200μM的按照实施例1中方法制备的Gd@C₈₂(OH)_n的水溶液10μL，并分别用280nm的紫外光照射4min，检测自由基信号。如图2所示，平滑线为没有加入按照实施例1方法所得的Gd@C₈₂(OH)_n的空白对照，非平滑线为加入Gd@C₈₂(OH)_n的实验组样品，与空白对照相比，加入Gd@C₈₂(OH)_n样品的信号明显降低，说明加入Gd@C₈₂(OH)_n样品的实验组存在的自由基较少，Gd@C₈₂(OH)_n有强的清除自由基能力。

实施例3、水溶性内嵌金属富勒烯Gd@C₈₂(OH)_n的体内代谢

取浓度为1mM的按照实施例1中的方法制备的Gd@C₈₂(OH)_n200μL通过腹腔注射进入C57小鼠体内，24h正常饲养后解剖，取小鼠器官心，肝，脾，肺，肾，胰腺称重，并用65％的硝酸消解在120℃的条件下过夜，稀释50倍后通过ICP测定钆离子浓度。如图3中，可以看出水溶性内嵌金属富勒烯Gd@C₈₂(OH)_n在胰腺富集远多于心、肾、肺和脾。

实施例4、水溶性内嵌金属富勒烯Gd@C₈₂(OH)_n对糖尿病的治疗

(1)实验方法

实验动物为db/db糖尿病小鼠，购自南京动物模式中心，引自美国杰克逊实验室。此小鼠是广泛应用的2型糖尿病动物模型，其为瘦素受体基因缺陷导致肥胖后发展为糖尿病的小鼠模型，瘦素受体(leptinreceptor，Lepr)的自发性突变会引起多食、消渴、多尿等症状。db/db小鼠在10～14天出现高胰岛素血症，3～4周明显肥胖，4～8周出现高糖血症。

实验动物分为3组，每组6只。A组取6只db/m无糖尿病的小鼠作为空白组，其给药治疗为施用与C组所用药物等体积的生理盐水；B组取6只db/db小鼠作为模型组，其给药治疗为施用与C组所用药物等体积的生理盐水；C组取6只db/db小鼠作为Gd@C₈₂(OH)_n实验组，其给药治疗为施用按照实施例1的方法制备的Gd@C₈₂(OH)_n。A-C组均采用腹腔给药的方式，各组小鼠的周龄进入第10周开始给药，每天给药1次，Gd@C₈₂(OH)_n给药剂量为10mg/kg/d，连续给药两周。

(2)实验结果

本发明通过db/db糖尿病小鼠血糖的变化和糖耐受实验来证明水溶性的内嵌金属富勒烯Gd@C₈₂(OH)_n对糖尿病的治疗作用，通过血生化证明其改善体内氧化还原水平。

1)空腹血糖

第1次给药前测空腹血糖，计为0d，之后在第5天、第9天和第14天给药前测空腹血糖，每次测空腹血糖前需禁食3h。结果如图4所示，图4为空腹血糖变化图，从图4中可以看出模型组只注射生理盐水进行治疗的糖尿病小鼠在第14天时的空腹血糖要远高于实验组注射Gd@C₈₂(OH)_n进行治疗的糖尿病小鼠。

2)糖耐受实验

给药2周结束后进行糖耐受实验。禁食12h后测血糖值计为0min的血糖值，然后灌胃葡萄糖溶液，剂量为2g/kg，然后分别在15，30，60，120min时测血糖，作图得到糖耐受曲线，并且计算了曲线下面积(AUC)来表征小鼠的糖耐受能力。结果如图5和图6所示，实验组注射Gd@C₈₂(OH)_n进行治疗的糖尿病小鼠对血糖的控制能力强于模型组只注射生理盐水进行治疗的糖尿病小鼠，且实验组的AUC明显小于模型组，说明Gd@C₈₂(OH)_n能够较好地治疗糖尿病，增加糖耐量，增强小鼠对血糖的调节控制能力。

3)体内氧化还原水平测试

CAT是一种酶类清除剂，它可促使H₂O₂分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H₂O₂的毒害。MDA为自由基代谢产物，产生更多的自由基时，其含量会增加。

给药两周后的各组小鼠通过眼球取血，将血液样品在室温下静置1h后，3500rpm离心15min，吸取上层血清，利用分光光度法，测定405nm处的吸光度计算得到过氧化氢酶(CAT)的含量，测定532nm处的吸光度计算得到丙二醛(MDA)的含量，以上2种物质的检测均可通过市面可获得的相应试剂盒进行检测。如图7所示Gd@C₈₂(OH)_n治疗后的小鼠体内过氧化氢酶增加，如图8所示Gd@C₈₂(OH)_n治疗后的小鼠体内丙二醛减少，说明自由基减少，这两个指标都说明水溶性富勒烯结构治疗糖尿病不仅降低血糖，更重要的是会改善小鼠体内的氧化还原水平，减少并发症的发生。

上述实施例对基因缺陷db/db糖尿病小鼠进行了治疗，结果表明水溶性的内嵌金属富勒烯Gd@C₈₂(OH)_n具有降血糖、增加糖耐量的功能，并且还能够改善小鼠体内的氧化还原水平，从而能从根本上治疗糖尿病引起的肝肾损伤、心血管病等并发症。

实施例5

对实施例1制备得到的C₇₀(OH)_n进行元素分析(Flash EA1112)，并结合热重和微商热重结果分析其所接羟基数。在元素分析的结果中，所述C₇₀(OH)_n中，C含量为37.85％，H含量为1.51％，N含量<0.3％。从图9A热重分析可知，C₇₀(OH)_n固体粉末中含3.7％的水，结合元素分析中H含量与C含量的比值，可推算碳笼表面修饰了24个羟基。所以C₇₀(OH)_n的平均结构式为C₇₀(OH)₂₄。

对实施例1制备得到的Gd@C₈₂(OH)_n进行元素分析，并结合热重和微商热重结果分析其所接羟基数。在元素分析的结果中，所述Gd@C₈₂(OH)_n中，C含量为36.95％，H含量为2.36％，N含量0％。从图9B热重分析可知，Gd@C₈₂(OH)_n固体粉末中含12.6％的水，结合元素分析中H含量与C含量的比值，可推算碳笼表面修饰了26个羟基。所以Gd@C₈₂(OH)_n的平均结构式为Gd@C₈₂(OH)₂₆。通过动态光散射(DLS)测定水溶性衍生物的粒径，Gd@C₈₂(OH)_n材料的粒径约为145.2nm，可以向生物体内注射。

实施例6、最佳给药方式的确定

药物的给药途径有很多，包括口服、静脉注射、腹腔注射、皮下注射等。不同的疾病对应着不同最佳的给药方式。本发明研究了口服、腹腔注射和静脉注射这三种主要的给药方式，并确定了水溶性富勒烯结构的最佳给药方式。本申请中有效成分水溶性富勒烯结构的最佳给药方式是以腹腔注射液的形式通过腹腔注射给药，其他注射方式与腹腔注射相比，如：静脉注射和口服途径给药时，胰腺的富集量大大减少，对糖尿病及其并发症的疗效也差。

实施例6.1、不同给药方式下水溶性金属富勒烯Gd@C₈₂(OH)_n的体内代谢

取浓度为1mM的按照实施例1中的方法制备的金属富勒烯Gd@C₈₂(OH)_n，将其分别通过静脉注射、口服和腹腔注射的方式送入C57小鼠体内，Gd@C₈₂(OH)_n剂量为10ml/kg。于24h正常饲养后解剖取材，心，肝，脾，肺，肾，胰腺称重，并用65％的硝酸在100℃的条件下消解24h，稀释50倍后通过ICP测试测定钆离子浓度。

如图10中，通过腹腔给药的方式施用Gd@C₈₂(OH)_n后，其在胰腺处富集最多，在胰腺中可达4.5μg/g。如图11中，静脉注射Gd@C₈₂(OH)_n后，Gd@C₈₂(OH)_n主要在肝脏中富集，胰腺中很少，只有不到1.0μg/g。如图12所示，灌胃给药后，Gd@C₈₂(OH)_n富集较少，即使在胰腺中富集最多，但是只有约0.035μg/g。这说明本发明的水溶性富勒烯结构通过腹腔注射能够选择性的在胰腺处大量富集，而且是静脉的5倍，口服的100倍。

实施例6.2、不同给药方式下水溶性金属富勒烯结构对糖尿病的治疗

实验动物为db/db糖尿病小鼠，此小鼠为瘦素受体基因缺陷导致肥胖后发展为糖尿病的二型糖尿病小鼠模型。实验动物随机分为5组，每组6只：A组为db/m无糖尿病的小鼠空白组；B组为db/db小鼠生理盐水模型组；C组为Gd@C₈₂(OH)_n腹腔注射给药实验组；D组为Gd@C₈₂(OH)_n静脉注射给药实验组；E组为Gd@C₈₂(OH)_n口服灌胃给药实验组。各组均为第10周开始给药，A组和B组腹腔注射施用生理盐水，C组、D组和E组按照相应方式施用实施例1制备的Gd@C₈₂(OH)_n溶液(Gd@C₈₂(OH)_n溶解在0.9％生理盐水中形成的Gd@C₈₂(OH)_n浓度为10mg/ml的溶液)，各组均为每天给药1次，C组、D组和E组中Gd@C₈₂(OH)_n的给药剂量为10mg/kg/d，A组和B组施用的生理盐水的体积与C-E组施用的Gd@C₈₂(OH)_n溶液相同，各组均为连续给药两周。

测血糖前禁食3h，可得到空腹血糖。第一次给药前测空腹血糖，计为0d，之后在第5天、第9天和第14天给药前测空腹血糖，结果如图13所示，图13为糖尿病治疗疗程中空腹血糖的变化，从图13中可以看出B组只腹腔注射生理盐水的小鼠在疗程结束时的空腹血糖高于注射Gd@C₈₂(OH)_n的实验小鼠，并且，腹腔注射给药实验组C组的血糖要低于其它两种给药方式的治疗。这从活体水平印证了实施例6.1中的代谢结果，说明水溶性富勒烯结构的最佳治疗给药方式为腹腔给药。

本实施例以糖尿病为模型，通过不同的给药方式来研究水溶性内嵌金属富勒烯Gd@C₈₂(OH)_n在生物体内代谢以及治疗糖尿病的效果，结果显示，水溶性富勒烯结构能够通过腹腔给药的方式在胰腺富集，并有效治疗糖尿病。

实施例7、水溶性内嵌金属富勒烯Gd@C₈₂(OH)_n调节PI3K和/或AKT

PI3K是一种细胞内磷脂酰肌醇激酶，是由调节亚基p85和催化亚基p110构成的异二聚体，其与v.sre和v.ras等癌基因的产物有关。PI3K依其结构和底物的特异性不同分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类型。其中Ⅲ型PI3K以PI为底物，Ⅱ型以PI及PIP为底物，Ⅰ型以PI、PIP及PIP2为底物，使底物的肌醇环发生磷酸化。

AKT也称作蛋白激酶B，代表了丝氨酸/苏氨酸激酶亚族。目前证实AKT有三种亚型，即AKT1，AKT2，AKT3，具有类似的结构。

PI3K-AKT信号通路是胰岛素的主要信号通路。胰岛素首先与细胞表面的胰岛素受体结合，激活其β亚基的酪氨酸激酶，然后通过胰岛素受体底物蛋白的激活来激活PI3K信号，活化的PI3K产生第二信使PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白AKT和PDK1结合，促使PDK1磷酸化AKT的Ser308导致AKT活化。激活后的AKT可以通过磷酸化作用激活或抑制下游的一系列底物如Bad，cas9，GSK等，从而调节细胞的增殖分化，凋亡以及迁移等等。从而影响与AKT调节相关的疾病。胰岛素激活的PI3K促使AKT激活后，可以对细胞内的葡萄糖转运体囊泡产生易位作用，另一方面通过调节糖原合成酶激酶促进糖原合成。即PI3K和AKT等一系列信号参与介导糖脂代谢的调节。

本发明以db糖尿病小鼠为模型，以水溶性内嵌金属富勒烯Gd@C₈₂(OH)_n为例，研究了水溶性富勒烯结构调节、激活PI3K和AKT的作用，以及在改善胰岛素抵抗中的应用。

(1)实验方法

实验动物为db/db糖尿病小鼠，购自南京动物模式中心，引自美国杰克逊实验室。此小鼠是广泛应用的2型糖尿病动物模型，其为瘦素受体基因缺陷导致肥胖后发展为糖尿病的小鼠模型，瘦素受体(leptinreceptor，Lepr)的自发性突变会引起多食、消渴、多尿等症状。db/db小鼠在4～8周出现高糖血症。

实验动物分组：实验动物随机分为4组，每组6只；A组取6只db/m无糖尿病的小鼠作为空白组，其给药治疗为施用与C组所用药物等体积的生理盐水；B组取6只db/db小鼠作为模型组，其给药治疗为施用与C组所用药物等体积的生理盐水；C组取6只db/db小鼠作为Gd@C₈₂(OH)_n实验组，其给药治疗为施用按照实施例1的方法制备的Gd@C₈₂(OH)_n；D组为抑制剂组，抑制剂组小鼠除了按照Gd@C₈₂(OH)_n实验组小鼠施用Gd@C₈₂(OH)_n的方法施用Gd@C₈₂(OH)_n以外，在进行胰岛素抵抗试验前1h和解剖前1h分别口服给药AKT抑制剂MK2206，30mg/kg/次。A-D组的生理盐水或Gd@C₈₂(OH)_n均采用腹腔给药的方式，Gd@C₈₂(OH)_n是以腹腔注射液的形式给药(将实施例1制备的Gd@C₈₂(OH)_n溶解在0.9％的生理盐水中获得Gd@C₈₂(OH)_n浓度10mg/ml的腹腔注射液)，各组小鼠的周龄进入第10周开始给药，每天给药1次，Gd@C₈₂(OH)_n给药剂量为10mg/kg/d，连续给药两周。

在以上4组小鼠治疗两周后进行胰岛素抵抗实验：禁食3h后开始实验，在实验起始即0min时测空腹血糖，然后为A-D组小鼠腹腔注射胰岛素1U/kg，并分别在15，30，60min测血糖。

完成胰岛素抵抗实验并让小鼠恢复2天之后解剖各组小鼠。

取A-C组的50-100mg肌肉组织(取肌肉组织是因为研究胰岛素抵抗关注的主要相关器官是胰岛素起作用的器官，而不是分泌胰岛素的器官)，首先加Triol进行研磨，离心，加氯仿/Triol振荡，离心，取水相加入异丙醇/Trizol振摇，离心，洗涤得到提取的mRNA。对mRNA进行反转录成cDNA，最后进行PCR扩增，从而检测PI3K和AKT的mRNA表达水平。结果如图14和图15所示。

另取A-D组的50-100mg的肌肉组织加1ml裂解液，匀浆，离心，去上层清液，定量，电泳，取胶，转膜，封闭，结合一抗和二抗，洗涤，显影成像。得到AKT的WB条带，结果如图16所示(其中AKT条带有拖尾现象)。

(2)调节PI3K和/或AKT的含量的实验结果

如图14所示，图14为肌肉中PI3K的mRNA表达水平(这里的mRNA表达水平即相对mRNA表达量，相对mRNA表达量＝各组小鼠的PI3K mRNA表达量/空白组小鼠的PI3K mRNA表达量)。患有糖尿病但未进行富勒烯治疗的模型组小鼠的PI3K mRNA含量相比于空白组小鼠的PI3K mRNA含量下降，但经过水溶性富勒烯结构治疗后的小鼠的PI3K mRNA的含量增加，说明水溶性富勒烯结构能够促进PI3K mRNA的生成，从而促进PI3K的生成，并进一步调节PI3K相关的下游信号，以及信号产生的生理变化。

图15为肌肉中AKT的mRNA表达水平(这里的mRNA表达水平即相对mRNA表达量，相对mRNA表达量＝各组小鼠的AKT mRNA表达量/空白组小鼠的AKT mRNA表达量)。与空白组相比，患有糖尿病但未进行Gd@C₈₂(OH)_n治疗的模型组db/db小鼠存在胰岛素抵抗，其胰岛素信号通路表达异常，AKT mRNA含量明显下降，但经过Gd@C₈₂(OH)_n治疗后的小鼠的AKT mRNA含量明显改善，与空白组相当。图16为小鼠肌肉AKT和磷酸化AKT(pAKT)的蛋白表达水平，由蛋白条带可以明显看出与空白组相比，模型组db/db小鼠的AKT和pAKT的含量都是降低的，但经过水溶性富勒烯结构治疗后AKT和pAKT的表达都有所增加。而抑制剂组的小鼠经AKT抑制剂处理后，AKT和pAKT的含量降低。图15和图16证明水溶性富勒烯结构可以促进AKT的表达；图17显示了pAKT/AKT的相对表达值(各组小鼠的pAKT/AKT相对表达值＝各组小鼠的pAKT/AKT值÷空白组小鼠的pAKT/AKT值)，其中治疗组小鼠的肌肉中pAKT/AKT的比值提高，说明磷酸化的AKT含量增加，说明水溶性富勒烯结构能够促进AKT的激活，而服用了AKT抑制剂的小鼠，其肌肉中pAKT/AKT的比值没有显著提高。

(3)水溶性的内嵌金属富勒烯Gd@C₈₂(OH)_n改善胰岛素抵抗。

如图18为胰岛素耐受实验中血糖的变化。经Gd@C₈₂(OH)_n治疗后的糖尿病小鼠注射胰岛素后血糖浓度下降，胰岛素抵抗明显改善，但是服用了AKT抑制剂的小鼠注射胰岛素后，血糖并没有明显下降，结合图16和图17中抑制剂组小鼠肌肉中pAKT和AKT的表达下降，说明水溶性富勒烯结构是通过促进AKT的激活来改善胰岛素耐受的。

实施例8、水溶性内嵌金属富勒烯Gd@C₈₂(OH)_n活化AMPK

AMPK(AMP-activated protein kinase)即AMP依赖的蛋白激酶。AMPK是一个异源三聚体蛋白，由α、β和γ三个亚基组成，其中：α亚基起催化作用，含有一个典型的丝、苏氨酸蛋白激酶的催化区域，其中的苏氨酸172位点及其磷酸化对AMPK活性的调节起重要作用，而β和γ亚基在维持三聚体稳定性和作用底物特异性方面起重要作用，所有亚基在真核生物中具有高度保留性。

AMPK是生物能量代谢调节的关键因子，是细胞能量的感应器及能量代谢平衡调节器。该激酶能够通过感受细胞能量状态来维持真核细胞的ATP生成和消耗的平衡，能够有助于纠正代谢紊乱，使细胞代谢趋于生理平衡。乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和羟甲基戊二酸单酰CoA还原酶(HMGP)分别是脂肪酸和胆固醇合成的关键酶，均是AMPK的作用靶点。活化的AMPK可以使两者磷酸化失活，从而抑制脂肪的生成。同时，AMPK能够诱导葡萄糖转运体4向浆膜转移，能够通过磷酸化转录因子开启葡萄糖转运体4的表达，并且，肝细胞中激活AMPK不仅可以抑制糖异生减少糖的合成，还通过磷酸化调节糖原的合成。总之，AMPK可以调节糖代谢和脂质代谢，是治疗代谢疾病如肥胖，糖尿病等的靶点。除了能量调节器之外，AMPK也参与多个细胞机制的调节。AMPK的活化也可以调节细胞分化，细胞自噬，炎症反应，老化及分化等。研究已经发现，许多AMPK激活剂有调节糖脂代谢，治疗糖尿病，抵抗炎症等功能。

本发明以db糖尿病小鼠为模型，以水溶性内嵌金属富勒烯Gd@C₈₂(OH)_n为例，研究了水溶性富勒烯结构在调节AMPK表达和AMPK活化中的作用，以及在治疗AMPK调节的疾病中的应用。

(1)实验方法

实验动物为db/db糖尿病小鼠，购自南京动物模式中心，引自美国杰克逊实验室。此小鼠是广泛应用的2型糖尿病动物模型，其为瘦素受体基因缺陷导致肥胖后发展为糖尿病的小鼠模型，瘦素受体(leptinreceptor，Lepr)的自发性突变会引起多食、消渴、多尿等症状。db/db小鼠在4～8周出现高糖血症。

实验动物分组：实验动物随机分为4组，每组6只；A组取6只db/m无糖尿病的小鼠作为空白组，其给药治疗为施用与C组所用药物等体积的生理盐水；B组取6只db/db小鼠作为模型组，其给药治疗为施用与C组所用药物等体积的生理盐水；C组取6只db/db小鼠作为Gd@C₈₂(OH)_n实验组，其给药治疗为施用按照实施例1的方法制备的Gd@C₈₂(OH)_n；D组为抑制剂组，抑制剂组小鼠除了按照Gd@C₈₂(OH)_n实验组小鼠施用Gd@C₈₂(OH)_n的方法施用Gd@C₈₂(OH)_n以外，在第14天测血糖前口服给药AMPK抑制剂Compound C，30mg/kg/次。A-D组均采用腹腔给药的方式，Gd@C₈₂(OH)_n是以腹腔注射液的形式给药(将实施例1制备的Gd@C₈₂(OH)_n溶解在0.9％的生理盐水中获得10mg/ml的腹腔注射液)，各组小鼠的周龄进入第10周开始给药，每天给药1次，Gd@C₈₂(OH)_n给药剂量为10mg/kg/d，连续给药两周。

(2)血糖检测

开始给药前为空白组、模型组和Gd@C₈₂(OH)_n实验组小鼠测血糖，为初始0d血糖，然后开始给药治疗，每天下午给药1次，连续给药两周，之后的3d，6d，9d，14d的上午测血糖浓度。如图19所示，在治疗过程中，实验组的血糖在第6天时已经显示出降低的趋势，到第9天实验组的血糖已显著降低，说明水溶性富勒烯结构能够有效降低血糖，治疗糖尿病。

在Gd@C₈₂(OH)_n起作用后，考察AMPK抑制剂对Gd@C₈₂(OH)_n降血糖产生的影响。仅检测抑制剂组第14天的血糖，在第14天测血糖之前为抑制剂小鼠口服AMPK抑制剂CompoundC，测得血糖结果如图20所示，与治疗组的小鼠相比，口服AMPK抑制剂Compound C后抑制剂组的小鼠的血糖有所回升，说明水溶性富勒烯结构治疗糖尿病与AMPK的表达激活相关。

(3)AMPK检测

治疗2周后的各组小鼠处死，并且为了考察AMPK抑制剂Compound C的影响，在解剖前再次向抑制剂组的小鼠口服给药AMPK抑制剂Compound C，30mg/kg/次。

取A-C组的肝脏进行Q-PCR测试，检测AMPK mRNA的表达。取50-100mg肝脏组织，首先加Triol进行研磨，离心，加氯仿/Triol振荡，离心，取水相加入异丙醇/Trizol振摇，离心，洗涤得到提取的mRNA。对mRNA进行反转录成cDNA，最后进行PCR扩增。

检测AMPK的相对mRNA表达水平(将空白组的AMPK mRNA表达水平设为1，其他组的相对mRNA表达水平＝其他组的AMPK mRNA表达水平÷空白组的AMPK mRNA表达水平)，结果如图21所示。经过Gd@C₈₂(OH)_n治疗后的实验组小鼠的肝脏的AMPK mRNA表达明显比未经治疗的模型组小鼠高，说明水溶性富勒烯结构能促进AMPK mRNA的表达。

取A-D组的肝脏进行WB测试，检测AMPK和pAMPK(pAMPK是指172位苏氨酸磷酸化的AMPK)的表达。另取50-100mg的组织加1ml裂解液，匀浆，离心，去上层清液，定量，电泳，取胶，转膜，封闭，结合一抗和二抗，洗涤，显影成像。得到AMPK和pAMPK的WB条带。

图22为AMPK和172位苏氨酸磷酸化AMPK蛋白表达的分析示意图。从图中可以看出经过Gd@C₈₂(OH)_n治疗后的实验组小鼠的肝脏的AMPK和磷酸化AMPK的条带明显比未经治疗的模型组小鼠粗且颜色深，说明水溶性富勒烯结构能促进AMPK和磷酸化AMPK的表达。由图23的定量pAMPK/AMPK值可以看出经过水溶性富勒烯结构治疗后的小鼠肝脏中的pAMPK/AMPK比值增高，说明水溶性富勒烯结构能够激活AMPK。而加入AMPK抑制剂后，磷酸化AMPK含量和pAMPK/AMPK比值均降低，与抑制剂小鼠的血糖回升相对应，说明水溶性富勒烯结构治疗糖尿病与AMPK的表达和磷酸化激活相关。

(4)炎症因子检测

治疗后的各组小鼠，眼眶取血，1500rpm，15min，离心得到血清，用Elisa的方法测炎症干扰素(IFNα)和白介素-6(IL-6)的含量。结果如下表，显示治疗后的小鼠的炎症因子明显降低。

分组	干扰素(IFNα)(ng/L)	白介素-6(ng/L)
			空白组	40.25±3.29	35.23±3.56
模型组	58.32±2.78	50.52±4.15
			治疗组	43.17±4.19	38.57±5.28

实施例9、水溶性内嵌金属富勒烯Gd@C₈₂(OH)_n调节糖酵解和糖异生作用

糖异生和糖酵解均是调节人体内血糖的重要生理过程，其中：糖异生是生物体内由简单的非糖前体转变为糖的过程；糖酵解是将葡萄糖和糖原降解为丙酮酸并释放能量的过程；糖异生基本是糖酵解过程的可逆过程。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酯酶(G-6Pase)为糖异生过程中的主要限速酶，葡萄糖激酶(Gck)是糖酵解过程的主要限速酶。

本发明以db糖尿病小鼠为模型，以水溶性内嵌金属富勒烯Gd@C₈₂(OH)_n为例，研究水溶性富勒烯结构对糖异生和糖酵解过程的调节作用以及降糖作用。

(1)实验方法

实验动物为db/db糖尿病小鼠，此小鼠为瘦素受体基因缺陷导致肥胖后发展为糖尿病的二型糖尿病小鼠。

实验动物分组：实验动物随机分为3组，每组6只；A组取6只db/m无糖尿病的小鼠作为空白组，其给药治疗为施用与C组所用药物等体积的生理盐水，B组取6只db/db小鼠作为模型组，其给药治疗为施用与C组所用药物等体积的生理盐水；C组取6只db/db小鼠作为Gd@C₈₂(OH)_n给药实验组，其给药治疗为施用按照实施例1的方法制备的Gd@C₈₂(OH)_n。A-C组均采用腹腔给药的方式，第10周开始给药，每天给药1次，Gd@C₈₂(OH)_n给药剂量为10mg/kg/d，连续给药两周。

14d时处死小鼠，取肝脏于-80℃冻存，备Q-PCR测试用。首先加Triol进行研磨，离心，加氯仿/Triol振荡，离心，取水相加入异丙醇/Trizol振摇，离心，洗涤得到提取的mRNA。对mRNA进行反转录成cDNA，最后进行PCR扩增。进行糖代谢酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶，葡萄糖-6-磷酸酯酶，葡萄糖激酶的含量测定。

(2)实验结果

图24为葡萄糖-6-磷酸酯酶的mRNA表达的相对水平。由结此果得出，水溶性富勒烯结构治疗后的糖尿病小鼠肝脏的葡萄糖-6-磷酸酯酶的含量降低了40％左右，说明糖异生过程的减少，血糖的降低。

图25为磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的mRNA表达的相对水平。糖尿病小鼠的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶略微增加，经水溶性富勒烯结构治疗后的糖尿病小鼠肝脏的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的含量降低，说明糖异生过程减少，血糖的降低。

图26为葡萄糖激酶的mRNA表达的相对水平，经水溶性富勒烯结构治疗后的小鼠此种酶表达增加，说明糖酵解过程增加，说明富勒烯能够通过增加糖酵解来调节血糖水平，治疗糖尿病。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (14)

1.一种水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、所述水溶性的富勒烯和所述水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯或以上三者的可药用的盐在制备治疗糖尿病及其并发症的药物中的应用。

2.一种治疗糖尿病及其并发症的药物组合物，其特征在于：包括至少一种选自下组的有效成分：水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、所述水溶性的富勒烯和所述水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯、以上三者的可药用的盐，所述药物组合物还包括可药用的载体、可药用的稀释剂和可药用的赋形剂中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的应用或权利要求2所述的药物组合物，其特征在于：所述水溶性的富勒烯选自下组中的一种或多种：(1)碳笼外表面修饰有亲水基团的富勒烯；(2)碳笼外表面被亲水性生物小分子包裹的富勒烯；(3)被具有生物相容性的载体材料负载的富勒烯；(4)自组装形成的水溶性超分子体系富勒烯；所述水溶性的内嵌金属富勒烯选自下组中的一种或多种：(1)碳笼外表面修饰有亲水基团的内嵌金属富勒烯；(2)碳笼外表面被亲水性生物小分子包裹的内嵌金属富勒烯；(3)被具有生物相容性的载体材料负载的内嵌金属富勒烯；(4)自组装形成的水溶性超分子体系内嵌金属富勒烯。

4.根据权利要求3所述的应用或权利要求3所述的药物组合物，其特征在于：所述亲水基团包括羟基、羧基、巯基和氨基中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的应用或权利要求2所述的药物组合物，其特征在于：所述水溶性的富勒烯是通过对原料富勒烯进行水溶性改性获得的；所述水溶性的内嵌金属富勒烯是通过对原料内嵌金属富勒烯进行水溶性改性获得的。

6.根据权利要求5所述的应用或权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：所述原料富勒烯包括一种或多种通式为C_2m的由碳原子组成的笼状结构，30≤m≤60。

7.根据权利要求5所述的应用或权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：所述原料内嵌金属富勒烯包括M@C_2n、M₂@C_2n、MA@C_2n、M₃N@C_2n、M₂C₂@C_2n、M₂S@C_2n、M₂O@C_2n和M_xA_3-xN@C_2n中的一种或多种，其中：M、A均代表金属元素且M、A均选自镧系金属元素、Sc和Y中的任意一种，30≤n≤60；0≤x≤3；N代表氮元素，C代表碳元素，S代表硫元素，镧系金属元素包括La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu。

8.根据权利要求5所述的应用或权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：所述水溶性改性为将原料富勒烯和原料内嵌金属富勒烯中的至少一种与双氧水和碱溶液混合并进行反应，再洗涤透析。

9.根据权利要求1所述的应用或权利要求2所述的药物组合物，其特征在于：所述糖尿病为一型糖尿病或二型糖尿病，尤其为二型糖尿病。

10.根据权利要求1所述的应用或权利要求2所述的药物组合物，其特征在于：所述并发症包括糖尿病心血管并发症、糖尿病性脑血管病、糖尿病肾病、糖尿病眼部并发症、糖尿病足和糖尿病神经病变。

11.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物为腹腔注射液。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于：所述腹腔注射液中有效成分的浓度为0.01-50mg/ml，可选的为0.5-10mg/ml；所述腹腔注射液包括可药用的载体，所述可药用的载体包括水、生理盐水、PBS缓冲液和Tris-HCl溶液中的至少一种。

13.根据权利要求3所述的应用或权利要求3所述的药物组合物，其特征在于：

所述水溶性的富勒烯的通式为C_2a(OH)_b；20≤a≤60，可选的30≤a≤60，进一步可选的a为30或35或42；0<b≤50，可选的0<b≤30，10≤b≤30，20≤b≤30，进一步可选的b＝13、20、22、24或26；

所述水溶性的内嵌金属富勒烯的通式为metallofullerene-(OH)_c；metallofullerene代表内嵌金属富勒烯本体，0<c≤50，可选的0<c≤30，10≤c≤30，20≤c≤30，进一步可选的c＝13、20、22、24或26。

14.根据权利要求3所述的应用或权利要求3所述的药物组合物，其特征在于：水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、所述水溶性的富勒烯和所述水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯或以上三者的可药用的盐作为PI3K调节剂、AKT调节剂、AMPK调节剂、糖异生调节剂和/或糖酵解调节剂通过以下方式中的至少一种来治疗糖尿病：

(1)调节PI3K、AKT和/或AMPK的表达、激活；

(2)调节糖异生和/或糖酵解过程中的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶含量、葡萄糖-6-磷酸酯酶含量和/或葡萄糖激酶的含量。