CN108753902A - 一种经戊二醛处理后的动物源性生物材料在体外细胞中的验证方法 - Google Patents

一种经戊二醛处理后的动物源性生物材料在体外细胞中的验证方法 Download PDF

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Abstract

一种经戊二醛处理后的动物源性生物材料在体外细胞中的验证方法，包括如下步骤：步骤(1)、将动物源性生物材料置于戊二醛消毒剂中进行浸泡；步骤(2)、将经过浸泡的动物源性生物材料取出沥干，加入含有中和剂的培养基，剪碎、匀浆，从匀浆悬液中取样品；步骤(3)、将样品稀释后，加到种好指示细胞的96孔培养板上，再将培养板置于培养箱中进行培养，在显微镜下观察细胞生长状况。本发明操作简单方便，成本低；由于来源于动物的生物材料均需要进行病毒灭活验证，而戊二醛本身又是一种良好的病毒灭活剂，本发明中的中和剂能够中和过量的戊二醛，从而本发明在病毒灭活工艺验证中具有良好的应用前景。

Description

一种经戊二醛处理后的动物源性生物材料在体外细胞中的验 证方法
技术领域
本发明涉及一种经戊二醛处理后的动物源性生物材料在体外细胞中的验证方法。
背景技术
由哺乳动物细胞外基质构成的生物源性材料，因其具有良好的生物相容性而被广泛用于外科的创伤修复、组织重建和组织工程的支架材料等。由动物源性生物材料构成的医疗器械称动物源性医疗器械。医疗器械中来源于动物的材料范围和种类非常广泛，适用于所有采用无生命的动物组织制成的或取材于动物组织的医疗器械(体外诊断用医疗器械除外)。这些材料可以构成器械的主要部件(如牛/猪心脏瓣膜、牛心包、羊肠缝合线、用于口腔科或整形外科的骨替代物、壳聚糖手术防粘连膜等)、产品的涂层或者浸渗剂(如肝素、明胶、胶原)，或用于器械制造过程中的辅助材料(如牛脂、牛血清白蛋白等)以及器械制造过程所使用的加工助剂(如胎牛血清、酶、培养基及油酸盐和硬脂酸盐等动物脂衍生物)。
来源于动物组织富含胶原蛋白的材料(如心包膜、皮肤等)，经脱细胞处理后具有抗原性小、可降解及生物相容性好等优点，是一种理想的异种移植生物材料，但由于该类生物材料极易降解，需经过交联处理，以提高其力学性能和抗酶解能力。戊二醛是一种经典交联剂，同时又属高效消毒剂，能够杀灭细菌、真菌、细菌芽孢、病毒等微生物。但戊二醛具有较强的细胞毒性，因此需用中和剂进行中和。目前常用的中和剂有硫代硫酸钠、亚硫酸钠等。其中硫代硫酸钠和亚硫酸钠浓度高的情况下对指示细胞生长也有影响，与戊二醛的配比也比较繁琐，易造成中和效果差等问题。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种能够减小戊二醛细胞毒性的经戊二醛处理后的动物源性生物材料在体外细胞中的验证方法。
一种经戊二醛处理后的动物源性生物材料在体外细胞中的验证方法，包括如下步骤：
步骤(1)、将所述的动物源性生物材料置于戊二醛消毒剂中进行浸泡；
步骤(2)、将经过浸泡的所述的动物源性生物材料取出沥干，加入含有中和剂的培养基，剪碎、匀浆，从匀浆悬液中取样品；
步骤(3)、将所述的样品稀释后，加到种好指示细胞的培养板上，再将所述的培养板置于培养箱中进行培养，在显微镜下观察细胞生长状况。
本发明中，培养基的组分为：氯化钙200g/L、氯化钾400g/L、无水硫酸镁97.67g/L、氯化钠6800g/L、磷酸氢钠140g/L、L-精氨酸126.98g/L、L-胱氨酸31.28g/L、L-谷氨酸292g/L、L-组氨酸41.88g/L、L-异亮氨酸52g/L、L-亮氨酸52g/L、L-赖氨酸72.47g/L、L-蛋氨酸15g/L、L-苯基丙氨酸32g/L、L-苏氨酸48g/L、L-色氨酸10g/L、L-二水合络氨酸钠51.9g/L、L-缬氨酸46g/L、泛酸钙1g/L、氯化胆碱1g/L、维生素B 1g/L、肌醇2g/L、烟酰胺1g/L、维生素B6 1g/L、维生素B12 0.1g/L、维生素B1 1g/L、D-葡萄糖1000g/L、酚红11g/L、碳酸氢钠2200g/L，以及2％胎牛血清。
本发明中，将所述的生物材料加到含有中和剂的培养基中，中和剂用于中和生物材料表面以及内部残留的戊二醛，从而减少戊二醛对指示细胞的毒性，为后续进行的病毒灭活验证试验确定检测限。
本发明中，将所述的生物材料剪碎匀浆，用于释放生物材料内部残留的戊二醛消毒剂，进一步与中和剂中和，从而进一步减小残留的戊二醛消毒剂对细胞的毒性。
具体地，所述的动物包括牛、猪、马；所述的动物源性生物材料为选自心包膜、主动脉瓣膜、颈静脉带瓣管道、真皮、肠系膜中的一种。
具体地，所述的浸泡时间为1h-7d；优选地，所述的浸泡时间为1h-2d。
具体地，所述的戊二醛消毒剂为戊二醛与磷酸缓冲液的混合溶液，所述的戊二醛占所述的戊二醛消毒剂的质量浓度为0.5-0.6％；优选地，所述的戊二醛消毒剂为戊二醛与磷酸缓冲液的混合溶液，所述的戊二醛占所述的戊二醛消毒剂的质量浓度为0.5-0.55％。
本发明中，戊二醛消毒剂是利用质量浓度为24-26％的戊二醛与磷酸缓冲液配制而成的混合溶液。
优选地，所述的磷酸缓冲液的PH值为7.0-7.4。
具体地，所述的中和剂为甘氨酸与精氨酸的混合水溶液。
优选地，所述的混合水溶液中所述的甘氨酸的质量浓度为5-10％，所述的精氨酸的质量浓度为2-5％。
具体地，所述的中和剂的投料体积与所述的培养基的体积比为1：10-20；优选地，所述的中和剂的投料体积与所述的培养基的体积比为1：10-15。
具体地，所述的戊二醛消毒剂的投料体积与所述的中和剂的投料体积比为1:1-10；优选地，所述的戊二醛消毒剂的投料体积与所述的中和剂的投料体积比为1：5-10。
具体地，控制所述的匀浆的转速为10000～20000转/分钟，匀浆的时间为20-40s，从所述的匀浆悬液中取样品若干份，每份所述的样品的体积为0.5-2mL；优选的，控制所述的匀浆的转速为10000～20000转/分钟，匀浆的时间为20-40s，从所述的匀浆悬液中取样品若干份，每份所述的样品的体积为1-2mL。
具体地，所述的指示细胞为Vero细胞、ST细胞或LLC-MK2细胞中的一种或多种，所述的培养箱的培养条件为37℃、5％CO2。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明的经戊二醛处理后的动物源性生物材料在体外细胞中的验证方法，操作简单方便，成本低；由于来源于动物的生物材料均需要进行病毒灭活验证，而戊二醛本身又是一种良好的病毒灭活剂，本发明中的中和剂能够中和过量的戊二醛，从而本发明在病毒灭活工艺验证中具有良好的应用前景。
具体实施方式
提供以下实施例是为了让本领域技术人员更好地理解、实施本发明，并非意在限制本发明的范围。
实施例1：
一种经戊二醛处理后的动物源性生物材料在体外细胞中的验证方法，包括如下步骤：
步骤(1)、将牛心包材料置于50mL的戊二醛消毒剂中，戊二醛消毒剂由质量浓度为24％的戊二醛水溶液与PH值为7.2的磷酸缓冲液按照体积比为1:39配制而成，戊二醛消毒剂中的戊二醛的质量浓度为0.6％，然后置于2～8℃冰箱浸泡1d；
步骤(2)、取出经过浸泡的牛心包材料，悬空沥干至无液滴滴下后，加入10mL含有中和剂的培养基中，培养基中甘氨酸的质量浓度为0.6％、精氨酸的质量浓度为0.2％；
步骤(3)、将牛心包膜材料剪碎，控制匀浆的转速为20000转/分钟，匀浆的时间为30s，从匀浆悬液中取样品4份，每份1mL；
步骤(4)、将上述样品分别稀释10倍、20倍、50倍、100倍后接种到有ST细胞和LLC-MK2细胞的96孔培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，倒置显微镜下观察细胞生长状况。
实施例2：
一种经戊二醛处理后的动物源性生物材料在体外细胞中的验证方法，包括如下步骤：
步骤(1)、将猪真皮材料置于30mL的戊二醛消毒剂中于20℃恒温培养箱中浸泡16h，戊二醛消毒剂由质量浓度为24％的戊二醛水溶液与PH值为7.2的磷酸缓冲液按照体积比为1:49配制而成，戊二醛消毒剂中的戊二醛的质量浓度为0.5％；
步骤(2)、取出经过浸泡的猪真皮，悬空沥干至无液滴滴下后，加入10mL含有中和剂的培养基中，培养基中甘氨酸的质量浓度为0.5％，培养基中精氨酸的质量浓度为0.2％；
步骤(3)、将猪真皮材料剪碎，控制匀浆的转速为20000转/分钟，匀浆的时间为40s，从匀浆悬液中取样品4份，每份1mL；
步骤(4)、将样品分别稀释10倍、20倍、50倍、100倍后接种到有Vero细胞和ST细胞的96孔培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，倒置显微镜下观察细胞生长状况。
实施例3：
一种经戊二醛处理后的动物源性生物材料在体外细胞中的验证方法，包括如下步骤：
步骤(1)、将牛颈静脉带瓣管道材料置于50mL的戊二醛消毒剂中浸泡2d，戊二醛消毒剂由质量浓度为24％的戊二醛水溶液与PH值为7.2的磷酸缓冲液按照体积比为1:39配制而成，戊二醛消毒剂中的戊二醛的质量浓度为0.625％；
步骤(2)、取出经过浸泡的牛颈静脉带瓣管道材料，悬空沥干至无液滴滴下后，加入10mL含有中和剂的培养基中，培养基中甘氨酸的质量浓度为0.6％，培养基中精氨酸的质量浓度为0.3％；
步骤(3)、将牛颈静脉带瓣管道材料剪碎，控制匀浆的转速为20000转/分钟，匀浆的时间为40s，从匀浆悬液中取样品4份，每份1mL；
步骤(4)、将样品分别稀释10倍、20倍、50倍、100倍后接种到有Vero细胞和LLC-MK2细胞的96孔培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，倒置显微镜下观察细胞生长状况。
实施例4：
一种经戊二醛处理后的动物源性生物材料在体外细胞中的验证方法，包括如下步骤：
步骤(1)、将猪主动瓣膜材料置于30mL的戊二醛消毒剂中浸泡6h，戊二醛消毒剂由质量浓度为25％的戊二醛水溶液与PH值为7.2的磷酸缓冲液按照体积比为1:49配制而成，戊二醛消毒剂中的戊二醛的质量浓度为0.5％；
步骤(2)、取出经过浸泡的猪主动瓣膜材料，悬空沥干至无液滴滴下后，加入10mL含有中和剂的培养基中，培养基中甘氨酸的质量浓度为0.5％，培养基中精氨酸的质量浓度为0.3％；
步骤(3)、将猪主动瓣膜材料剪碎，控制匀浆的转速为20000转/分钟，匀浆的时间为30s，从匀浆悬液中取样品4份，每份2mL；
步骤(4)、将样品分别稀释10倍、20倍、50倍、100倍后接种到有Vero细胞和ST细胞的96孔培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，倒置显微镜下观察细胞生长状况。
对比例1：
步骤(1)、将牛心包膜材料置于50mL的戊二醛消毒剂中浸泡1d，戊二醛消毒剂由质量浓度为24％的戊二醛水溶液与PH值为7.2的磷酸缓冲液按照体积比为1:39配制而成，戊二醛消毒剂中的戊二醛的质量浓度为0.6％；
步骤(2)、取出经过浸泡的牛心包膜材料，悬空沥干至无液滴滴下，加入10mL培养基；
步骤(3)、将牛心包膜材料剪碎，控制匀浆的转速为20000转/分钟，匀浆的时间为40s，从匀浆悬液中取样品6份，每份1mL；
步骤(4)、将样品分别稀释10倍、20倍、50倍、100倍后接种到有Vero细胞、ST细胞和LLC-MK2细胞的96孔培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，倒置显微镜下观察细胞生长状况。
对比例2：
步骤(1)、将牛心包膜材料置于50mL培养基中浸泡1d，加入10mL含有中和剂的培养基中，培养基中甘氨酸的质量浓度为0.6％，培养基中精氨酸的质量浓度为0.2％；
步骤(2)、取出经过浸泡的牛心包膜材料，悬空沥干至无液滴滴下，加入10mL培养基；
步骤(3)、将牛心包膜材料剪碎，控制匀浆的转速为20000转/分钟，匀浆的时间为30s，从上清悬液中取样品4份，每份1mL；
步骤(3)、将样品分别稀释10倍、20倍、50倍、100倍后接种到有Vero细胞、ST细胞和LLC-MK2细胞的96孔培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，倒置显微镜下观察细胞生长状况。
将以上实施例1-4，对比例1-2的实验细胞形态验证中和效果，检测数据列在如下表格。
表1

Claims (10)

1.一种经戊二醛处理后的动物源性生物材料在体外细胞中的验证方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤(1)、将所述的动物源性生物材料置于戊二醛消毒剂中进行浸泡；
步骤(2)、将经过浸泡的所述的动物源性生物材料取出沥干，加入含有中和剂的培养基，剪碎、匀浆，从匀浆悬液中取样品；
步骤(3)、将所述的样品稀释后，加到种好指示细胞的培养板上，再将所述的培养板置于培养箱中进行培养，在显微镜下观察细胞生长状况。
2.根据权利要求1所述的验证方法，其特征在于：所述的动物包括牛、猪、马；所述的动物源性生物材料为选自心包膜、主动脉瓣膜、颈静脉带瓣管道、真皮、肠系膜中的一种，所述的浸泡时间为1h-7d。
3.根据权利要求1所述的验证方法，其特征在于：所述的戊二醛消毒剂为戊二醛与磷酸缓冲液的混合溶液，所述的戊二醛占所述的戊二醛消毒剂的质量浓度为0.5-0.6％。
4.根据权利要求3所述的验证方法，其特征在于：所述的磷酸缓冲液的PH值为7.0-7.4。
5.根据权利要求1所述的验证方法，其特征在于：所述的中和剂为甘氨酸与精氨酸的混合水溶液。
6.根据权利要求5所述的验证方法，其特征在于：所述的混合水溶液中所述的甘氨酸的质量浓度为5-10％，所述的精氨酸的质量浓度为2-5％。
7.根据权利要求1所述的验证方法，其特征在于：所述的中和剂的投料体积与所述的培养基的体积比为1:10-20。
8.根据权利要求1所述的验证方法，其特征在于：所述的戊二醛消毒剂的投料体积与所述的中和剂的投料体积比为1:1-10。
9.根据权利要求1所述的验证方法，其特征在于：控制所述的匀浆的转速为10000～20000转/分钟，匀浆的时间为20-40s，从所述的匀浆悬液中取样品若干份，每份所述的样品的体积为0.5-2mL。
10.根据权利要求1所述的验证方法，其特征在于：所述的指示细胞为Vero细胞、ST细胞或LLC-MK2细胞中的一种或多种，所述的培养箱的培养条件为37℃、5％CO2。
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