CN108753786A - 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子a36及其筛选方法和应用 - Google Patents

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子a36及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A36及其筛选方法和应用，所述适配子A36的序列为：5’‑AGCAGCACAGAGGTCAGATGCCCATATGCTACTTTGCACACATCCTGGATAGGCT CCTATGCGTGCTACCGTGAA‑3’；该核酸适配子A36能高亲和力、高特异性地与NGAL结合，其中Kd值为43.59nM，其在AKI诊断方面具有应用前景，可运用于分离、纯化中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白中、制备中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的检测试剂中以及研制治疗中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白相关疾病药物中。

Description

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A36及其筛 选方法和应用
技术领域
本发明涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A36及其筛选方法和应用。
背景技术
急性肾损伤(Acute Kidney Injury，AKI)是一种肾小球滤过率急剧下降所导致的临床常见疾病，临床表现包括血清尿素氮和血清肌酐水平突然并持续升高，同时伴有盐水失衡。AKI是各种严峻条件下的一种最为常见的综合症，住院患者中的发病率为5％-7％，而危重患者中高达30％，并且患有AKI的危重患者的死亡率高达50％。此外，AKI与不良转归密切相关，包括死亡率增加、住院时间延长、危重患者的机械通气持续时间延长，及发展为慢性肾脏疾病风险增加等。
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophil gelatinase associatedlipocalin，NGAL)，又名脂质运载蛋白2、噬铁蛋白或癌基因24p3，分子量25kD，在体内以多种形式存在，单体、46kD的同源二聚体、与金属蛋白酶9(Matrix Metalloproteinase 9，MMP-9)结合形成的135kD的异源二聚体。NGAL在各种损伤后合成增加，尤其是肾脏疾病，被认为是最有前景的肾脏内科临床标志物。研究表明NGAL与AKI密切相关，在AKI患者的血清和尿液中NGAL水平显著升高，并且升高程度与肾脏损伤严重程度相关，因此NGAL是早期诊断AKI 的强有力的指标，在各类疾病诱发的AKI的早期诊断、预测及治疗后肾功能恢复情况的监测中有着明显的优势和临床价值，具有巨大的应用前景，运用好 NGAL检测，将大大降低AKI发病率和死亡率。
核酸适配子是一类具有特殊的三维立体结构(发卡，假结，凸环，G-四聚体等)，可以高特异性高亲和性结合靶标的单链DNA(Single stranded DNA， ssDNA)或RNA。核酸适配子通过指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment，SELEX)筛选获得，核酸适配子具有稳定性好、生产周期短、费用低、可化学合成大量生产、进行各种功能化修饰等优点，因此，核酸适配子在检测诊断方面具有广阔的前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高亲和力、高特异性的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A36及其筛选方法和应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A36，它的序列如下所示：
AGCAGCACAG AGGTCAGATG CCCATATGCT ACTTTGCACA 40
CATCCTGGAT AGGCTCCTAT GCGTGCTACC GTGAA 75；
在25℃，0.1M Na+，0.001M Mg2+条件下其二级结构为茎环结构，其分子结构如下：
所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A36的筛选方法，基于核酸适配子的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以 NGAL为靶标，通过NGAL羧基磁珠从ssDNA库中筛选得到与NGAL特异性结合的核酸适配子。
所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A36的应用，在分离、纯化中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白中的应用。
所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A36的应用，在制备中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的检测试剂中的应用。
所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A36的应用，在研制治疗中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白相关疾病药物中的应用。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
1.该核酸适配子A36无毒性，分子量小，渗透性好，易于合成与标记。
2.该核酸适配子A36的合成成本较抗体制备的成本低，且周期短，重现性好。
3.该核酸适配子A36能高亲和力、高特异性地与NGAL结合，其中Kd值为43.59nM，其在AKI诊断方面具有应用前景。
4.该核酸适配子A36可运用于分离、纯化中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白中、制备中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的检测试剂中以及研制治疗中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白相关疾病药物中，具有广阔的应用前景和重要的科学、社会、经济价值。
附图说明
图1为核酸适配子A36的二级结构模拟图。
图2为qPCR法比较候选适配子与NGAL结合量结果图。
图3为核酸适配子A36的特异性分析结果图。
图4为核酸适配子A36的亲和力检测结果图。
图5为核酸适配子A36的SELEX筛选策略图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A36，它的序列如下所示：
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCCCATATGCTACTTTGCACACATCCT GGATAGGCTCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’；
如图1所示，核酸适配子A36在25℃，0.1M Na+，0.001M Mg2+条件下其二级结构为茎环结构；
所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A36，对所述核酸适配子A36的5'端或3'端进行FAM、Biotin或氨基化学修饰。
所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A36的筛选方法，基于核酸适配子的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以 NGAL为靶标，通过NGAL羧基磁珠从ssDNA库中筛选得到与NGAL特异性结合的核酸适配子。
所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A36的筛选方法，它包括以下步骤(核酸适配子A36的SELEX筛选策略图见图5)：
①包被NGAL的磁珠与ssDNA库孵育进行SELEX筛选，并从第三轮开始在每轮筛选之前加入裸磁珠进行前反筛，以此去除与磁珠非特异结合的ssDNA；
②孵育洗涤后的磁珠进行热洗脱，洗脱下来的ssDNA作为模板，加入带荧光修饰的上游引物P3与带PolyA尾的下游引物P4进行PCR扩增；
③PCR扩增产物用正丁醇浓缩后经10％7M尿素变性PAGE胶电泳，使得带荧光修饰的75nt的目的链与PolyA修饰的95nt的互补链分离；
④切取75nt位置带荧光的目的链条带进行胶回收、乙醇纯化，作为进行下一轮SELEX筛选的次级ssDNA库；
⑤将步骤④所得的次级ssDNA文库，作为下一轮筛选的次级文库，进行循环筛选；第8轮筛选后，以第8轮SELEX筛选后的产物库8ssDNA为模板，用P1 和P2进行扩增、纯化，得纯化后的PCR扩增产物；接着对纯化后的PCR扩增产物进行TA克隆，之后随机挑取克隆菌落，进行测序；
其中，所述ssDNA库，两端为20nt的固定引物序列，中间35nt为随机序列，其序列为：
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N35-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’；
所述引物P1、P2、P3、P4分别为：
引物P1：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’，
引物P2：5’-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’，
引物P3：5’-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’，
引物P4：
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-link-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’。
以下结合具体实施例对本发明体外筛选NGAL核酸适配子、适配子A36与NGAL的特异性等进行详细说明。
实施例1体外筛选NGAL核酸适配子
1)体外合成单链DNA库，两端为20nt的固定引物序列，中间35nt为随机序列：
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N35-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’，库容量1021。
引物P1：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’，
引物P2：5’-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’，
引物P3：5’-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’，
引物P4：
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-link-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’；
以上核酸序列均委托上海生工生物工程技术有限公司合成并经HPLC纯化。
2)包被NGAL：参考Plus Carboxyl Protein Coupling Kit说明书将45μgNGAL包被于1mg羧基磁珠上，重悬于储存液中待用。
3)用Binding Buffer(Tris·HCl 50mM、NaCl 100mM、MgCl2 1mM、KCl 5mM， pH8.0)将随机ssDNA库溶解于EP管，沸水浴(100℃)5min，冰水浴3min。将ssDNA库与包被NGAL的磁珠混匀，室温，摇床孵育1h，吸弃上清。Binding Buffer洗去未结合的ssDNA，加入ddw，沸水浴5min，吸取上清。从第三轮开始筛选之前，先将ssDNA库与裸磁珠孵育30min，400r/min摇床转速进行前反筛后，取上清进行筛选。
4)将从NGAL磁珠上热洗脱的上清液作为模板，以P3和P4作为引物进行PCR扩增。其中，PCR反应体系(1000μL，分装为50μL进行PCR扩增)如下：
PCR反应条件为:95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行20个循环，72℃再延伸5min。
5)将PCR扩增产物移置1.5mL EP离心管中加入1mL的正丁醇，震荡混匀，离心，弃上清，将PCR扩增产物浓缩至200μL。
6)浓缩PCR扩增产物中加入2×TBE/Urea Sample Buffer，沸水浴10min，冰浴3min，经10％7M尿素变性PAGE胶电泳后，用干净的刀片将发绿色荧光的目的条带切下，碎胶，乙醇沉淀后，加入100μL Binding Buffer溶解沉淀，测定其浓度，得到下一轮库，进行下一轮SELEX筛选。
7)第8轮筛选后，将筛选产物(库8ssDNA)以P1、P2为引物进行PCR扩增；其中，PCR反应体系(50μL)如下：
PCR反应条件为:95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行20个循环，72℃再延伸5min。
之后将扩增产物进行纯化，用pEASY-T1Simple Cloning Kit进行TA克隆。其中，TA连接反应的反应体系为：
TA克隆具体方法为：轻轻混合TA连接反应体系，37℃，反应5min。待反应结束后，立即将EP离心管置于冰上。之后，加入50μL Trans1-T1感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热激45秒后，置于冰上2min；加入250μL LB 液体培养基，37℃，200r/min，孵育1h；取8μL500mM IPTG，40μL 20mg/mL X-gal 混合后，均匀铺在LB固体培养基上，待其被完全吸收；取200μL菌液均匀铺于培养基上，培养过夜；最后，用一次性接种环随机挑取55个培养基上的白色菌落于1mL含1/1000Amp抗生素的LB液体培养基，37℃摇菌过夜，送博尚生物工程技术有限公司测序。
8)将测序获得的核酸适配子序列用DNAMAN8.0软件对其一级结构进行多序列比对，并进行同源性分析，网页The mfold Web Server模拟核酸适配子的二级结构(http:// unafold.rna.albany.edu/？q＝mfold/DNA-Folding-Form)。
9)qPCR法验证适配子：
(1)取1μL回收的适配子质粒稀释100倍作为模板进行PCR扩增。
PCR反应体系(50μL)如下：
PCR反应条件为:95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行20个循环，72℃再延伸5min。
(2)按体外筛选NGAL核酸适配子中的步骤6)分离适配子单链，得到200μL 核酸适配子ssDNA，测其浓度，调整适配子浓度，使其浓度一致(20nM)。
(3)取1μL NGAL磁珠和裸磁珠，各加50μL适配子，震荡混匀，室温孵育 60min，置于磁力架上至液体澄清(约3min)，弃上清。
(4)加入100μL Binding Buffer，震荡混匀，置于磁力架上至液体澄清(约 3min)，弃上清，重复2次。
(5)加入100μL ddw重悬磁珠后取1μL作为模板进行qPCR。
qPCR反应体系(15μL)如下：
qPCR反应条件为:95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸10s，进行20个循环，72℃再延伸5min。
(6)选取NGAL磁珠与裸磁珠ΔCt值大于4个循环且同源性不高的核酸适配子A10、A36、A42这3个序列及测序结果中存在相同序列的A21作为候选适配子。
10)候选核酸适配子的比较：
①将筛选出的候选核酸适配子A10、A36、A42、A21交由上海生工生物技术有限公司合成；
其中，核酸适配子A10的序列为：
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGTGCTGGAATCAACACGATCG CATCCCGGAT GGGCTCCTATGCGTGCTACC GTGAA-3’；
核酸适配子A42的序列为：
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCCGTGCGGATGTACAGGGAC TTGGATAGTT TCTGACCTATGCGTGCTACC GTGAA-3’；
核酸适配子A21的序列为：
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCAACGGGTATAACCAGATGA TTTGGCGCCA CGTAACCTATGCGTGCTACC GTGAA-3’；
②接着，用Binding Buffer将所合成的候选适配子稀释成浓度200nM；
③取1μL NGAL磁珠和裸磁珠，各加50μL 200nM适配子，震荡混匀，室温孵育60min，置于磁力架上至液体澄清(约3min)，弃上清；
④之后，加入100μL Binding Buffer，震荡混匀，置于磁力架上至液体澄清 (约3min)，弃上清，重复4次；
⑤加入20μL ddw重悬磁珠后稀释100倍，取1μL进行qPCR。其中，qPCR反应体系(15μL)如下：
qPCR反应条件为:95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸10s，进行20个循环，72℃再延伸5min。
⑥之后，将核酸适配子A36 10倍倍比稀释成：1nM、10-1nM、10-2nM、10-3nM、 10-4nM、0nM 6个浓度梯度，作标准曲线。计算每微升磁珠所结合的适配子量用于候选适配子的比较。
通过qPCR比较候选适配子与靶标的结合情况。发现适配子A36(参见附图 2)具有的较强结合力，图2显示的结果为采用t检验进行统计分析的结果，其中， ***表示P<0.001。
实施例2qPCR法检测适配子A36与NGAL的特异性
1)体外化学合成核酸适配子A36稀释为200nM，沸水浴(100℃)5min，冰水浴3min。
2)按NGAL包被步骤制备正常人血清磁珠，正常人血清蛋白投入量为 500μg。将包被NGAL及正常人血清的磁珠分别与核酸适配子A36孵育1h，以裸磁珠作为空白对照，用结合缓冲液洗5遍，将洗涤后的磁珠作为模板进行 qPCR。
3)将核酸适配子A36 10倍倍比稀释成：1nM、10-1nM、10-2nM、10-3nM、 10-4nM、0nM 6个浓度梯度，作标准曲线。
4)计算每微升磁珠所结合的适配子A36量。
将所得每微升磁珠所结合的适配子A36量通过GraphPad Prism v5.0软件作出结果分析图，如图3所示，NGAL磁珠上的适配子量显著高于裸磁珠与正常人血清磁珠，图3显示的结果为采用t检验进行统计分析的结果，其中，***表示P<0.001。
实施例3qPCR法检测适配子A36的亲和力
1)将候选适配子A36 2倍倍比稀释成浓度为200nM、100nM、50nM、25nM、 12.5nM、6.25nM、3.125nM、0nM 8个浓度梯度，沸水浴(100℃)5min，冰水浴3min。
2)分别与裸磁珠(空白对照)、NGAL磁珠进行孵育1h，用结合缓冲液洗5 遍，将洗涤后的磁珠作为模板进行qPCR。
3)将适配子A36 10倍倍比稀释成：1nM、10-1nM、10-2nM、10-3nM、10-4nM、 0nM 6个浓度梯度，作标准曲线。
4)计算每微升磁珠所结合的适配子A36量，用软件GraphPad Prism 5作图并计算Kd值。
如图4所示，A36的Kd值为43.59nM。
本发明实施例所涉及的相关配方如下：
(1)Binding Buffer(pH 8.0)：Tris·HCl 50mM、NaCl 100mM、MgCl2 1mM、 KCl5mM。
(2)10％7M尿素变性PAGE胶(10mL)：尿素4.20g、ddw 2.00mL、5×TBE 2.00mL、40％丙烯酰胺2.50mL、10％APS 0.075mL、TEMDED 0.01mL。
(3)LB液体培养基(100mL)：胰蛋白胨1g、酵母粉0.5g、NaCl 1g。
LB固体培养基(100mL)：胰蛋白胨1g、酵母粉0.5g、NaCl 1g、琼脂1.5g。
所涉及的试剂盒如下：
本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则下进行的任何等同替换或局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国人民解放军南京军区福州总医院
<120> 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A36及其筛选方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
agcagcacag aggtcagatg cccatatgct actttgcaca catcctggat aggctcctat 60
gcgtgctacc gtgaa 75
<210> 2
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
agcagcacag aggtcagatg tgctggaatc aacacgatcg catcccggat gggctcctat 60
gcgtgctacc gtgaa 75
<210> 3
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
agcagcacag aggtcagatg ccgtgcggat gtacagggac ttggatagtt tctgacctat 60
gcgtgctacc gtgaa 75
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
agcagcacag aggtcagatg caacgggtat aaccagatga tttggcgcca cgtaacctat 60
gcgtgctacc gtgaa 75

Claims (7)

1.一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A36，其特征在于：它的序列如下所示：
AGCAGCACAG AGGTCAGATG CCCATATGCT ACTTTGCACA 40
CATCCTGGAT AGGCTCCTAT GCGTGCTACC GTGAA 75；
在25℃，0.1M Na+，0.001M Mg2+条件下其二级结构为茎环结构，其分子结构如下：
2.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A36，其特征在于：对所述核酸适配子A36的5'端或3'端进行FAM、Biotin或氨基化学修饰。
3.根据权利要求1或2所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A36的筛选方法，其特征在于：基于核酸适配子的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以NGAL为靶标，通过NGAL羧基磁珠从ssDNA库中筛选得到与NGAL特异性结合的核酸适配子。
4.根据权利要求3所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A36的筛选方法，其特征在于：它包括以下步骤：
①包被NGAL的磁珠与ssDNA库孵育进行SELEX筛选，并从第三轮开始在每轮筛选之前加入裸磁珠进行前反筛，以此去除与磁珠非特异结合的ssDNA；
②孵育洗涤后的磁珠进行热洗脱，洗脱下来的ssDNA作为模板，加入带荧光修饰的上游引物P3与带PolyA尾的下游引物P4进行PCR扩增；
③PCR扩增产物用正丁醇浓缩后经10％7M尿素变性PAGE胶电泳，使得带荧光修饰的75nt的目的链与PolyA修饰的95nt的互补链分离；
④切取75nt位置带荧光的目的链条带进行胶回收、乙醇纯化，作为进行下一轮SELEX筛选的次级ssDNA库；
⑤将步骤④所得的次级ssDNA文库，作为下一轮筛选的次级文库，进行循环筛选；第8轮筛选后，以第8轮SELEX筛选后的产物库8ssDNA为模板，用P1和P2进行扩增、纯化，得纯化后的PCR扩增产物；接着对纯化后的PCR扩增产物进行TA克隆，之后随机挑取克隆菌落，进行测序；
其中，所述ssDNA库，两端为20nt的固定引物序列，中间35nt为随机序列，其序列为：
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N35-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’；
所述引物P1、P2、P3、P4分别为：
引物P1：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’，
引物P2：5’-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’，
引物P3：5’-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’，
引物P4：
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-link-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A36的应用，其特征在于：在分离、纯化中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白中的应用。
6.根据权利要求1-4任意一项所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A36的应用，其特征在于：在制备中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的检测试剂中的应用。
7.根据权利要求1-4任意一项所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A36的应用，其特征在于：在研制治疗中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白相关疾病药物中的应用。
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李赫楠: "功能纳米材料的制备及生物传感应用", 《中国博士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》 *

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