CN108746658A - 一种具有抗菌活性的海藻多糖纳米金颗粒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抗菌活性的海藻多糖纳米金颗粒的制备方法,步骤如下:步骤1,制备浓度为0.01~0.1g/mL的海藻多糖液;步骤2,制备浓度为0.1~10mmol/L的氯金酸溶液;步骤3,将步骤1制备的海藻多糖液与步骤2制备的氯金酸溶液按照体积比为0.5:1~2:1混合均匀,反应一定的时间,得到纳米金溶胶;步骤4,将步骤3制备的纳米金溶胶进行离心,收集离心管底部固体,除去上清液,将收集的底部固体依次用蒸馏水、乙醇、丙酮各清洗2次,然后将所得固体用蒸馏水超声溶解,除去底部残渣,将上清液离心、干燥,即得纳米金固体粉末。本发明的一种具有抗菌活性的海藻多糖纳米金颗粒的制备方法,将海藻多糖和纳米金颗粒结合在一起,提高纯纳米金的抗菌活性。
Description
技术领域
本发明属于纳米金制备方法技术领域,涉及一种具有抗菌活性的海藻多糖纳米金颗粒的制备方法。
背景技术
宏基因组研究显示含耐药基因的微生物在自然界中无处不在,这意味着抗生素的耐药性也是必然存在的。实际上,由于抗生素的滥用,细菌耐药已经成为全球公共健康领域面临的一项重大挑战,引起我国及国际社会的广泛关注,纳米银颗粒具有较强的广谱抗菌作用,对细菌无耐药性,但纳米银不稳定,对人体也有一定毒性,美国FDA已明确禁止纳米银在医疗方面的使用,我国CFDA在医用有些方面也限制纳米银的使用,反观纳米金颗粒,其作为抗菌剂的报道也逐渐增多,展现出稳定性好、毒性小的特点,如《金纳米颗粒的合成及其抗菌性能研究》(赵玉云.中国科学院大学,2010),公布了嘧啶修饰的纳米金颗粒具有高效抗菌效果的同时还具备低耐药和低毒的特点;《Synergy of non-antibiotic drugs andpyrimidinethiol on gold nanoparticles against superbugs》(Zhao Y,Chen Z,ChenY,Xu J,Li J,Jiang X..Am.Chem.,2013,135,12940-12943)将抗菌中心负载于纳米颗粒上利用纳米颗粒的多价效应和穿膜效应能提高抗菌效果并降低耐药性;《海藻多糖的生物活性及医药应用研究新进展》(刘海州,刘均洪.研究与进展,2005,8:29-33),提出海藻多糖具有多种生物活性;《Biosynthesis of silver nanoparticles using Alternantherasessilis,(Linn.)extract and their antimicrobial,antioxidant activities》(Niraimathi K L,Sudha V,Lavanya R,et al.[J].Colloids&Surfaces BBiointerfaces,2012,102(2):288-291.4.)以及《Antibacterial activity of silvernanoparticles synthesized In-situ by solution spraying onto cellulose》(Yan J,Abdelgawad A M,Mehrez E.El-Naggar,et al.Carbohydrate Polymers,2016,147:500-508.)表明纳米金颗粒除独特的物理化学特性外,也具有潜在的抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等生物活性;中国发明专利《一种含纳米金抗菌敷料及其制备方法》(公开号:CN106139224A,公开日:2016-11-23),对细胞实验和动物实验表明纳米金对人体的毒性远小于纳米银。但是,单独的纳米金颗粒抗菌活性较低,且现有纳米金的制备方法存在的高污染、高能耗等缺陷。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗菌活性的海藻多糖纳米金颗粒的制备方法,将海藻多糖和纳米金颗粒结合在一起,提高纯纳米金的抗菌活性。
本发明所采用的技术方案是,一种具有抗菌活性的海藻多糖纳米金颗粒的制备方法,具体按照以下步骤实施:
步骤1,制备浓度为0.01~0.1g/mL的海藻多糖液;
步骤2,制备浓度为0.1~10mmol/L的氯金酸溶液;
步骤3,纳米金溶胶的制备,具体为:
将步骤1制备的海藻多糖液与步骤2制备的氯金酸溶液按照体积比为0.5:1~2:1混合均匀,反应一定的时间,得到纳米金溶胶;
步骤4,将步骤3制备的纳米金溶胶进行离心,收集离心管底部固体,除去上清液,将收集的底部固体依次用蒸馏水、乙醇、丙酮各清洗2次,然后将所得固体用蒸馏水超声溶解,除去底部残渣,将上清液离心、干燥,即得纳米金固体粉末。
本发明的特征还在于,
步骤1具体为:
将取一定量的海藻与95%乙醇混合超声提取两次并合并提取液,在50℃下干燥提取液10小时,获得干燥物,然后将干燥物与蒸馏水回流3次,之后真空过滤,提取水萃取液,再浓缩至100ml,所得浓缩液与其4倍体积的95%乙醇溶液混合,搅拌后在4℃的条件下静置过夜进行多糖沉淀,然后在4000r/min下离心10min,弃上清液,再分别用去离子水和Sevage溶液处理,然后进行干燥,得粗海藻多糖,再将粗海藻多糖溶于一定量的去离子水中,制得浓度为0.01~0.1g/mL的海藻多糖液。
步骤2具体为:取一定量的HAuCl4·4H2O使用蒸馏水定容,得到浓度为0.1~10mmol/L的氯金酸溶液。
步骤3中,将步骤1制备的海藻多糖液与步骤2制备的氯金酸溶液按照体积比为0.5:1~2:1混合的反应条件为:在pH为5~9、反应温度为20~70℃的条件下反应1~3小时,得到纳米金溶胶。
步骤4中对纳米金溶胶进行离心的条件为:在8000~12000r/min条件下离心15~25min。
本发明的有益效果是:
(1)本发明利用了纯天然多糖为还原剂和稳定剂,采用绿色合成的方法,成功地合成了具有明显抗菌活性的纳米金颗粒。
(2)本发明利用海藻多糖水溶液为还原剂和稳定剂制备所得的纳米金颗粒,分散均匀、粒径较小,有效的克服了纳米粒子的团聚问题。
附图说明
图1是本发明一种具有抗菌活性的海藻多糖纳米金颗粒的制备方法实施例3所制备的海藻多糖纳米金颗粒的电镜图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明所采用的技术方案是,一种具有抗菌活性的海藻多糖纳米金颗粒的制备方法,具体按照以下步骤实施:
步骤1,制备浓度为0.01~0.1g/mL的海藻多糖液;具体为:将取一定量的海藻与95%乙醇混合超声提取两次并合并提取液,在50℃下干燥提取液10小时,获得干燥物,然后将干燥物与蒸馏水回流3次,之后真空过滤,提取水萃取液,再浓缩至100ml,所得浓缩液与其4倍体积的95%乙醇溶液混合,搅拌后在4℃的条件下静置过夜进行多糖沉淀,然后在4000r/min下离心10min,弃上清液,再分别用去离子水和Sevage溶液处理,然后进行干燥,得粗海藻多糖,再将粗海藻多糖溶于一定量的去离子水中,制得浓度为0.01~0.1g/mL的海藻多糖液;
步骤2,制备浓度为0.1~10mmol/L的氯金酸溶液;具体为:取一定量的HAuCl4·4H2O使用蒸馏水定容,得到浓度为0.1~10mmol/L的氯金酸溶液;
步骤3,纳米金溶胶的制备,具体为:
将步骤1制备的海藻多糖液与步骤2制备的氯金酸溶液按照体积比为0.5:1~2:1混合均匀,在pH为5~9、反应温度为20~70℃的条件下反应1~3小时,得到纳米金溶胶;
步骤4,将步骤3制备的纳米金溶胶进行离心,在8000~12000r/min条件下离心15~25min,收集离心管底部固体,除去上清液,将收集的底部固体依次用蒸馏水、乙醇、丙酮各清洗2次,然后将所得固体用蒸馏水超声溶解,除去底部残渣,将上清液离心、干燥,即得纳米金固体粉末。
实施例1
一种具有抗菌活性的海藻多糖纳米金颗粒的制备方法,具体按照以下步骤实施:
步骤1,制备浓度为0.01g/mL的海藻多糖液;具体为:将取一定量的海藻与95%乙醇混合超声提取两次并合并提取液,在50℃下干燥提取液10小时,获得干燥物,然后将干燥物与蒸馏水回流3次,之后真空过滤,提取水萃取液,再浓缩至100ml,所得浓缩液与其4倍体积的95%乙醇溶液混合,搅拌后在4℃的条件下静置过夜进行多糖沉淀,然后在4000r/min下离心10min,弃上清液,再分别用去离子水和Sevage溶液处理,然后进行干燥,得粗海藻多糖,再将粗海藻多糖溶于一定量的去离子水中,制得浓度为0.01g/mL的海藻多糖液;
步骤2,制备浓度为0.1mmol/L的氯金酸溶液;具体为:取一定量的HAuCl4·4H2O使用蒸馏水定容,得到浓度为0.1mmol/L的氯金酸溶液;
步骤3,纳米金溶胶的制备,具体为:
将步骤1制备的海藻多糖液与步骤2制备的氯金酸溶液按照体积比为0.5:1混合均匀,在pH为9、反应温度为20℃的条件下反应1小时,得到纳米金溶胶;
步骤4,将步骤3制备的纳米金溶胶进行离心,在8000r/min条件下离心15min,收集离心管底部固体,除去上清液,将收集的底部固体依次用蒸馏水、乙醇、丙酮各清洗2次,然后将所得固体用蒸馏水超声溶解,除去底部残渣,将上清液离心、干燥,即得纳米金固体粉末。
实施例2
步骤1,制备浓度为0.05g/mL的海藻多糖液;具体为:将取一定量的海藻与95%乙醇混合超声提取两次并合并提取液,在50℃下干燥提取液10小时,获得干燥物,然后将干燥物与蒸馏水回流3次,之后真空过滤,提取水萃取液,再浓缩至100ml,所得浓缩液与其4倍体积的95%乙醇溶液混合,搅拌后在4℃的条件下静置过夜进行多糖沉淀,然后在4000r/min下离心10min,弃上清液,再分别用去离子水和Sevage溶液处理,然后进行干燥,得粗海藻多糖,再将粗海藻多糖溶于一定量的去离子水中,制得浓度为0.05g/mL的海藻多糖液;
步骤2,制备浓度为5mmol/L的氯金酸溶液;具体为:取一定量的HAuCl4·4H2O使用蒸馏水定容,得到浓度为5mmol/L的氯金酸溶液;
步骤3,纳米金溶胶的制备,具体为:
将步骤1制备的海藻多糖液与步骤2制备的氯金酸溶液按照体积比为1:1混合均匀,在pH为8、反应温度为45℃的条件下反应2小时,得到纳米金溶胶;
步骤4,将步骤3制备的纳米金溶胶进行离心,在10000r/min条件下离心20min,收集离心管底部固体,除去上清液,将收集的底部固体依次用蒸馏水、乙醇、丙酮各清洗2次,然后将所得固体用蒸馏水超声溶解,除去底部残渣,将上清液离心、干燥,即得纳米金固体粉末。
实施例3
步骤1,制备浓度为0.1g/mL的海藻多糖液;具体为:将取一定量的海藻与95%乙醇混合超声提取两次并合并提取液,在50℃下干燥提取液10小时,获得干燥物,然后将干燥物与蒸馏水回流3次,之后真空过滤,提取水萃取液,再浓缩至100ml,所得浓缩液与其4倍体积的95%乙醇溶液混合,搅拌后在4℃的条件下静置过夜进行多糖沉淀,然后在4000r/min下离心10min,弃上清液,再分别用去离子水和Sevage溶液处理,然后进行干燥,得粗海藻多糖,再将粗海藻多糖溶于一定量的去离子水中,制得浓度为0.1g/mL的海藻多糖液;
步骤2,制备浓度为10mmol/L的氯金酸溶液;具体为:取0.4118g的HAuCl4·4H2O使用蒸馏水定容到100mL,得到浓度为10mmol/L的氯金酸溶液;
步骤3,纳米金溶胶的制备,具体为:
将步骤1制备的海藻多糖液与步骤2制备的氯金酸溶液按照体积比为1:1混合均匀,在pH为8、反应温度为70℃的条件下反应1.5小时,得到纳米金溶胶;
步骤4,将步骤3制备的纳米金溶胶进行离心,在12000r/min条件下离心20min,收集离心管底部固体,除去上清液,将收集的底部固体依次用蒸馏水、乙醇、丙酮各清洗2次,然后将所得固体用蒸馏水超声溶解,除去底部残渣,将上清液离心、干燥,即得纳米金固体粉末。
实施例4
步骤1,制备浓度为0.1g/mL的海藻多糖液;具体为:将取一定量的海藻与95%乙醇混合超声提取两次并合并提取液,在50℃下干燥提取液10小时,获得干燥物,然后将干燥物与蒸馏水回流3次,之后真空过滤,提取水萃取液,再浓缩至100ml,所得浓缩液与其4倍体积的95%乙醇溶液混合,搅拌后在4℃的条件下静置过夜进行多糖沉淀,然后在4000r/min下离心10min,弃上清液,再分别用去离子水和Sevage溶液处理,然后进行干燥,得粗海藻多糖,再将粗海藻多糖溶于一定量的去离子水中,制得浓度为0.1g/mL的海藻多糖液;
步骤2,制备浓度为10mmol/L的氯金酸溶液;具体为:取一定量的HAuCl4·4H2O使用蒸馏水定容,得到浓度为10mmol/L的氯金酸溶液;
步骤3,纳米金溶胶的制备,具体为:
将步骤1制备的海藻多糖液与步骤2制备的氯金酸溶液按照体积比为2:1混合均匀,在pH为9、反应温度为70℃的条件下反应3小时,得到纳米金溶胶;
步骤4,将步骤3制备的纳米金溶胶进行离心,在12000r/min条件下离心25min,收集离心管底部固体,除去上清液,将收集的底部固体依次用蒸馏水、乙醇、丙酮各清洗2次,然后将所得固体用蒸馏水超声溶解,除去底部残渣,将上清液离心、干燥,即得纳米金固体粉末。
实施例5
步骤1,制备浓度为0.08g/mL的海藻多糖液;具体为:将取一定量的海藻与95%乙醇混合超声提取两次并合并提取液,在50℃下干燥提取液10小时,获得干燥物,然后将干燥物与蒸馏水回流3次,之后真空过滤,提取水萃取液,再浓缩至100ml,所得浓缩液与其4倍体积的95%乙醇溶液混合,搅拌后在4℃的条件下静置过夜进行多糖沉淀,然后在4000r/min下离心10min,弃上清液,再分别用去离子水和Sevage溶液处理,然后进行干燥,得粗海藻多糖,再将粗海藻多糖溶于一定量的去离子水中,制得浓度为0.08g/mL的海藻多糖液;
步骤2,制备浓度为7mmol/L的氯金酸溶液;具体为:取一定量的HAuCl4·4H2O使用蒸馏水定容,得到浓度为7mmol/L的氯金酸溶液;
步骤3,纳米金溶胶的制备,具体为:
将步骤1制备的海藻多糖液与步骤2制备的氯金酸溶液按照体积比为1:1混合均匀,在pH为6、反应温度为55℃的条件下反应小时,得到纳米金溶胶;
步骤4,将步骤3制备的纳米金溶胶进行离心,在12000r/min条件下离心20min,收集离心管底部固体,除去上清液,将收集的底部固体依次用蒸馏水、乙醇、丙酮各清洗2次,然后将所得固体用蒸馏水超声溶解,除去底部残渣,将上清液离心、干燥,即得纳米金固体粉末。
申请人实施例3为基础,分别考察了氯金酸的浓度对纳米金合成的影响、海藻多糖的浓度及溶液混合比对纳米金合成的影响、pH对纳米金合成的影响,经研究发现,
1.氯金酸的浓度对纳米金合成的影响
在其他条件不变的情况下,考察了浓度为0.1~10mmol/L的氯金酸溶液对纳米金颗粒合成的影响,实验结果表明:10mM的氯金酸溶液是合成纳米金颗粒的最佳浓度;
2.海藻多糖的浓度及溶液混合比对纳米金合成的影响
在其他条件不变的情况下,考察了0.01~0.1g/mL不同浓度的海藻多糖对反应的影响,结果表明,0.1g/mL的海藻多糖溶液反应最快,形成的纳米金颗粒最好,同时,对海藻多糖溶液与氯金酸溶液的不同混合比(0.5:1~2:1)也进行了考察,发现不同配比对纳米金的合成影响较大,多糖溶液的体积分数越大,合成的速度就越快,在两者接近1:1的条件下,90min内能成功地得到较多的纳米金颗粒;
3.pH对纳米金合成的影响
在其他条件不变的情况下,考察了pH在5至9的条件下对纳米金颗粒合成的影响,结果表明:酸碱度对于完成反应所需要时间没有明显影响,但随着pH增加,最初形成纳米金颗粒的速度明显提高,且随着pH增加,生成的纳米颗粒粒径也逐渐减小,最佳pH为8。
为证明本申请制备的海藻多糖纳米金颗粒的抗菌效果好,申请人选择大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行抗菌实验,取不同量的纯纳米金颗粒及采用本发明的实施例3方法制备出的海藻多糖纳米金颗粒分别分散于100mL溶液中,涂布在保鲜纸上测定其抑菌效果,见表1和表2,表1为不同含量的纳米金颗粒对大肠杆菌的抑制效果,表2为不同含量的纳米金颗粒对金葡菌的抑制效果:
表1
纳米颗粒浓度(μg·mL-1) | 0 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
纯纳米金颗粒抑菌环大小/(mm) | 0 | 4 | 7 | 10 | 12 | 16 | 20 |
海藻多糖纳米金颗粒抑菌环大小/(mm) | 0 | 6 | 10 | 14 | 18 | 23 | 26 |
表2
纳米颗粒浓度(μg·mL-1) | 0 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
纯纳米金颗粒抑菌环大小/(mm) | 0 | 4 | 6 | 9 | 12 | 15 | 18 |
海藻多糖纳米金颗粒抑菌环大小/(mm) | 0 | 5 | 8 | 12 | 18 | 21 | 25 |
表1、表2可以看出,本申请所制备的海藻多糖纳米金颗粒的抑菌环大小明显大于纯纳米金颗粒抑菌环大小,说明本发明的海藻多糖纳米金颗粒抗菌效果优于纯纳米金颗粒的抗菌效果。
Claims (5)
1.一种具有抗菌活性的海藻多糖纳米金颗粒的制备方法,其特征在于,具体按照以下步骤实施:
步骤1,制备浓度为0.01~0.1g/mL的海藻多糖液;
步骤2,制备浓度为0.1~10mmol/L的氯金酸溶液;
步骤3,纳米金溶胶的制备,具体为:
将步骤1制备的海藻多糖液与步骤2制备的氯金酸溶液按照体积比为0.5:1~2:1混合均匀,反应一定的时间,得到纳米金溶胶;
步骤4,将步骤3制备的纳米金溶胶进行离心,收集离心管底部固体,除去上清液,将收集的底部固体依次用蒸馏水、乙醇、丙酮各清洗2次,然后将所得固体用蒸馏水超声溶解,除去底部残渣,将上清液离心、干燥,即得纳米金固体粉末。
2.根据权利要求1所述的一种具有抗菌活性的海藻多糖纳米金颗粒的制备方法,其特征在于,所述步骤1具体为:
将取一定量的海藻与95%乙醇混合超声提取两次并合并提取液,在50℃下干燥提取液10小时,获得干燥物,然后将干燥物与蒸馏水回流3次,之后真空过滤,提取水萃取液,再浓缩至100ml,所得浓缩液与其4倍体积的95%乙醇溶液混合,搅拌后在4℃的条件下静置过夜进行多糖沉淀,然后在4000r/min下离心10min,弃上清液,再分别用去离子水和Sevage溶液处理,然后进行干燥,得粗海藻多糖,再将粗海藻多糖溶于一定量的去离子水中,制得浓度为0.01~0.1g/mL的海藻多糖液。
3.根据权利要求1所述的一种具有抗菌活性的海藻多糖纳米金颗粒的制备方法,其特征在于,所述步骤2具体为:取一定量的HAuCl4·4H2O使用蒸馏水定容,得到浓度为0.1~10mmol/L的氯金酸溶液。
4.根据权利要求1所述的一种具有抗菌活性的海藻多糖纳米金颗粒的制备方法,其特征在于,所述步骤3中,将步骤1制备的海藻多糖液与步骤2制备的氯金酸溶液按照体积比为0.5:1~2:1混合的反应条件为:在pH为5~9、反应温度为20~70℃的条件下反应1~3小时,得到纳米金溶胶。
5.根据权利要求1所述的一种具有抗菌活性的海藻多糖纳米金颗粒的制备方法,其特征在于,所述步骤4中对纳米金溶胶进行离心的条件为:在8000~12000r/min条件下离心15~25min。
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