CN108732278B

CN108732278B - 一种高效液相色谱法同时测定饮料中十种天然甜味剂的方法

Info

Publication number: CN108732278B
Application number: CN201810865014.8A
Authority: CN
Inventors: 孙立臻; 尹丽丽; 别梅; 周禹君; 薛霞; 刘艳明
Original assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Current assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Priority date: 2018-08-01
Filing date: 2018-08-01
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2038-08-01
Also published as: CN108732278A

Abstract

本发明提供一种高效液相色谱法同时测定饮料中十种天然甜味剂的方法，同时测定十种天然甜味剂，并实现了两种差向异构体的分离。目标物经碱性甲醇提取，采用YMC C30（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱分离，以乙腈和0.2%磷酸溶液作为流动相进行梯度洗脱，PDA检测器检测，外标法定量。结果表明，10种甜味剂在5.00μg/mL~100.00μg/mL浓度范围内线性良好，相关系数R²为0.9990~0.9999，定量限为5.0mg/kg~10.0mg/kg，加标回收率达到80.3%~105.6%。本方法前处理简单，灵敏度高，非常适用于饮料中甜菊糖苷等十种甜味剂的同时测定。

Description

一种高效液相色谱法同时测定饮料中十种天然甜味剂的方法

技术领域

本发明属于食品分析领域，涉及一种饮料中天然甜味素的检测方法，具体涉及一种高效液相色谱法同时测定饮料中十种天然甜味剂的方法。

背景技术

非糖类甜味剂是甜味剂的重要品种，一般甜度高，热值小，大部分不参与代谢过程，常被称为非营养性或低热值甜味剂，包括天然甜味剂和人工合成甜味剂。天然甜味剂的种类主要有甜菊糖、甘草甜素和竹芋甜素等。甜菊糖是糖尿病和肥胖病患者适用的甜味剂，可用于制作糖果、饮料、油炸小食品、调味品等产品。甜菊糖作为糖的替代品用在饮料中，既能降低饮料含糖量及热量，又能带给人们更好的口感，这也符合饮料低糖化的发展趋势。甘草是常见的药食两用食品，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛的诸多功效。现代药理学研究表明其具有抗癌、抗炎、抗病毒、抗菌、免疫调节等诸多药理活性。甘草的甜味来自甘草酸(Glycyrrhizicacid)和甘草次酸(Glycyrrhetinicacid)。作为甜味剂添加到饮料、糖果、糕点等食品中，甘草酸和甘草次酸不但可以改善食品的口感，更能起到增加食品营养价值的作用。

甜菊糖是从甜叶菊中提取的天然甜味剂，是由一种四环二萜的糖苷类物质组成的混合物，每种成分都具有相同的苷元-甜菊醇，区别在于苷键上(R₁和R₂)结合的糖的种类和数量不同。其中含量最多的是甜菊糖苷（Stevioside），大约占总糖苷的70%，其甜度约为蔗糖的300倍，其次是瑞鲍迪苷A（RebaudiosideA），大约占15%～20%，再次是瑞鲍迪苷C（RebaudiosideC），含量大约是5%。其余的几种物质含量较少，分别是瑞鲍迪苷B（RebaudiosideB）、瑞鲍迪苷D（RebaudiosideD）、瑞鲍迪苷F（RebaudiosideF）、杜克苷A（DulcosideA）、甜茶苷（Rubusoside）和甜菊双糖苷（Steviolbioside）。甘草中的主要活性成分为三萜类化合物甘草酸和甘草次酸。甘草酸是从甘草中提取的主要成分，约占甘草根干重的4%~5%，甜度约为蔗糖的50倍。甘草次酸是由甘草酸水解脱去糖酸链而形成，甜度约为蔗糖的250倍。甘草次酸有两种差向异构体，分别为18-α-甘草次酸（18-α-glycyrrhetintic）和18-β-甘草次酸（18-β-glycyrrhetinticacid）。

甜菊醇结构式

Strμctμreofsteviol

（R被糖苷取代为甘草酸；R被H取代为甘草次酸；

18-α-甘草次酸和18-β-甘草次酸互为差向异构体）

（Risreplacedbyglycosidesasglycyrrhizicacid;RisreplacedwithHasglycyrrhetinicacid;

18-alphaglycyrrhetinicacidand18-betaglycyrrhetinicacidareepimersofeachother）

GB2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定了甜菊糖苷的使用范围及用量，并规定了甘草酸可以根据生产需要添加。据国内外文献报道，甜菊糖和甘草酸含量的分析方法主要有高效液相色谱法、分光光度法、化学发光分析法、薄层色谱法、气相色谱法等。相对于其他方法，液相色谱法简便快捷，应用也较为普及。目前国内外尚未见到同时检测甜菊糖和甘草酸这十种天然甜味剂的相关报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种高效液相色谱法同时测定饮料中十种天然甜味剂的方法，该方法将饮料中十种甜味剂同时分离，并实现了两种互为差向异构体的甘草次酸的完全分离和准确定量。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种高效液相色谱法同时测定饮料中十种天然甜味剂的方法，包括以下步骤：

（1）样品的前处理：称取样品5g，氨水调节至pH为8.0，加入甲醇，涡旋震荡，混匀后超声提取，定容，混匀后，离心，过滤，备用；

（2）标准溶液的配制：准确称取甜菊糖苷、甜菊双糖苷、瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C，甜茶苷，杜克苷A，甘草酸、18-α-甘草次酸和18-β-甘草次酸标准品，用甲醇溶解，配制成浓度为1.0mg/mL的储备液，用甲醇稀释成浓度为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0μg/mL的系列标准工作溶液。

（3）取步骤（2）中的系列标准工作溶液上机测定，得到标准溶液色谱图，以标准溶液峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，绘制标准曲线，得到线性回归方程；

（4）样品分析：用高效液相色谱仪对样品进行分析检测。

优选地，步骤（1）样品的前处理具体为：称取样品5g，置于25mL具塞比色管中，用氨水调节至pH为8.0，加入20mL甲醇，涡旋震荡2min，混匀后超声提取15min，并用甲醇定容刻度，混匀后，转移至50mL具塞离心管中，以7500r/min离心5min，上清液经0.22μm有机相滤膜过滤。

优选地，所述高效液相色谱仪的色谱柱为：YMC C30，柱长250mm，柱内径4.6mm，填料内径5μm；所述超高效液相色谱的流动相A为乙腈，流动相B为体积分数0.2%磷酸溶液。

更优选地，所述高效液相色谱的洗脱条件为：流速：1.0mL/min；进样量：10μL；检测波长：210nm和250nm；柱温：35℃；梯度洗脱条件如下：

“梯度变化曲线为6”是指梯度变化曲线为直线。

10种甜味剂在5.00μg/mL~100.00μg/mL浓度范围内线性良好，相关系数R²为0.9990~0.9999，定量限为5.0mg/kg~10.0mg/kg，加标回收率达到80.3%~105.6%。本方法前处理简单，灵敏度高，非常适用于饮料中甜菊糖苷等十种甜味剂的同时测定。

有益效果

（1）本发明以YMC C30色谱柱为分析柱，实现了饮料中甜菊糖苷、甜菊双糖苷、瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、甜茶苷、杜克苷、甘草酸、18-α-甘草次酸和18-β-甘草次酸的同时测定，并实现了两种互为差向异构体的甘草次酸的完全分离和准确定量。本实验方法前处理简单，分析结果准确可靠，可以用于生产过程中的质量控制及产品质量检验。

（2）本发明样品前处理采用氨水调节至碱性后甲醇提取，对于甜菊糖的影响很小，而碱性条件更有利于甘草酸和甘草次酸的提取，回收率较高。

（3）本发明较现有技术，大大的缩短了分析时间，提高了检测效率；准确度高且稳定；本发明中甜菊糖苷、甜菊双糖苷、瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C，甜茶苷，杜克苷A的定性检出限为3mg/kg，定量检出限为10.0mg/kg；甘草酸、18-α甘草次酸和18-β甘草次酸的定性检出限为1.6mg/kg，定量检出限为5mg/kg，检出限远低于现有文献报道水平。

附图说明

图1十种甜味剂的光谱图。

图2甲醇直接提取与碱性甲醇提取目标物的回收率对比图。

图3：两种沉淀蛋白方式对目标物提取的回收率对比图。

图4为十种甜味剂的标准溶液在210nm下的PDA色谱图。

图5为甘草酸、18-β甘草次酸、18-α-甘草次酸标准溶液在250nm下的PDA色谱图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

1实验部分

1.1仪器与试剂

高效液相色谱：岛津液相色谱仪，配PDA检测器；Milli-QSystem超纯水制备器(美国Milipore公司)；超声波清洗器；电子天平；离心机；涡旋混合器。

甜菊糖苷、甜菊双糖苷、瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、甜茶苷和杜克苷A标准品，购于Chromadex；甘草酸、18-α甘草次酸和18-β甘草次酸购于ANPEL。

甲醇、乙腈为色谱纯；磷酸为色谱纯。其他试剂为分析纯。

1.2样品来源：样品均为市售饮料。

1.3色谱条件

色谱柱：YMC C30（4.6mm×250mm，5μm）；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；检测波长：210nm和250nm；柱温：35℃；流动相：见表1，乙腈：0.2%磷酸溶液梯度洗脱。

表1梯度洗脱条件

Tab.1Elutiongradient

1.4标准溶液的配制

准确称取相应质量的甜菊糖苷、甜菊双糖苷、瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C，甜茶苷，杜克苷A，甘草酸、18-α-甘草次酸和18-β-甘草次酸标准品，用甲醇溶解，配制成浓度为1.0mg/mL的储备液，根据需要将储备液用甲醇稀释成浓度为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0μg/mL的系列标准工作溶液。

1.5样品处理和制备

称取样品5g（精确至0.01g），置于25mL具塞比色管中，用氨水调节至pH约为8，加入20mL甲醇，涡旋震荡2min，混匀后超声提取15min，并用甲醇定容刻度，混匀后，转移至50mL具塞离心管中，以7500r/min离心5min，上清液经0.22μm有机相滤膜过滤，上机测定。

2结果与讨论

2.1实验条件与分析

2.1.1色谱柱的选择

由于本实验分离的甜味剂种类较多，选择合适的色谱柱十分重要。本文参考相关文献，先后采用WatersX-brigeC18-150mm（4.6mm×150mm，3.5μm），WatersX-brigeC18-250mm（4.6mm×250mm，3.5μm），AtlantisT3（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱进行试验，结果发现，这几种色谱柱无法完全分离这十种甜味剂，尤其无法实现18-α-甘草次酸和18-β-甘草次酸的手性分离。而YMC C30（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱可实现十种目标物的有效分离，且18-α甘草次酸和18-β甘草次酸的手性分离效果理想，因此，最终采用YMC C30（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱进行测定。

2.1.2检测波长的选择

本试验采用PDA检测器进行全波长扫描（扫描范围190nm～400nm），甜菊糖苷、甜菊双糖苷、瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、甜茶苷、杜克苷A的最大吸收波长在200nm附近，由于乙腈和水的最大吸收波长为190nm，故干扰较为严重，最终选择210nm作为甜菊糖的测定波长。甘草酸的最大吸收波长为251nm，18-α-甘草次酸的最大吸收为243nm，18-β-甘草次酸的最大吸收在248nm，故最终选择250nm作为甘草酸的测定波长（见图1）。

2.1.3流动相体系和柱温的选择

参考相关文献，发现不同的文献检测甜菊糖苷的流动相体系不同。本文考察了以下三种流动相体系：流动相体系Ⅰ为乙腈∶水=32：68（体积比）；流动相体系Ⅱ为乙腈：10mM磷酸钠缓冲液=35：65（体积比）；流动相体系Ⅲ为乙腈：0.2%磷酸溶液=38：62（体积比），考察不同流动相体系对甜菊糖和甘草酸色谱行为的影响。结果表明，流动相Ⅱ和Ⅲ均可以实现十种物质的分离，综合考虑磷酸盐可能会对仪器造成的磨损，最终选择体系Ⅲ作为流动相分析条件。由于18-α-甘草次酸和18-β-甘草次酸的洗脱需要更高比例的有机相，故本实验选择梯度洗脱，综合考虑分离度和分离时间，最终的流动相条件见表1。

固定流动相流速1.0mL/min，柱温考察了30℃，35℃，40℃，未有明显区别，最终选择35℃作为最终柱温条件。

2.1.4 样品前处理条件的优化

本实验考察了甲醇直接提取与氨水调节至碱性后甲醇提取，发现两种提取方式对于甜菊糖的影响很小，而碱性条件更有利于甘草酸和甘草次酸的提取，回收率对比见图2。考虑蛋白饮料中的蛋白含量较高，本实验还考察了亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白的前处理方式，结果表明，亚铁氰化钾和乙酸锌会影响目标物的回收率，尤其是甘草酸和甘草次酸的回收率会大大降低，回收率对比见图3。故最终的前处理条件为碱性甲醇直接提取。

2.2 实验结果讨论

2.2.1标准曲线回归方程与相关系数

将浓度为5.0、10.0、20.0、50.0和100.0μg/mL的系列标准工作溶液上机测定，以各目标物峰面积（y，mAU*min）为纵坐标，浓度（x，μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程和线性相关系数，具体结果见表2。由表2可知，在5.0g/mL~100.0μg/mL的范围内各化合物均呈现良好的线性关系。十种甜味剂的标准溶液色谱图见图4和图5。图4中，1瑞鲍迪苷A、2甜菊糖苷、3瑞鲍迪苷C、4杜克苷A、5甜茶苷、6瑞鲍迪苷B、7甜菊双糖苷、8甘草酸、9 18-α-甘草次酸、10 18-β-甘草次酸；图5中，1为甘草酸、2 为18-α-甘草次酸、3 为18-β-甘草次酸。

表2液相色谱法的线性方程与相关系数

Tab.2Thelinearequationandcorrelationcoefficientoftheliquidchromatography

按照本文的操作条件，甜菊糖苷、甜菊双糖苷、瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C，甜茶苷，杜克苷A的定量限为10.0mg/kg；甘草酸、18-α甘草次酸和18-β甘草次酸的定量限为5.0mg/kg。

2.2.2方法的回收率和精密度实验

以市售未添加甜菊糖和甘草酸的果蔬汁饮料、功能饮料、蛋白饮料、茶饮料为空白基质，进行高中低三个浓度水平，六个平行的加标回收和精密度实验。其中甜菊糖类加标水平为10、50、100mg/kg；甘草酸类加标水平为5、50、100mg/kg，回收率与精密度结果见表3。

表3回收率与精密度实验

Tab.3Therecoveryrateandtheprecisiontest

结果表明，本方法的回收率为80.3%~105.6%，变异系数≤6.0%，该方法准确度高，精密度满足要求。

对比例1

采用SNT3854-2014出口食品中天然甜味剂甜菊糖苷、甜菊双糖苷、甘草酸、甘草次酸的测定高效液相色谱法的方法，仅能检测出甜菊糖苷、甜菊双糖苷、甘草酸、甘草次酸，而本发明提供的方法以低的进样体积即可满足检测要求，且检测分析时间缩短，提高了检测效率，检出限低，应用范围广，且能检测出18-α-甘草次酸和18-β-甘草次酸。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种高效液相色谱法同时测定饮料中十种天然甜味剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）样品的前处理：称取样品5g，置于25mL具塞比色管中，用氨水调节至pH为8，加入20mL甲醇，涡旋震荡2min，混匀后超声提取15min，并用甲醇定容刻度，混匀后，转移至50mL具塞离心管中，以7500r/min离心5min，上清液经0.22μm有机相滤膜过滤；

（2）标准溶液的配制：准确称取甜菊糖苷、甜菊双糖苷、瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C，甜茶苷，杜克苷A，甘草酸、18-α-甘草次酸和18-β-甘草次酸标准品，用甲醇溶解，配制成浓度为1.0mg/mL的储备液，用甲醇稀释成浓度为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0μg/mL的系列标准工作溶液；

（4）样品分析：用高效液相色谱仪对样品进行分析检测；所述高效液相色谱仪的色谱柱为：YMC C30，柱长250mm，柱内径4.6mm，填料内径5μm；所述高效液相色谱的流动相A为乙腈，流动相B为体积分数0.2%磷酸溶液；

所述高效液相色谱的洗脱条件为：流速：1.0mL/min；进样量：10μL；检测波长：210nm和250nm；柱温：35℃；梯度洗脱条件如下：

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