CN108721634B - 一种双靶点dna纳米治疗体系的构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，特别是指一种双靶点DNA纳米治疗体系的构建方法及应用。将六条单链直链DNA溶于体外缓冲盐溶液中，退火自组装形成DNA四面体溶液；向5'端C6氨基修饰的ssDNA溶液中加入交联剂Sulfo‑SMCC粉末，室温反应2h，除未反应的交联剂，然后加入多肽粉末，室温反应12h，去除过量的多肽，即得ssDNA‑peptide；向DNA四面体溶液中加入ssDNA‑peptide，完成双靶点DNA纳米治疗体系的构建。本发明所构建的DNA四面体载体结构稳定，载体载药后可以提高多肽药物的稳定性，并且该双靶点DNA纳米治疗体系靶向性较强，主要通过调控细胞信号通路发挥生物治疗作用。

Description

一种双靶点DNA纳米治疗体系的构建方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别是指一种双靶点DNA纳米治疗体系的构建方法及应用。
背景技术
DNA纳米结构具有被动靶向进入病灶区域，克服多药耐药性，增加药物在靶细胞中的滞留时间等优点，而在众多DNA纳米结构中，DNA四面体合成方法简单，所用DNA材料较少，结构刚性较强，并且易于进行修饰。
Fas（CD95）为细胞表面Ⅰ型跨膜（TM）蛋白，是肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族中死亡受体（DR）家族的原型成员，其主要功能是通过特异性地与Fas配体（FasL）结合，进而通过调控相关信号通路而诱导肿瘤细胞凋亡。
研究发现，因癌细胞表面带负电的磷酯酰丝氨酸暴露增加，抗菌肽可以选择性地与癌细胞结合，O-糖基化黏蛋白表达水平的增加、膜电位负值增加、癌细胞膜流动性增加及细胞膜表面积的增加等都可能有助于这种选择性，研究表明来自人体的抗菌肽-LL-37对癌细胞具有较好的抑制作用，对LL-37的功能区进行研究后发现，LL-37的7-27位氨基酸残基通过破坏脂质双分子层结构来发挥其抗菌活性，LL-37多肽N末端1-12位残基对细菌或癌细胞无活性，而17-32位氨基酸残基形成的多肽-FK-16则保留了抗菌及抗癌活性。
将具有Fas配体活性片段的FAS多肽修饰至四面体结构上，通过FAS多肽与细胞膜表面的Fas受体特异性结合形成三聚体、六聚体等而激发Fas/FasL系统，从而激活相关信号通路进而诱导肿瘤细胞的凋亡；亦将同时具有可诱导细胞发生凋亡和自噬的功能性多肽FK-16引入该四面体以协同发挥更好的抗肿瘤作用。在FK-16多肽上修饰细胞穿膜肽（YGRKKRRQRRR）和MMP-2/9酶敏感肽链（PVGLIG）组成具有酶敏感和细胞渗透性的新的功能性多肽-TFM多肽，然后将TFM多肽修饰至四面体结构上。当该载药体系到达肿瘤细胞周围时，MMP-2/9酶敏感肽链可被肿瘤组织周围高分泌的MMP-2/9酶特异性地切断，从而释放出FK-16与细胞穿膜肽的偶联片段（TF多肽片段），在穿膜肽的作用下，TF多肽片段可成功进入细胞从而发挥其自噬与凋亡作用，进一步引起肿瘤细胞死亡。
发明内容
本发明提出一种双靶点DNA纳米治疗体系的构建方法及应用，解决传统药物递送系统存在的技术问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种双靶点DNA纳米治疗体系的构建方法，步骤如下：
（1）将六条单链直链DNA（S1-S6）溶于体外缓冲盐溶液中，退火自组装形成DNA四面体（TD）溶液；
（2）向5'端C6氨基修饰的ssDNA溶液中加入交联剂Sulfo-SMCC粉末，于pH7-9、磁力搅拌条件下，室温反应2h，经透析去除未反应的交联剂，可得ssDNA-SMCC，然后加入多肽粉末，于pH6.5-7.5、磁力搅拌条件下，室温反应12h，经透析去除过量的多肽，即得ssDNA-peptide产物；
（3）向步骤（1）得到的DNA四面体溶液中加入ssDNA-peptide，以2 min/℃的速度从40℃降至20℃，完成双靶点DNA纳米治疗体系的构建。
所述步骤（1）中六条单链直链DNA序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。
所述步骤（1）中体外缓冲盐溶液为pH8.0的10mM Tris∙HCl和5mM MgCl2溶液。
所述步骤（1）中退火条件为95℃保持5min，10s内由95℃降温至4℃，4℃保持30s。
所述步骤（1）中DNA四面体的平均粒径为8-12nm。
所述步骤（2）中5'端C6氨基修饰的ssDNA为SSDNA-FAS、SSDNA-TFM或二者的混合物，其中ssDNA-FAS（ssDNA-A）序列如SEQ ID NO：7所示，ssDNA-TFM（ssDNA-T）序列如SEQ IDNO：8所示，ssDNA的物质的量浓度为0.5μΜ，ssDNA：Sulfo-SMCC的物质的量比为1:110。
所述步骤（2）中多肽为FAS多肽、TFM多肽或二者的混合物，FAS多肽序列如SEQ IDNO：9所示，TFM多肽序列如SEQ ID NO：10所示，ssDNA-SMCC与多肽的物质的量比为1:10。
所述步骤（3）中DNA四面体：ssDNA-peptide的物质的量比为1:1。
所述的双靶点DNA纳米治疗体系在靶向肿瘤治疗中的应用。
本发明的有益效果在于：
1. 本发明所构建的DNA四面体载体结构稳定，合成方法简单，用它作为载体可以通过控制靶头之间的距离、空间位置及立体位置等而实现药物精准治疗的目的。
2. 本发明中的FAS多肽是一种靶向性多肽，游离的FAS多肽虽然可以与细胞表面的Fas受体结合，但它结合后并不能激活下游细胞信号通路，因此对肿瘤细胞不具有杀伤作用；但如果FAS多肽和细胞表面的Fas受体结合形成三聚体、六聚体等就可以成功激活下游细胞信号通路，进而引起肿瘤细胞凋亡，故本发明中的DNA四面体作为载体，既可以控制连接FAS多肽的数量又可以控制它们之间的间隔距离，从而可以更好地实现治疗的目的。
3. 本发明中的TFM多肽由三部分组成，分别为细胞穿膜肽片段、FK-16片段及酶敏感肽片段，其中FK-16片段是发挥生物治疗作用的功能性片段，它需要进入细胞内才能发挥其作用，但在正常情况下FK-16很难入胞，并且稳定性较差。将FAS多肽及TFM多肽连接至DNA四面体结构后，在靶向性FAS多肽的帮助下，治疗体系可以顺利靶向至肿瘤组织周围，而肿瘤组织周围高分泌的MMP-2/9酶可以特异性地识别并切割酶敏感肽链，将FK-16和细胞穿膜肽的偶联片段从四面体结构上解脱下来，然后在细胞穿膜肽的作用下FK-16可以快速高效地进入细胞内，进而作用于细胞凋亡和自噬相关信号通路。
4. 本发明所构建的双靶点DNA纳米治疗体系可以同时作用于细胞凋亡和细胞自噬，是一种较好的生物治疗手段，可避免传统化学治疗的毒副作用，有望成为一种新的治疗方法应用于临床肿瘤治疗。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例一种双靶点DNA纳米治疗体系的构建方法：
（1）DNA四面体的合成：
将合成DNA四面体所需的六条单链S1、S2、S3、S4、S5、S6等摩尔混合，并加入Tris∙HCl（pH 8.0）和MgCl2缓冲液，使单链终浓度为0.5μΜ，Tris∙HCl（pH 8.0）终浓度为10mM，MgCl2终浓度为5mM，低速涡旋使其混合均匀。将样品置于PCR仪中，先于95℃变性5min后，迅速降温至4℃并保持30s。空白DNA四面体合成，4℃保存。
（2）ssDNA-peptide的合成
向5'端C6氨基修饰的ssDNA溶液加入交联剂Sulfo-SMCC粉末，使两者物质的量比为1:110，pH7~9，磁力搅拌下，室温反应2h，透析24h除去过量的Sulfo-SMCC，可得ssDNA-SMCC；然后向ssDNA-SMCC溶液中加入多肽粉末，使两者物质的量比为1:10，pH6.5~7.5，磁力搅拌下室温反应12h，透析24h去除过量的多肽，即可得ssDNA-peptide产物，4℃保存。依照此方法可合成ssDNA-FAS、ssDNA-TFM、ssDNA- MFT，MFT的多肽序列为TFM多肽的反向序列。
（3）双靶点DNA纳米治疗体系前体的合成
将合成双靶点DNA纳米治疗体系前体所需的ssDNA等摩尔混合，并加入Tris∙HCl（pH 8.0）和MgCl2缓冲液，使单链终浓度为0.5μΜ，Tris∙HCl（pH 8.0）终浓度为10mM，MgCl2终浓度为5mM，低速涡旋使其混合均匀。将样品置于PCR仪中，先于95℃变性5min后，迅速降温至4℃并保持30s，双靶点DNA纳米治疗体系前体合成。
用S1-A、S2-A、S3、S4、S5、S6制备修饰有2个FAS多肽的DNA四面体前体（TD-2A）；用S1-A、S2-A、S3-A、S4、S5、S6制备修饰有3个FAS多肽的DNA四面体前体（TD-3A）；用S1-A、S2-A、S3-A、S4-A、S5、S6制备修饰有4个FAS多肽的DNA四面体前体（TD-4A）；用S1-A、S2-A、S3-A、S4-A、S5-A、S6制备修饰有5个FAS多肽的DNA四面体前体（TD-5A）；用S1-A、S2-A、S3-A、S4-A、S5-A、S6-A制备修饰有6个FAS多肽的DNA四面体前体（TD-6A）；用S1-T、S2-A、S3-A、S4-A、S5-A、S6-A制备修饰有1个TFM多肽和5个FAS多肽的DNA四面体前体（TD-1T5A）；用S1-T、S2-T、S3-A、S4-A、S5-A、S6-A制备修饰有2个TFM多肽和4个FAS多肽的DNA四面体前体（TD-2T4A）；用S1-T、S2-T、S3-A、S4-T、S5-A、S6-A制备修饰有3个TFM多肽和3个FAS多肽的DNA四面体前体（TD-3T3A）；用S1-T、S2-T、S3-T、S4-T、S5-A、S6-A制备修饰有4个TFM多肽和2个FAS多肽的DNA四面体前体（TD-4T2A）。
注：S1-A、S2-A、S3-A、S4-A、S5-A、S6-A的序列为分别在六条单链S1、S2、S3、S4、S5、S6的3’端加上与FAS多肽结合的粘性末端“-TATTAATGCTTGCACGCGTGC-”；
S1-T、S2-T、S3-A、S4-T、S5-T、S6-T的序列为分别在六条单链S1、S2、S3、S4、S5、S6的3’端加上与TFM多肽结合的粘性末端“-TATTAATTAGTTGGAAATGGCGGTATGG-”
（4）双靶点DNA纳米治疗体系的合成
向已构建好的双靶点DNA纳米治疗体系前体中加入等摩尔量的ssDNA-peptide，从40 ℃开始，以2 min/℃的速度降温至20 ℃。双靶点DNA纳米治疗体系即构建完成，4 ℃保存
效果实施例1：实施例1的琼脂糖凝胶电泳表征：
称取0.60g琼脂糖粉末于100mL锥形瓶中，加入20mL的1×TAE电泳液，用微波炉加热煮沸2min使琼脂糖粉末完全溶解均匀，取出锥形瓶，待溶液冷却至80℃左右后加入1.3μL的EB（溴化乙锭）溶液，混匀后倒入模具中，插入梳子，室温冷却35min，即得3%的琼脂糖凝胶。将制得的琼脂糖凝胶转移至水平电泳槽中，加入新鲜配制的1×TAE电泳液使各个加样孔中均充满电泳液，并确保电泳液液面高出琼脂糖凝胶2-3mm。将样品与6×Loadingbuffer按照5:1的比例混匀后加入各加样孔中，冰浴条件下，以100V的电压电泳1h。结果显示空白DNA四面体（TD）的迁移速率最快。随着FAS多肽修饰数量的增加，FAS多肽靶向四面体的迁移速率逐渐减慢，其中TD-2A的迁移速率最快，TD-6A的迁移速率最慢。TFM多肽的分子量（4227）大于FAS多肽（3555），故修饰有1个TFM多肽和5个FAS多肽的靶向DNA四面体的迁移速率比修饰6个FAS多肽的靶向DNA四面体慢，但要稍快于修饰有4个TFM多肽和2个FAS多肽的靶向DNA四面体，各结构之间的迁移速率差别表明成功合成了双靶点DNA纳米治疗体系的结构。
效果实施例2：实施例1中ssDNA-peptide的SDS-PAGE电泳表征：
按照要求安装好垂直电泳装置，检漏10min后，配制7mL 20%的分离胶（30%丙烯酰胺4.76mL，纯化水0.28mL，1.5M Tris∙HCl（pH 8.8）1.82mL，10%SDS 70μL，10%过硫酸铵70μL，TEMED 4.2μL），将分离胶注入两块玻璃板中间，并用纯化水进行液封，室温聚合40min。弃去上层纯化水后，注入配制好的5%浓缩胶（30%丙烯酰胺0.5mL，纯化水2.1mL，1M Tris∙HCl（pH 6.8）0.38mL，10%SDS 30μL，10%过硫酸铵30μL，TEMED 3μL），插入梳子后，室温聚合35min。待凝胶完成后，将玻璃板转移至电泳槽中，加入适量1×SDS-PAGE电泳液，拔出梳子，将样品与4×蛋白质上样缓冲液按照3:1的比例进行混合，混合均匀后加入各加样孔中，80V进行电泳，待样品跑至分离胶与浓缩胶交界处时，调节电压至120V，继续电泳1h。电泳结束后，撬开玻璃板，取出凝胶，将凝胶置于考马斯亮蓝染色液中，于摇床上以50 rpm的速度震摇1h，染色结束后，取出凝胶置于脱色液中，于摇床上进行脱色，每半个小时更换一次脱色液，直至凝胶上条带清晰为止。游离MFT与TFM多肽的分子量为4227.18，FAS多肽的分子量为3555，ssDNA-TFM偶联物的分子量约为10676，ssDNA-FAS偶联物的分子量约为8000，电泳结果显示多肽连接至ssDNA之后，迁移速率变慢且条带位置与理论分子量基本一致，表明ssDNA-peptide偶联成功。
效果实施例3：实施例1的载体结构的考察:
（1）透射电子显微镜考察：
将所得的DNA四面体溶液用超滤管纯化后稀释至适宜浓度，用乙酸双氧铀溶液染色后，使用透射电子显微镜进行拍摄。图像中可以观察到三角形框架结构且大小与理论值（边长为10nm）一致，结果表明DNA四面体结构可以成功合成。
（2）原子力显微镜考察：
将合成的DNA四面体溶液用超滤管纯化后稀释至适宜浓度，用原子力显微镜在液相模式下进行扫描拍摄。图像中可以观察到三角形结构且大小与理论大小（边长为10nm）基本一致，结果表明可以成功合成DNA四面体结构。
效果实施例4：实施例1双靶点DNA纳米治疗体系的体外抗肿瘤作用考察：
利用CCK-8法考察游离多肽药物、DNA四面体载体及连接不同种类及数量多肽的DNA纳米治疗体系在不同浓度下对HT-29细胞（结肠癌细胞）的增值抑制作用。实验结果表明，与游离多肽相比，在同一浓度下，修饰至DNA四面体载体上的多肽对HT-29细胞的抑制作用更强。将多肽连接至四面体后可大大降低其有效作用浓度。修饰有不同数量FAS多肽和MFT、TFM多肽的双靶点DNA纳米治疗体系对细胞的抑制作用也不同，尤其是在多肽浓度为2μM和5μM时，各组抑制率差别较大，其中TD-3T3A组和TD-3M3A组对细胞的抑制作用最强。结果表明将多肽连接至四面体形成双靶点DNA纳米治疗体系后可大大降低多肽药物的有效作用浓度。
效果实施例5：实施例1双靶点DNA纳米治疗体系的定量摄取：
用流式细胞仪检测HT-29细胞和Ges-1细胞对双靶点DNA纳米治疗体系的摄取效果。结果表明在HT-29细胞中，细胞对TFM多肽组和TD-3T3A组的摄取量要远远高于对游离FK-16多肽的摄取量，体现了细胞穿膜肽的作用；并且随着孵育时间的延长，HT-29对各组药物的摄取量逐渐增加，当药物与细胞共同孵育4小时后，TD-3T3A组的摄取量是游离TFM多肽组摄取量的3.42倍。而在Ges-1细胞中，随着孵育时间的延长，细胞对多肽的摄取稍有增加，但各个时间点FK-16组、TFM多肽组及TD-3T3A制剂组之间的摄取差距并不明显，并且效果远不及同等实验条件下HT-29细胞对多肽药物的摄取。对比HT-29细胞及Ges-1细胞对多肽药物的定量摄取结果可以看出，本发明所构建的双靶点DNA纳米治疗体系对结肠癌细胞具有较强的靶向作用。
效果实施例6：实施例1双靶点DNA纳米治疗体系对HT-29细胞凋亡影响的考察：
利用ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测双靶点DNA纳米治疗体系对HT-29细胞凋亡的影响。结果显示与HT-29细胞作用48h后，游离FAS多肽将细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率分别增加至3.55%和14.5%，其主要增加的是细胞的晚期凋亡率；游离TFM多肽组细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率分别为2.87%和20.3%，主要提高了细胞的晚期凋亡率。多肽连接至不同的DNA纳米治疗体系后，均显著地提高了细胞的晚期凋亡率，其中TD-3T3A组的晚期凋亡率最高，为61.7%；各组的早期凋亡率均在10%以下，且各组差别不大；与游离FAS多肽相比，将其连接至DNA四面体上后，细胞坏死率有所增加，实验组中TD-1T5A组细胞坏死率最大，为17.2%，其他各组细胞坏死率均在10%以下。结果表明，FAS多肽主要引起细胞的晚期凋亡和坏死，TFM多肽主要增加了细胞的早期凋亡和晚期凋亡，当两种多肽连接至DNA四面体载药体系后，主要增加了细胞的晚期凋亡率，其中TD-3T3A实验组效果最佳，凸显了其作为纳米载药体系的优势。
效果实施例7：实施例1双靶点DNA纳米治疗体系对HT-29细胞自噬影响的考察：
使用吖啶橙染色液对细胞进行染色，利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对细胞自噬情况进行观察和检测，自噬过程中产生的酸性细胞器经吖啶橙染色液染色后可发出红色荧光，而核仁和细胞质则呈现绿色荧光。
定性自噬检测结果显示未经药物处理的对照组细胞呈现较亮的绿色荧光，用游离TFM多肽处理后的细胞中有红色荧光出现，说明产生了酸性细胞器，而用TD-3T组制剂处理过的细胞周围出现较多较强的红色荧光。以上结果说明将TFM多肽偶联至DNA四面体结构上后，可以提高药物对细胞的自噬作用。
定量自噬检测结果显示游离TFM多肽可以引起HT-29细胞25%的自噬比例，说明载体中引入的FK-16功能性多肽确实可以影响HT-29细胞的自噬；将TFM多肽连接至DNA四面体上后可以引起更大比例的细胞自噬，TD-3T组细胞自噬的比例为46.4%。上述结果说明本发明所构建的双靶点DNA纳米治疗体系会提高HT-29细胞的自噬比例。
自噬在肿瘤细胞中扮演着双重角色，发挥着促进或抑制肿瘤细胞增殖的作用，为验证本发明中FK-16功能片段诱导的自噬是否能引起自噬性细胞死亡，选用3-MA作为自噬抑制剂进行相关自噬抑制实验，实验结果表明在自噬抑制剂3-MA的作用下，游离TFM多肽及TD-3T对HT-29细胞的增殖抑制作用均有显著地降低，该结果说明TFM多肽中的FK-16功能性片段引起的自噬可以诱导自噬性细胞死亡。
效果实施例8：实施例1双靶点DNA纳米治疗体系对HT-29细胞信号通路影响的考察：
本发明构建的双靶点DNA纳米治疗体系主要通过调控相关细胞信号通路发挥作用，通过免疫印迹（Western Blot）实验检测信号通路中相关蛋白的表达，结果表明，与对照组相比，TD-3A组和TD-3T3A组均可以引起HT-29细胞中Caspase-8蛋白表达增加，尤其是TD-3T3A组的效果更加明显，而TD-3T组则无此效果，这说明在四面体上修饰FAS多肽以后可以诱导Caspase-8蛋白的表达增加，进而通过激活Fas/FasL系统而诱导细胞凋亡。在同等实验条件下，TD-3T及TD-3T3A组可以明显诱导HT-29细胞中p53蛋白、ATG-5蛋白和ATG-7蛋白表达增加，而TD-3A组则无明显变化；Bax蛋白在TD-3T及TD-3T3A组制剂的作用下其表达量也有明显增加，而在同样条件下Bcl-2蛋白的表达则呈现下调趋势。用不含TFM多肽的制剂对HT-29细胞加药处理后，核蛋白中无明显的AIF和EndoG蛋白表达，而用TD-3T及TD-3T3A组制剂对HT-29细胞处理后可以检测到较高的AIF和EndoG蛋白表达量，以TD-3T3A组更为明显。以上结果说明TFM多肽主要是通过激活p53-Bax/Bcl-2通路而引起AIF/EndoG依赖性凋亡和自噬性细胞死亡而发挥其抗肿瘤作用的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 郑州大学
<120>一种双靶点DNA纳米治疗体系的构建方法及应用
<160> 10
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（32）
<400> 1
gtctgaggca gttgagagat ctcgaacatt cc 32
<210> 2
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（61）
<400> 2
taagtctgaa gatccattta tcaccagctg ctgcacgcca tagtagacgt atcacctgtc 60
c 61
<210> 3
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（93）
<400> 3
agctacttgc tacacgagga tcttcagact taggaatgtt cgagatcaca tgcgaggact 60
cggtccaata ccgtactaac gattacagat caa 93
<210> 4
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（61）
<400> 4
cagctggtga taaaacgtgt agcaagtagc tttgatctgt aatcgactct acgggaagag 60
c 61
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（32）
<400> 5
atgcccatcc ggctcactac tatggcgtgc ag 32
<210> 6
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（93）
<400> 6
cgagtcctcg catgactcaa ctgcctcaga cggacaggtg atacgagagc cggatgggca 60
tgctcttccc gtagagacgg tattggacat gat 93
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（15）
<400> 7
mgcacgcgtg caagc 15
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（22）
<400> 8
mccataccgc catttccaac ta 22
<210> 9
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)...(31)
<400> 9
Cys Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Val Asn Phe Glu Glu Ser Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu
20 25 30
<210> 10
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)...(34)
<400> 10
Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Tyr Phe Lys Arg Ile Val
1 5 10 15
Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Gly Ile Leu Gly Val
20 25 30
Pro Cys
34

Claims (8)

1.一种双靶点DNA纳米治疗体系的构建方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将六条单链直链DNA溶于体外缓冲盐溶液中，退火自组装形成DNA四面体溶液；
（2）向5'端C6氨基修饰的ssDNA溶液中加入交联剂Sulfo-SMCC粉末，于pH7-9、磁力搅拌条件下，室温反应2h，经透析去除未反应的交联剂，可得ssDNA-SMCC，然后加入多肽粉末，于pH6.5-7.5、磁力搅拌条件下，室温反应12h，经透析去除过量的多肽，即得ssDNA-peptide产物；
（3）向步骤（1）得到的DNA四面体溶液中加入ssDNA-peptide，以2 min/℃的速度从40℃降至20℃，完成双靶点DNA纳米治疗体系的构建；
所述步骤（1）中六条单链直链DNA序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。
2.如权利要求1所述的双靶点DNA纳米治疗体系的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中体外缓冲盐溶液为pH8.0的10mM Tris∙HCl和5mM MgCl2溶液。
3.如权利要求1所述的双靶点DNA纳米治疗体系的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中退火条件为95℃保持5min，10s内由95℃降温至4℃，4℃保持30s。
4.如权利要求1所述的双靶点DNA纳米治疗体系的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中DNA四面体的平均粒径为8-12nm。
5.如权利要求1所述的双靶点DNA纳米治疗体系的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中5'端C6氨基修饰的ssDNA为ssDNA-FAS、ssDNA-TFM或二者的混合物，其中ssDNA-FAS序列为SEQ ID NO：7所示，ssDNA-TFM序列为SEQ ID NO：8所示，ssDNA的物质的量浓度为0.5μΜ，ssDNA：Sulfo-SMCC的物质的量比为1:110。
6.如权利要求1所述的双靶点DNA纳米治疗体系的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中多肽为FAS多肽、TFM多肽或二者的混合物，FAS多肽序列为SEQ ID NO：9所示，TFM多肽序列为SEQ ID NO：10所示，ssDNA-SMCC与多肽的物质的量比为1:10。
7.如权利要求1所述的双靶点DNA纳米治疗体系的构建方法，其特征在于：所述步骤（3）中DNA四面体：ssDNA-peptide的物质的量比为1:1。
8.如权利要求1-7任一项所述的双靶点DNA纳米治疗体系在制备用于靶向肿瘤治疗的药物试剂中应用。
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