CN108721327A - 实验动物视网膜色素变性试验模型的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种实验动物视网膜色素变性试验模型的制备方法,是将碘酸钠溶液通过玻璃体腔注射给予实验动物,碘酸钠的给药剂量为0.4~1.2mg/眼。本发明的方法具有以下优点:1)碘酸钠用量小,直接作用于视网膜局部,无全身暴露,避免了实验动物因暴露量太大导致的动物全身的损害或动物死亡;2)不需要外科手术操作,降低实验操作难度,减少对动物的手术损伤;3)可以根据实际需要选择单侧或双侧造模。
Description
技术领域
本发明属于医药研究的非临床研究领域,特别是涉及医药实验室科研活动中一种视网膜色素变性试验模型的制备方法,以及治疗手段的临床前评价及相关研究。
背景技术
视网膜色素变性是一种遗传性、营养不良性退行性眼底病变现象,主要表现为慢性进行性视野缺失、夜盲、色素性视网膜病变和视网膜电图异常等。视网膜色素上皮细胞的功能障碍或丧失被认为是该疾病的发展过程中的关键因素。因此,设计一种理想的动物试验模型,对视网膜色素变性的相关机制研究和教学演示具有重大意义。
碘酸钠是一种强氧化剂,作用在视网膜局部可引起蛋白质变性,阻断视网膜色素上皮糖代谢相关酶的活性,从而减弱视网膜色素上皮细胞和感光细胞间的粘附,最终引起视网膜色素上皮细胞和感光细胞的功能丧失。现有的在兔模型制备方式中,以耳缘静脉注射碘酸钠的造模方式为主。王凯等(2008)以40mg/kg的剂量耳缘静脉注射给予青紫兰兔造模,王立春等(2015)分别以15、25、35mg/kg的剂量耳缘静脉注射给予青紫兰兔造模。通过该方式给予碘酸钠,视网膜局部的暴露量相对较低,往往会由于较大的系统暴露量引起动物全身的损害,甚至动物死亡,且由于动物个体代谢差异,到达视网膜局部的药量,也很难达到一致,对后续的动物实验带来不利影响。计江东等(2014)通过颈动脉注射给药方式在非人灵长类动物进行造模,姜来生等(2017)通过颈动脉注射给药方式在青紫蓝兔进行造模。上述给药方式避免了较大的系统暴露量,但该给药方式需要对动物进行手术,分离出颈动脉,对动物局部的损伤大,操作难度高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于,提供一种实验动物视网膜色素变性试验模型的制备方法,一方面能够避免外科手术,减少对实验动物带来的手术损伤,降低实验操作难度;另一方面能够降低动物的全身暴露量,避免实验动物死亡,提高实验动物福利。
为解决上述技术问题,本发明提供的技术方案为:一种实验动物视网膜色素变性试验模型的制备方法,是将碘酸钠溶液通过玻璃体腔注射给予实验动物,碘酸钠的给药剂量为0.4~1.2mg/眼。
具体的,所述实验动物为动物实验用兔;优选为新西兰大白兔。
优选为,给药剂量为0.6~0.8mg/眼;更优选为,给药剂量为0.8mg/眼。
具体的,碘酸钠的浓度为6~30mg/mL,碘酸钠溶液的注射体积为40~60μL/眼。
优选为,碘酸钠的浓度为8~24mg/mL,碘酸钠溶液的注射体积为50μL/眼。
具体的,给药后,连续3天使用抗生素对动物眼球进行护理。
具体的,造模后4、14、21和28天分别对动物进行眼科检查随访,包括视网膜电图(ERG)、眼底照相(FP)、光学相干断层扫描(OCT)。
本发明的方法具有以下技术优势:1)碘酸钠用量小,直接作用于视网膜局部,无全身暴露,避免了实验动物因暴露量太大导致的动物全身的损害或动物死亡;2)不需要外科手术操作,降低实验操作难度,减少对动物的手术损伤;3)可以根据实际需要选择单侧或双侧造模。
附图说明
图1为兔造模后4天、14天、21天、28天视网膜电图(ERG),其中,a为造模剂量0.2mg/眼;b为造模剂量0.8mg/眼。
图2为兔0.8mg/眼碘酸钠造模后4天、14天、21天、28天光学相干断层扫描(OCT)结果图。
图3为兔0.8mg/眼碘酸钠造模后4天、14天、21天、28天眼底照相(FP)结果图。
图4为兔的视网膜组织病理学H.E染色图,其中,a为0.2mg/眼,目镜10倍;b为0.8mg/眼,目镜10倍;c为0.4mg/眼,目镜20倍;d为0.4mg/眼,目镜20倍。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述,显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
一、试验主要试剂:
造模剂:碘酸钠(Sigma公司,批号MKBX1332V)
二、主要仪器
罗兰电生理诊断系统(ROLAND)、激光眼科诊断仪(Heidelberg)、眼底照相及造影系统(康华瑞明)。
三、实验动物
新西兰大白兔购于邳州市东方养殖有限公司;6只,4-7月龄,体重4.2~4.6kg。
(1)动物饲养与管理
动物饲养与管理按照苏州药明康德新药开发股份有限公司的SOP执行,同时遵循相关的指南和准则。江苏省科技厅批准实验动物的使用,实验动物使用许可证号:SYXK(苏)2014-0016。
动物饲养于具有环境控制的普通级动物房,不锈钢笼具,单笼饲养,通风良好,除了需要禁食的情况外,动物自由摄食和饮水。动物房室温控制在16-22℃,相对湿度控制在40-70%,光照12小时明暗交替。
(2)动物福利
涉及到动物管理和使用的操作,在开始前均已通过苏州药明康德新药开发股份有限公司动物管理和使用委员会(IACUC)的审核与批准。试验过程中兽医技术员监督试验中动物福利问题。
四、试验方法
对玻璃体腔注射给予碘酸钠诱导新西兰大白兔视网膜色素变性,具体步骤为:
6只新西兰大白兔分为3组,每组2只,单眼注射,碘酸钠浓度为分别为4、8、16mg/mL,注射体积50μL,给药剂量分别为0.2、0.4、0.8mg/眼。
实验前先将动物麻醉,固定于操作台,眼部消毒后,用开睑器开睑,充分暴露眼球。用镊子固定眼球位置,在颞下方5~7点方向角巩膜缘后3~4mm处进针,缓慢注入碘酸钠溶液,停留一定时间拔针,10~20秒。立即用沾有碘伏的棉签头压迫注射点,约10秒。动物苏醒后,连续3天使用抗生素对动物眼球进行护理。进针时注意避开眼部血管、不要伤及晶体后囊和视网膜,
造模后4、14、21和28天分别对动物进行眼科检查随访,包括视网膜电图(ERG)、眼底照相(FP)、光学相干断层扫描(OCT)。随访结束后,动物安乐死,取眼球做组织病理学检查。
五、试验结果
(1)视网膜电图(ERG):结果见图1。
视网膜电图(ERG)结果显示,注射碘酸钠后Day 4,视网膜电流图暗适应0.01、3.0和10.0刺激强度下a波和/或b波振幅均明显下降,在0.8mg/眼剂量,波形呈熄灭型。Day14、21和28的随访检查中,在0.2mg/眼剂量,可见逐步恢复;在0.8mg/眼剂量,波形仍呈熄灭型。
(2)光相干断层扫描(OCT):结果见图2。
光相干断层扫描(OCT)结果显示,在0.8mg/眼剂量,注射碘酸钠后Day 4,可见全层视网膜有高反射信号及中度水肿,并且在部分视网膜可见内界膜从视网膜神经纤维层脱离;Day14、21和28的随访检查中,在0.8mg/眼剂量,继内层视网膜脱离后,外层视网膜的破坏则继续,呈现萎缩状态,未见恢复。在0.2和0.4mg/眼剂量,随访期间则均未见明显的结构异常。
(4)眼底照相:结果见图3。
眼底照相结果显示,注射碘酸钠后Day 14,在0.8mg/眼剂量,可见脉络膜和视网膜血管的减少及萎缩,Day 21和28的随访检查中,在0.8mg/眼剂量,上述异常继续进展。在0.2和0.4mg/眼剂量,随访期间则均未见明显的结构异常。
(5)组织病理学结果:结果见图4。
视网膜HE染色结果显示,在0.2mg/眼剂量,未见视网膜变性改变;在0.4mg/眼剂量,可见轻度至中度视网膜变性;在0.8mg/眼剂量,可见中度至重度视网膜变性。
六、结论
以上结果表明,将碘酸钠按0.8mg/眼的剂量注入兔玻璃体腔内,可快速作用于动物视网膜,破坏视网膜色素上皮,造成兔视网膜功能和结构的损伤,可建立稳定的兔视网膜色素变性疾病模型。
综上所述,上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种实验动物视网膜色素变性试验模型的制备方法,其特征在于,将碘酸钠溶液通过玻璃体腔注射给予实验动物,碘酸钠的给药剂量为0.4~1.2mg/眼。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述实验动物为动物实验用兔。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述实验动物为新西兰大白兔。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,给药剂量为0.6~0.8mg/眼。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,给药剂量为0.8mg/眼。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,碘酸钠的浓度为6~30mg/mL,碘酸钠溶液的注射体积为40~60μL/眼。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,碘酸钠的浓度为8~24mg/mL,碘酸钠溶液的注射体积为50μL/眼。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,给药后,连续3天使用抗生素对动物眼球进行护理。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,造模后4、14、21和28天分别对动物进行眼科检查随访,眼科检查随访包括视网膜电图、眼底照相、光学相干断层扫描。
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