CN108721263A

CN108721263A - 马普替林作为可溶性鸟苷酸环化酶激动剂的应用

Info

Publication number: CN108721263A
Application number: CN201710266448.1A
Authority: CN
Inventors: 李洪林; 朱丽丽; 童依; 焦茜; 吕剑昆; 王霞; 王蕊; 赵振江
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2017-04-21
Filing date: 2017-04-21
Publication date: 2018-11-02
Anticipated expiration: 2037-04-21
Also published as: CN108721263B

Abstract

本发明涉及作为新型可溶性鸟苷酸环化酶激动剂的马普替林及其应用。具体而言，本发明涉及马普替林在制备治疗可溶性鸟苷酸环化酶介导的疾病或激动可溶性鸟苷酸环化酶的药物中的用途。所述可溶性鸟苷酸环化酶介导的疾病包括但不限于：心血管疾病、肾病、糖尿病、青光眼、肥胖、骨质疏松、纤维变性病症、泌尿系统病症、炎性病症及神经病症；特别是肺动脉高压。

Description

马普替林作为可溶性鸟苷酸环化酶激动剂的应用

技术领域

本发明涉及医学和药学领域；具体地说，本发明涉及马普替林作为可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的激动剂，尤其是其在治疗肺动脉高压中的应用。

背景技术

肺动脉高压(Pulmonaryhypertention，PAH)是由多种病因引起的肺动脉压力和肺血管阻力升高，进而促进血管收缩、血管壁增生、血管重塑和原位血栓的形成等，最终导致右心衰竭直至死亡的一种进行性疾病。其血流动力学诊断标准为海平面静息状态下，右导管检测肺动脉平均压力≥25mmHg。虽然PAH属于罕见病，但它的危害性较大，已成为严重威胁人类身心健康的公共卫生保健问题。PAH根据发病因素的不同可分为五类：1)特发性肺动脉高压；2)遗传性肺动脉高压；3)药物/毒物诱导的肺动脉高压；4)相关性肺动脉高压；5)新生儿持续性肺动脉高压。PAH的发病机制主要包括内皮细胞功能紊乱、平滑肌细胞增生、肺动脉血管重塑、血管内膜纤维化等，其临床表现为呼吸困难、心绞痛、晕厥等症状。

最初，治疗PAH的方式是传统疗法，包括的药物有利尿剂、抗凝剂、钙通道阻滞剂等，该类药物在一定程度上能够缓解患者的临床症状，却无法延迟PAH的发病进程；随着对PAH发病机制的深入了解，新型治疗方式不断被发掘，而在1995年获美国FDA批准的依前列醇拉开了PAH靶向治疗的帷幕，患者服用该类药物后，不仅临床症状得到明显改善，存活率也大大提高。目前，靶向PAH的治疗途径主要包括三条：前列腺素途径、一氧化氮(NO)途径和内皮素-1(ET-1)途径。基于这三条途径，一系列靶向治疗药物被研发，目前已有10个药物上市，包括依前列醇(Epoprostenol)、曲前列尼尔(Treprostinil)、伊洛前列素(Iloprost)、利奥西呱(Riociguat)、西地那非(Sildenafil)、他达那非(Tadalafil)、波生坦(Bosentan)、安立生坦(Ambrisenta)、马西替坦(Macitentan)和Selexipag，这些药物主要是通过恢复血管内皮对肺血管紧张度和结构来实现对PAH的治疗作用。然而在PAH的治疗进程中，体内NO的含量与肺部通气灌注的比例息息相关，其含量的高低会导致血管的舒张或收缩，与NO协同发挥作用的药物有利于平衡肺部通气灌注的比例并促进血管的舒张；相比之下，非选择性血管舒张剂、前列环素类似物和内皮素受体拮抗剂却无法维持通气灌注比例的平衡，其比例的失调可能会引发PAH及肺部相关疾病。因此，基于NO信号通路，开发靶向治疗PAH的药物具有重要意义。

NO-sGC-cGMP信号转导通路对于心血管系统的多种生理调控具有至关重要的作用。NO由内皮系统中的一氧化氮合成酶(Nitric OxideSynthase，NOS)催化L-精氨酸分解产生，可通过脂质双分子层扩散至邻近的平滑肌细胞，并与其受体蛋白sGC(可溶性鸟苷酸环化酶)结合，激活sGC，进而催化GTP转化为cGMP。cGMP作为细胞内的第二信使，通过调节下游的效应器包括蛋白激酶G、cGMP依赖的磷酸二酯酶及cGMP门控离子通道等，促进血管舒张、抑制平滑肌细胞的增殖与血小板的聚集、预防纤维化等生理途径。而一旦该通路发生紊乱，将会引发一系列疾病，包括肺动脉高压、动脉粥样硬化、心力衰竭及神经退行性疾病等。吸入NO或服用NO供体药物如硝酸甘油等有机硝酸盐可增加体内NO的含量，但其作用时间较短，易产生耐受性，不适用于PAH的长期治疗；Sildenafil可以通过抑制PDE-5的活性防止cGMP的降解，并已被批准用于治疗PAH，但Sildenafil的活性取决于完整的NO-sGC-cGMP通路，且其功效可能受限于NO的水平；经研究发现，靶向于NO信号通路中的sGC，可成为一类新型的PAH治疗靶标，且其不受限于NO的水平。因此，筛选能够直接激活sGC的激动剂可为该疾病的治疗药物的研发提供思路。

sGC作为NO-sGC-cGMP信号通路中的关键金属酶，广泛分布于哺乳动物的细胞溶质内，其含有一个b型血红素，并且由α和β两个亚基组成了异源二聚体；人源型α1和β1亚基分别含有690和619个氨基酸残基，每个亚基均可分为3个结构域：N-端的血红素结构域、中间的二聚结构域和C-端的催化结构域。sGC激动剂直接作用于sGC，可激活sGC合成第二信使cGMP；接着，cGMP结合并激活cGMP依赖性蛋白激酶G，调节胞质钙离子浓度，从而使肌动蛋白-肌球蛋白收缩性脱敏并诱导血管舒张。

目前，sGC作为肺动脉高压的治疗靶标，其激动剂只有利奥西呱批准上市，但肺动脉高压是进行性疾病，其治疗药物需不断研发。因此，研究开发高效的sGC激动剂具有重要的学术价值与现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供具有sGC激动活性的新药物，从而为研究和开发新型可溶性鸟苷酸环化酶激动剂以及进一步的，治疗肺动脉高压的药物提供物质基础。

在第一方面，本发明提供式Ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防可溶性鸟苷酸环化酶介导的疾病或制备激动可溶性鸟苷酸环化酶的药物中的用途：

在具体的实施方式中，所述可溶性鸟苷酸环化酶介导的疾病包括但不限于：心血管疾病、肾病、糖尿病、青光眼、肥胖、骨质疏松、纤维变性病症、泌尿系统病症、炎性病症及神经病症。

在具体的实施方式中，所述心血管疾病是肺动脉高压。

在第二方面，本发明提供一种体外激动可溶性鸟苷酸环化酶的方法，所述方法包括利用式I所示化合物或其药学上可接受的盐，或包含式I所示化合物或其药学上可接受的盐的试剂在体外激动可溶性鸟苷酸环化酶：

在优选的实施方式中，所述体外激动可溶性鸟苷酸环化酶的方法是非治疗目的的。

在第三方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物含有式I所示化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体或赋形剂，所述药物组合物用于治疗或预防可溶性鸟苷酸环化酶介导的疾病或激动可溶性鸟苷酸环化酶。

在具体的实施方式中，所述心血管疾病是肺动脉高压。

在第四方面，本发明提供治疗或预防可溶性鸟苷酸环化酶介导的疾病方法，包括将式I所示化合物或其药学上可接受的盐或本发明第三方面所述的药物组合物给予有此需要的对象。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了sGC纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图2显示了马普替林与sGC结合的传感图及结合解离图。

图3显示了马普替林对sGC下游信号蛋白的磷酸化水平的影响。

图4显示了马普替林干预野百合碱致肺动脉高压的SD大鼠后的体重变化曲线。正常组：口服给予生理盐水；模型组，口服给予生理盐水；实验组，腹腔给予马普替林(药物剂量为20mg/kg)；对照组，口服给予Selexipag(1mg/kg)；除了对照组药物每天口服给药两次，其它组从干预开始每天口服给药一次，连续21天。

图5显示了经马普替林干预后，肺动脉高压SD大鼠的血流动力学指标及右心肥厚指数。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现四环类抗抑郁药马普替林能够具备sGC激动活性，从而能够用于肺动脉高压的治疗。在此基础上完成了本发明。

本发明的化合物

在本发明中，“本发明化合物”或“马普替林”具有相同的含义，均是指化学名称为N-甲基-9,10-桥亚乙基蒽-9(10H)-丙胺的化合物。马普替林作为四环类抗抑郁药，用于内因性、反应性、更年期等各种类型的抑郁神经症，主要作用是通过选择性抑制外周和中枢神经去甲肾上腺素再摄取，而对5-羟色胺再摄取无影响，其它还包括抗焦虑、镇静、抗胆碱等作用。然而，目前未见关于盐酸马普替林治疗肺动脉高压方面的报道，也未见有关马普替林在治疗心血管相关疾病中的报道。

本发明人出乎意料地发现，作为四环类抗抑郁药的马普替林的结构完全不同于文献报道过的sGC激动剂(例如YC-1、利奥西呱)。然而，该化合物与sGC的结合亲和力达nM级别，且激动sGC所需的半数有效浓度在μM级别；对人肺动脉平滑肌细胞增殖的抑制活性IC₅₀值也在μM级别；促进sGC下游信号蛋白PKG的表达及VASP特定位点的磷酸化；在体内测试中也具有明显的治疗效果。

具体地说，本发明人对此药物进行了分子水平活性测试、细胞水平的机理研究及体内药效评价，其激动sGC所需的半数有效浓度为1.87μM；低氧条件下对人肺动脉平滑肌细胞增殖的抑制活性IC₅₀为14.08μM；浓度依赖性地激活sGC下游信号蛋白PKG并促进VASP的239位丝氨酸的磷酸化；在野百合碱诱导的肺动脉高压动物模型中，随着马普替林给药剂量的增加，其降低肺动脉高压并改善右心室肥厚症状具有一定的浓度依赖性，而且治疗效果优于口服降压药Selexipag。因此，本发明中涉及的药物马普替林可作为可溶性鸟苷酸环化酶激动剂的候选化合物。

因此，本发明的马普替林或包含其的药物组合物可用于激动可溶性鸟苷酸环化酶、用于治疗或预防sGC介导的疾病、或用于制备治疗或预防sGC介导的疾病的药物。本文中，sGC介导的疾病包括但不限于心血管疾病、肾病、糖尿病、青光眼、肥胖、骨质疏松、纤维变性病症、泌尿系统病症、炎性病症及神经病症。在具体的实施方式中，所述心血管疾病是肺动脉高压。

本发明的治疗肺动脉高压的药物组合物含有治疗有效量的马普替林或盐酸马普替林，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

虽然每个人的需求各不相同，本领域技术人员可确定本发明药物组合物中各种活性成分的最佳剂量。一般情况下，本发明的马普替林，对哺乳动物每天口服给药，药量按照约0.0025到50毫克/公斤体重。但最好是每公斤口服给药约0.01到10毫克。例如，单位口服剂量可以包括约0.01到50毫克，最好是约0.1到10毫克的本发明化合物。单位剂量可给予一次或多次，每天为一片或多片，每片含有约0.1到50毫克，合宜地约0.25到10毫克的本发明化合物或其溶剂化物。

本发明的药物组合物可被配制成适合各种给药途径的制剂形式，包括但不限于被配制成用于肠外，皮下，静脉，肌肉，腹腔内，透皮，口腔，鞘内，颅内，鼻腔或外用途径给药的形式，用于治疗肿瘤和其他疾病。给药量是有效地改善或消除一个或多个病症的药量。对于特定疾病的治疗，有效量是足以改善或以某些方式减轻与疾病有关的症状的药量。这样的药量可作为单一剂量施用，或者可依据有效的治疗方案给药。给药量也许可治愈疾病，但是给药通常是为了改善疾病的症状。一般需要反复给药来实现所需的症状改善。药的剂量将根据病人的年龄，健康与体重，并行治疗的种类，治疗的频率，以及所需治疗效益来决定。

本发明的药物制剂可以给予任何哺乳动物，只要它们能获得本发明马普替林的治疗效果。在这些哺乳动物中最为重要的是人类。

本发明的药物制剂可用已知的方式制造。例如，由传统的混合，制粒，制锭，溶解，或冷冻干燥过程制造。制造口服制剂时，可结合固体辅料或活性化合物，选择性研磨混合物。如果需要或必要时加入适量助剂后，加工颗粒混合物，获得片剂或锭剂芯。

合适的辅料特别是填料，例如糖类如乳糖或蔗糖，甘露醇或山梨醇；纤维素制剂或钙磷酸盐，例如磷酸三钙或磷酸氢钙；以及粘结剂，例如淀粉糊，包括玉米淀粉，小麦淀粉，大米淀粉，马铃薯淀粉，明胶，黄芪胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟甲基纤维素钠，或聚乙烯吡咯烷酮。如果需要，可增加崩解剂，比如上面提到的淀粉，以及羧甲基淀粉，交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，或褐藻酸或其盐，如海藻酸钠。辅助剂特别是流动调节剂和润滑剂，例如，硅石，滑石，硬脂酸盐类，如镁硬脂酸钙，硬脂酸或聚乙二醇。如果需要，可以给锭剂核心提供可以抵抗胃液的合适包衣。为此，可以应用浓缩糖类溶液。这个溶液可以含有阿拉伯树胶，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和/二氧化钛，漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。为了制备耐胃液的包衣，可使用适当的纤维素溶液，例如醋酸纤维素邻苯二甲酸或羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸。可向药片或锭剂核心的包衣加入染料或色素。例如，用于识别或为了表征活性成分剂量的组合。

因此，本发明还提供一种治疗sGC介导的疾病的方法，该方法包括给予需要的对象以本发明的盐酸马普替林或含本发明的马普替林的药物组合物。

给药方法包括但不限于本领域周知的各种给药方法，可根据患者的实际情况加以确定。这些方法包括但不限于肠外、皮下、静脉、肌肉、腹腔内、透皮、口腔、鞘内、颅内、鼻腔或外用途径给药。

本领域技术人员知晓，还可以利用式I所示化合物或其盐，或包含式I所示化合物或其盐的试剂在体外激动可溶性鸟苷酸环化酶。在体外激动可溶性鸟苷酸环化酶可以是非治疗目的的，例如用于科研目的。

本发明的优点：

1.本发明首次发现了四环类抗抑郁药马普替林具有激动sGC的活性；

2.本发明首次发现马普替林对人肺动脉平滑肌细胞的增殖具有一定的抑制活性；

3.本发明首次发现马普替林能降低野百合碱诱导的SD大鼠的肺动脉高压，并改善右心室肥厚症状；

4.本发明为研究和开发新型可溶性鸟苷酸环化酶激动剂奠定了物质基础，为马普替林在治疗肺动脉高压的应用提供研究基础。

以下结合具体实施案例对本发明的技术方案进一步描述，但以下实施案例不构成对本发明的限制，所有依据本发明的原理和技术手段采用的各种施用方法，均属于本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

可溶性鸟苷酸环化酶的表达及纯化

运用真核表达系统表达全长的sGC重组蛋白：首先培养Sf9细胞至对数期(细胞密度达到2×10⁶cells/mL)，向含有Sf-900TM II SFM培养基的三角培养瓶中加入Sf9细胞，使其密度为5×10⁵cells/mL，总体积为650mL，并在27℃，140rpm条件下培养3天；同时，将获得的含有sGC目的基因表达载体的P2病毒株继续侵染Sf9细胞获得的更高滴度的P3病毒株；之后将获得的更高滴度的P3病毒株加入对数期生长的Sf9细胞里，继续在27℃，140rpm条件下培养3天；最后将培养的细胞在1790rpm条件下离心5min，弃上清，收集已表达了sGC重组蛋白的菌体。

运用AKTA纯化系统纯化全长的sGC重组蛋白：首先利用亲和层析纯化蛋白，在菌体中加入缓冲液(50mM TEA pH 7.4，4mM MgCl₂，10％Glycerol，5mM imidazole)溶解菌体，并通过高压细胞破碎仪破碎菌体，破碎液在16000rpm条件下离心1h，收集上清液；之后利用蠕动泵，将收集的上清液注入预装的镍柱中，并将其连接至AKTA蛋白纯化系统，然后通过缓冲液A：50mM TEA pH 7.4，4mM MgCl₂，10％Glycerol，5mM imidazole和缓冲液B：50mM TEA pH7.4，4mM MgCl₂，10％Glycerol，500mM imidazole进行梯度洗杂、洗脱目的蛋白。初步收集的目的蛋白之后再利用阴离子交换柱进行进一步的纯化，具体步骤为：将上一步纯化的目的蛋白浓缩至一定体积，利用蠕动泵，将浓缩液注入HiTrap DEAE中，并将其连接至AKTA蛋白纯化系统，然后通过缓冲液A(50mM TEA pH 7.4，4mM MgCl₂，10％Glycerol)和缓冲液B(50mM TEA pH 7.4，4mM MgCl₂，10％Glycerol，500mM NaCl)进行梯度洗杂、洗脱目的蛋白，收集并浓缩目的蛋白；最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定蛋白(如图1所示)，浓缩目的蛋白并测定蛋白的浓度。

实施例2

可溶性鸟苷酸环化酶激动剂的药物筛选

基于蛋白与小分子的相互作用，通过表面等离子共振实验筛选能与sGC结合的化合物。在Biacore T200仪器上操作，选用的芯片为CM7传感芯片(GE Healthcare)；使用醋酸钠溶液(pH 4.5)将纯化的sGC蛋白(含有1mM DTT,2mM ATP和3mM MgCl₂)稀释至50μg/mL，通过氨基偶联的方式固定到CM7传感芯片上，待偶联成功后运行程序；程序运行的缓冲液为1.05×PBS(pH 7.4)，3mM EDTA，0.025％v/v Surfactant P20，1mM DTT和10mM MgCl₂；设置样品的进样流速为30μL/min，样品与靶标的结合与解离时间分别为120s和200s，并且每次更换样品时，使用10％DMSO清洗进样针头。化合物的初筛浓度为100μM，之后选取与sGC结合后相对响应值高于阴性对照(缓冲液)的化合物进行进一步结合亲和力的测定。通过该方法筛选获得与sGC具有高亲和力的化合物盐酸马普替林，其与sGC的结合亲和力为106.8nM。实验结果见图2。

实施例3

马普替林激动sGC的活性测试(EC₅₀的测定)

药物EC₅₀(median effective concentration)的测定：利用cGMP EnzymeImmunoassay Kit，通过竞争性免疫检测的方法测定马普替林激动sGC的活性。在DEA/NO(300nM)存在的条件下，马普替林催化sGC(20μg/mL)蛋白将GTP(2.6mg/mL)转化成cGMP，室温孵育10min后使用0.1M HCl将反应液稀释400倍后转移至包被有抗兔IgG抗体的96孔板中，并加入Neutralizing reagent、Conjugate和cGMP EIAAntibody等试剂，置于转速为500rpm的摇床上，室温孵育2h；之后吸出反应液，每孔加入1×Wash Buffer，洗板3次，并在TA(Total Activity)孔中加入cGMP-Alkaline Phosphatase Conjugate，然后每孔加入200μL p-Nitrophenyl Phosphate Substrate，室温孵育1h；最后每孔加入Stop Solution终止反应，并在多孔酶标仪上读取405nM处的吸光度，读取的吸光值其对应颜色的荧光强度与孔中cGMP的浓度成反比，从而通过cGMP Enzyme Immunoassay Kit检测产生的cGMP的含量。为马普替林设置了6个浓度梯度(10nM-10mM)，使用Origin软件处理实验数据并计算盐酸马普替林的EC50值。实验过程采用YC-1为阳性对照，每次实验三次平行。实验结果见表1。

实施例4

马普替林抑制人肺动脉平滑肌细胞增殖的活性测试(MTT实验)

MTT实验原理：细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

在常氧与低氧的条件下，通过检测细胞存活和生长的方式，分别测定马普替林在两种条件下对人肺动脉平滑肌细胞株(HPASMCs)的半数致死率。具体操作步骤为使用含有10％FBS的DMEM培养基培养细胞，并以每孔3000个细胞接种至96孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，待细胞单层铺满板表面，换成无血清的DMEM培养基，孵育24h至细胞同步化；然后将常氧组与低氧组(1％O₂)条件下培养的细胞，分别加入不同浓度梯度的药物，继续孵育48h；之后每孔加入终浓度为5mg/mL的MTT溶液混匀，最后在490nm波长下，测定各孔光吸收值。使用Origin软件处理实验数据并计算马普替林的IC₅₀值。实验过程采用YC-1为阳性对照，每次实验三次平行。实验结果见表2：

表2

实施例5

sGC下游信号蛋白的研究

激动剂激动sGC，能够催化GTP转化为cGMP，而cGMP作为细胞内的第二信使，它能够调控其下游的信号元件蛋白激酶G(PKG)，cGMP依赖的磷酸二酯酶及cGMP门控离子通道；PKG作为cGMP的下游元件之一，cGMP含量的增加能够激活PKG，并进一步促进血管扩张刺激磷蛋白(VASP)的239位丝氨酸的磷酸化。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的第二抗体起反应，经过放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分，从而可通过免疫印迹法(Western Blot)检测马普替林是否浓度依赖性的促进人肺动脉平滑肌细胞内PKG的表达及VASP的磷酸化水平。具体步骤为使用含有10％FBS的DMEM培养基培养细胞，并以每孔5000个细胞接种至24孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，待细胞单层铺满板表面，加入浓度梯度药物孵育24h；之后使用冰冷的1×PBS清洗细胞，加入细胞裂解液冰上裂解细胞，半小时后离心收集上清；通过BCA法测定样品浓度，并取对应体积的样品，加入5μL Loading Buffer制样，混匀，并在100℃条件下煮沸10min，12000rpm条件下离心1min，之后配制10％SDS-PAGE凝胶，进行凝胶电泳，然后将凝胶取出，去除浓缩胶部分，将其与滤纸及无水甲醇浸泡过的PVDF膜放置于预冷的转膜液中，按从下至上(滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸)的顺序放置装置并排除气泡，在300mA条件下转膜70min；之后取出PVDF膜，根据蛋白Marker剪出含有目的蛋白条带的PVDF膜，加入5％BSA，置于摇床上室温封闭2h；然后分别加入一抗PKG-1Rabbit mAb和Phospho-VASP(Ser239)Antibody，置于摇床上4℃孵育过夜；之后取出PVDF膜，用TBST清洗3次，每次8min，加入二抗，置于摇床上室温孵育1h，用TBST清洗3次，每次8min。最后通过天能(Tanon)化学发光成像系统，曝光、显影目的条带。实验结果见图3。

实施例6

野百合碱诱导肺动脉高压动物模型评价

实验所用老鼠为SD大鼠，分为四组，包括正常组(6只)、模型组(10只)、实验组(10只)和对照组(10只)；这四组大鼠分别置于干净的放有水和饲料的鼠笼中饲养一两天后开始实验。除了正常组，其余组的大鼠皮下注射60mg/kg野百合碱诱导肺动脉高压；正常组大鼠每天口服给予生理盐水，模型组大鼠每天口服给予生理盐水，实验组大鼠腹腔给予马普替林(20mg/kg/d)，对照组大鼠口服给予Selexipag(1mg/kg)一天两次；造模21天后，大鼠经麻醉后测量各组的平均肺动脉压力(mPAP)，然后将右心室壁(RV)与右心室和室间隔(LV+S)进行分离，测量右心室肥厚指数(RV/LV+S，RVHI)，最后通过Graphpad prism软件进行统计学分析。实验结果见图4和图5。

讨论：

发明人经过广泛而深入的研究，利用表面等离子共振实验筛选化合物库，发现四环类抗抑郁药马普替林可作为新型的可溶性鸟苷酸环化酶激动剂，继而对该药物进行了分子水平激动活性测试和细胞水平功能研究。本发明人发现马普替林与sGC的结合亲和力为106.8nM，之后通过分子水平的激动活性测定，发现马普替林激动sGC的半数有效浓度为1.87μM，优于阳性对照YC-1；在细胞水平上，马普替林不仅能在一定程度上抑制低氧诱导的HPASMCs的过度增殖，而且可激活sGC下游信号蛋白PKG，促进p-VASP的磷酸化，并呈浓度依赖性；本发明人进一步通过药效评价发现，马普替林可明显降低野百合碱诱导的肺动脉高压动物模型中大鼠的肺动脉高压并改善右心室肥厚症状，其治疗效果优于口服降压药Selexipag，从而提示本发明的马普替林在体内有较好治疗肺动脉高压的效果，可为肺动脉高压的治疗提供药物候选物，或为sGC激动剂提供新型化合物。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.式Ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防可溶性鸟苷酸环化酶介导的疾病或制备激动可溶性鸟苷酸环化酶的药物中的用途：

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述可溶性鸟苷酸环化酶介导的疾病包括但不限于：心血管疾病、肾病、糖尿病、青光眼、肥胖、骨质疏松、纤维变性病症、泌尿系统病症、炎性病症及神经病症。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述心血管疾病是肺动脉高压。

4.一种体外激动可溶性鸟苷酸环化酶的方法，所述方法包括利用式I所示化合物或其药学上可接受的盐，或包含式I所示化合物或其药学上可接受的盐的试剂在体外激动可溶性鸟苷酸环化酶：

5.一种药物组合物，所述药物组合物含有式I所示化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体或赋形剂，所述药物组合物用于治疗或预防可溶性鸟苷酸环化酶介导的疾病或激动可溶性鸟苷酸环化酶。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述可溶性鸟苷酸环化酶介导的疾病包括但不限于：心血管疾病、肾病、糖尿病、青光眼、肥胖、骨质疏松、纤维变性病症、泌尿系统病症、炎性病症及神经病症。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述心血管疾病是肺动脉高压。

8.治疗或预防可溶性鸟苷酸环化酶介导的疾病方法，包括将式I所示化合物或其药学上可接受的盐或权利要求5所述的药物组合物给予有此需要的对象。