CN108718771A - 一种利用无底钵伤根接种法进行茄子黄萎病抗性鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用无底钵伤根接种法进行茄子黄萎病苗期抗性鉴定的方法，包括以下步骤：(1)选取饱满的种子，在55℃水温下浸泡15min，边浸泡边搅拌，清水浸泡后，变温催芽，均匀播在下方具有开孔的营养钵内；(2)将茄子黄萎病菌株进行活化，配制孢子悬浮液；(3)待茄苗长至3‑4片真叶，将营养钵下方开孔处长出的茄苗须根剪掉后置于盛放装置内浸泡接种；(4)接种后，待出现症状后进行发病调查，并计算出病情指数。本发明利用无底钵伤根接种法进行抗性鉴定的方法，苗期抗病性鉴定中，无底钵伤根接种法更能体现出茄子抗黄萎病真实抗性，且发病稳定、均匀，发病速度较快，效率高；且病情指数分级标准科学，易掌握。

Description

一种利用无底钵伤根接种法进行茄子黄萎病抗性鉴定方法

技术领域

本发明涉及植物抗性鉴定技术领域，特别涉及一种利用无底钵伤根接种法进行茄子黄萎病抗性鉴定方法。

背景技术

茄子黄萎病是大丽轮枝菌侵染危害的一种世界性的土传维管束病害。该病原菌寄主范围十分广泛，除侵染茄子外，还可侵染危害棉花、番茄、向日葵、马铃薯、草莓等600多种作物。1914年美国首次发现大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病，1935年我国因引进美国棉花品种而传入黄萎病病菌。20世纪50年代初茄子黄萎病仅在我国东北地区局部发生，随着茄果类蔬菜种植面积的扩大而迅速蔓延，发病范围日益南扩，目前我国茄子主要栽培地区均发生该病害。茄子黄萎病发病率高，一般年份发病率为40％～50％，严重年份达70％以上，甚至毁种失收，对茄子品质和产量都造成严重的影响，已成为制约茄子产业发展的重要病害。

黄萎病为典型的土传维管束病害，微菌核是大丽轮枝菌主要存活结构和初侵染源，由于其抗逆性强，在土壤中存活时间长，化学防治不理想；轮作倒茬虽然有效，但给蔬菜生产茬口安排带来实际困难；嫁接技术可有效减轻茄子黄萎病发生，但带来嫁接的技术和成本问题，很难在生产实践中应用推广。选育和利用抗病品种是防治茄子黄萎病最直接、安全、高效的措施之一，而筛选抗病种质资源是抗病育种的重要基础工作。自然病圃法是抗性鉴定中最传统、应用最普遍的方法，其鉴定结论至今仍是新品种审定时的主要依据。但其鉴定周期长，受季节影响，鉴定材料数量受限。此外，病圃中病原菌数量不确定、分布不均及气候环境条件变化等一系列因素均影响鉴定结果的准确性。

苗期人工接种法，不受季节影响，能更好的控制选择压，可大量、重复筛选材料。目前，普遍采用蘸根接种法，其优点是发病均匀、发病快。但采用蘸根接种时，各品种间发病均较重，不能准确、有效地呈现出品种间对黄萎病的抗性差异，与自然病圃成株期发病水平差异较大，不能反应出品种的真实抗性。

因此，建立一套快速、稳定、准确、有效，最大限度体现出茄子品种真实抗病性的苗期人工抗病性鉴定方法及鉴定装置是一个亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明提供一种利用无底钵伤根接种法进行茄子黄萎病抗性鉴定方法，其解决了上述现有的苗期接种技术缺点，提供一种提高茄子黄萎病种质材料筛选和研究效率的抗病性评价方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种利用无底钵伤根接种法进行茄子黄萎病苗期抗性鉴定的方法，包括以下步骤：

(1)选取饱满的种子，在55℃水温下浸泡15min，边浸泡边搅拌，然后清水浸泡48h后，将种子从清水中捞出，沥干水分，用纱布包好后进行变温处理催芽，待种子露白后，均匀播在下方具有开孔的营养钵内；

(2)将茄子黄萎病菌株在PDA培养基平板上进行活化，于25℃-26℃培养4-7d，挑取2-3mm菌块2-3块转入150mL PD液体培养基中，于25℃-26℃，130rpm/min摇床培养4-7d后，四层灭菌纱布过滤，通过灭菌水稀释，配制成一定浓度的孢子悬浮液；

(3)待茄苗长至3-4片真叶，用消毒过的剪刀将营养钵下方开孔处长出的茄苗须根剪掉后，将营养钵浸泡在装有孢子悬浮液的盛放装置内浸泡接种，浸泡时间10-30min；

(4)接种后，待出现黄萎病典型发病症状后，进行第一次发病调查，以后每10天调查一次，至发病稳定，不再扩展；

按分级标准进行病情级数调查，并计算出病情指数：

苗期茄子黄萎病分级标准为：0级，植株健康，无病状，生长正常；1级，植株1-2真叶表现发黄或者叶片脱落；2级，植株3片以上真叶表现病状；3级，大部分叶片出现萎蔫、卷曲或脱落，顶端新叶感病但没有脱落，全株未枯死；4级，植株全株枯死或只剩光杆；

病株率和病情指数按以下公式进行计算：病株率＝发病株数/总株数×100％；

病情指数＝∑(相应病级×相应病级病株数)/(总株数×最高级值)×100；

茄子黄萎病抗病性分级标准：

免疫(I)：DI＝0；抗病(R)：DI≦15；中抗(MR)：15﹤DI≦30，耐病(T)：30﹤DI≦50；中感(MS)：50﹤DI≦70；感病(S)：DI﹥70。

优选地，上述技术方案中，所述步骤(1)变温催芽为：温度为30℃8h，20℃16h，3-4d出芽。

优选地，上述技术方案中，所述步骤(2)的孢子悬浮液的浓度为1×10⁵-1×10⁷个/mL。

优选地，上述技术方案中，所述步骤(3)的浸泡时间为10min，营养钵浸泡在菌悬液内的深度为1-2cm。

一种用于茄子黄萎病的无底钵伤根接种装置，包括：多排营养钵和营养钵支架，所述多排营养钵设置于营养钵支架内，每一排营养钵均包括底板、第一侧板和第二侧板，所述底板上开设有多个开孔；所述第一侧板和所述第二侧板分别可折叠地设置于所述底板的左右两侧，所述第一侧板和所述第二侧板的相对侧分别设置多个第一连接翼和多个第二连接翼，所述第一连接翼和所述第二连接翼一一对应插合连接，所述第一侧板、所述第二侧板、所述第一连接翼以及所述第二连接翼合围将所述多排营养钵分隔成多个单独的营养钵。

优选地，上述技术方案中，所述无底钵伤根接种装置还包括用于盛放菌悬液的盛放装置，所述多排营养钵通过所述营养钵支架设置于所述盛放装置内。

优选地，上述技术方案中，所述第一连接翼的前端向内形成凹陷，所述多个第二连接翼的前端向外形成凸起，所述凹陷和所述凸起通过卡接连接。

优选地，上述技术方案中，所述第一侧板和所述第二侧板上还设置有多个凹槽。

优选地，上述技术方案中，所述第一侧板、所述第二侧板、所述底板、所述第一连接翼、所述第二连接翼为一体成型的塑料。

优选地，上述技术方案中，所述营养钵支架包括底板和四块围板，所述围板与所述底板可旋转的连接，相邻的围板通过卡扣固定连接。

一种利用无底钵伤根接种法进行茄子黄萎病苗期抗性鉴定的方法在茄子黄萎病致病力分化上的应用。

本发明上述技术方案，具有如下有益效果：

(1)苗期无底钵伤根接种法发病适中且均匀一致，更符合茄子黄萎病真实抗性。无底钵伤根接种法在钵体下方开口处，将露出的须根减掉后，整体置于孢子悬浮液中浸泡，整个过程更真实的模拟了病原菌从根部伤口处侵染，保证每株茄苗均匀带菌，实际发病均匀一致，很少出现同一处理，有的植株发病严重，有的发病轻甚至未发病，或者重复之间发病不一致的情况；并且与我们多年来，对这些茄子种质资源大田自然病圃中抗黄萎病的数据结果较一致。因此，苗期抗病性鉴定中，无底钵伤根接种法更能体现出茄子抗黄萎病真实抗性，且发病稳定、均匀，发病速度较快，效率高。

(2)病情指数分级标准科学，易掌握。病害调查分级标准是抗病鉴定的的重要环节，多数的分级标准是依据发病面积占植株面积的百分比来划分。本发明的分级标准更适用于苗期茄子黄萎病的病情指数调查，苗期接种通常是茄苗二叶一心或者三叶一心期，茄苗接种后发病较快，在适宜条件下8-10天左右开始出现黄萎病症状，15左右表现为黄萎病典型症状，此时进行调查的茄子植株多为六叶一心或者七叶一心，叶片数量有限，因此用感病叶片数量来进行黄萎病苗期分级得到的结果更可靠。由于将大部分叶片发病，未枯死定位为3级；全株枯死或只剩光杆定位为4级，实际应用中非常易于操作和掌握。

附图说明

图1为本发明的用于茄子黄萎病的无底钵伤根接种装置的多排营养钵(其中一排)的俯视图。

图2为本发明的无底钵伤根接种装置的多排营养钵(其中一排)的仰视图。

图3为本发明的用于茄子黄萎病的无底钵伤根接种装置的营养钵支架示意图。

图4为本发明的用于茄子黄萎病的无底钵伤根接种装置的营养钵支架和多排营养钵组装图。

图5为本发明的用于茄子黄萎病的无底钵伤根接种装置的盛放装置示意图。

图6为茄子部分种质资源接种第20天发病情况图。

图7为东北地区茄子黄萎病菌致病力分化情况图。

图8为部分代表菌株在鉴别寄主上的发病情况图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。

以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1

(1)茄苗培育：

茄子品种为龙杂茄10号，选取饱满的种子，在55℃水温下浸泡15min后，边浸泡边搅拌，然后清水浸泡48h后，将种子从清水中捞出，沥干水分，用纱布包好后进行变温处理催芽，温度为30℃8h，20℃16h，一般3-4d可出芽，待种子露白后，均匀播在营养钵上。

(2)黄萎病菌培养及孢子悬浮液制备：

1)病原菌分离、培养及鉴定：

病组织分离、纯化：在灭菌超净工作台中，选取茄子黄萎病典型发病部位，用消毒剪刀剪取茄子茎杆内髓褐变组织2-3mm的小块，放入70％酒精中，轻微摇晃，使病组织充分接触酒精进行表面消毒，5-6s后用消毒镊子夹取小块，在灭菌水中连续漂洗3次后，将沥去表面水分的病组织小块放置在PDA培养基中，每个培养皿中放置4-5块。25℃黑暗培养3-4d后，纯化菌种，在无菌操作台中，挑取病组织周围长出的病原菌菌丝2-3mm小块，置于新PDA培养基中继续培养，获得初始分离菌株。

菌株单孢分离、保存：将黄萎病菌初始分离菌株在PDA平板上，25℃黑暗培养7d后，取2.0mL无菌水加入到菌落，室温静置20min，取适量孢子悬浮液加入1.5mL灭菌离心管中，加适量无菌水稀释到孢子浓度为(2-5)×10²个/mL。取200μL均匀涂布到2％水琼脂培养基平板上，在无菌超净工作台上吹干培养基表面的水分。将培养皿倒置放于25℃下恒温培养36h，在体视解剖镜下挑取单分生孢子萌发后形成的微菌落，将其转移到PDA培养基平板上培养即得到单分生孢子菌株。将单孢分离菌株转接到灭菌PDA斜面中，25℃黑暗培养，待菌丝充分长出后，置于4℃低温保存。用于病原菌分类地位鉴定及种质资源抗病性接种鉴定使用。

2)菌种扩繁及孢子悬浮液制备：

将鉴定保存的菌株在PDA培养基上活化，25℃黑暗培养4d后，在无菌操作台中，用灭菌打孔器打取菌片，取2块放入150mL马铃薯液体培养基中，25℃，130r/min摇床培养4d，待产孢量较多时，四层纱布过滤，收集滤液于50mL离心管中，经10000rpm离心5min获得高浓度黄萎病菌孢子，加入适量的无菌水，血球计数板显微镜观察，将其配制成孢子浓度为1×10⁵个/mL-1×10⁷个/mL的孢子悬浮液，用于接种。

PDA培养基配方：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000ml。

PD液体培养基配方：为PDA培养基不加琼脂。

操作步骤：称取削皮的200g马铃薯，切成小块置于锅中加水煮烂(煮沸20～30min)，用纱布过滤后，滤液中加入葡萄糖和琼脂继续加热搅匀，稍冷却后再补水至1000ml，分装到锥形瓶，加塞包扎后121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却备用。

(3)接种：

茄子品种选用龙杂茄10号，接种浓度1×10⁷个孢子/mL，采用无底钵浸泡10min接种法，设无菌水为对照处理(CK)。所有处理均设3次重复，每次重复32株苗。

无底钵伤根接种法：将露出于营养钵下方开口处的须根减掉后，整体置于孢子悬浮液中浸泡，浸泡深度为1-2厘米，整个过程更真实的模拟了病原菌从根部伤口处侵染，保证每株茄苗均匀带菌，实际发病均匀一致，很少出现同一处理，有的植株发病严重，有的发病轻甚至未发病，或者重复之间发病不一致的情况，对茄子种质资源大田自然病圃中抗黄萎病的数据结果较一致。

(4)茄子种质资源抗病性鉴定

应用本研究建立的苗期接种鉴定方法对本研究室保存的50个茄子种质资源进行了抗性鉴定。

结果表明，接种第8天开始发病，接种第15天表现为茄子黄萎病典型症状，其中“蒜芥茄”和“俄罗斯龙葵”未发病，为免疫品种(I)；“砧好和”、“托鲁巴姆”和“EP 6279”病情指数为24.0-29.3，为中抗品种(MR)；耐病品种(T)12个，病情指数为37.4-48.5；中感品种(MS)20个，病情指数为50.3-68.6；感病品种(S)13个，病情指数为71.9-97.3。其中“蒜芥茄”、“俄罗斯龙葵”和“EP 6279”抗性较好，可作为潜在砧木开发材料。以上试验结果与大田试验调查数据基本一致。

表1茄子材料接种第20d黄萎病调查结果

对比例1接种方法对比

分别采用蘸根法、灌根法、拌土法以及注射法进行接种。茄子品种为龙杂茄10号，五叶一心期，接种浓度为1×10⁷个孢子/mL。

蘸根法：将幼苗轻拔起，洗净根部泥土后蘸根10min。

灌根法：在根际1cm处斜切一刀后灌根10ml孢子悬浮液。

拌土法：将孢子悬浮液均匀拌入土壤中，土壤接种终浓度为1×10⁷个孢子/mL。

注射法：用灭菌针头在茄苗茎基部注射10ml孢子悬浮液。

结果表明，5种接种方法，发病最快且严重的为蘸根接种法，接种第8天即表现出底部叶片变黄或半边退绿的症状，第25天平均病指达85.6，与其他处理差异显著，但发病过于严重，不利于区分抗、感情况；灌根接种法在接种试验中应用比较多，此次接种第25天的病情指数为77.0，但其发病不均匀，并且接种时伤根较难把控，有时需要缓苗，给试验操作和数据的准确性带来困难；注射接种法接种效率低，操作困难，发病不理想，而拌土接种法发病所需时间较长，接种第12天才开始显症。无底钵接种法发病较快、均匀，且接种过程操作简便，接种第25天的平均病情指数为80.6，病情指数与鉴定寄主抗感情况相一致。

表2茄子黄萎病菌不同接种方法的比较

对比例2接种苗龄

通过温室苗期接种的方法，对茄子3-4片真叶、5-6片真叶，7-8片真叶期进行茄子最佳苗龄接种试验的筛选。茄子品种选用龙杂茄10号，接种浓度1×10⁷个孢子/mL，采用无底钵浸泡10min接种法，每个处理32株苗，三次重复。

表3茄子黄萎病菌最佳接种生育期的筛选

结果表明，茄子植株苗龄的选择对黄萎病接种效果影响较大(见表2)，其中发病效果最好的是苗龄3-4片真叶期，处理25天后的发病率为100％，病情指数达59.8，好于其他处理，此时其对照处理的发病率为22.9％，病情指数为5.7；而5-6片真叶、7-8片真叶期的病情指数虽然在53.7以上，但是其对照处理大面积出现黄花，花叶斑，与黄萎病危害很相似的症状，严重干扰了其病情指数的调查，影响其最终的调查结果，出现这种情况可能与苗龄过大，苗营养生长弱化，容易出现生理性障碍所导致的。此外过大苗龄植株抵抗病害的能力较强，侵染进程和发病时间较长。因此最佳接种苗龄为3-4片真叶期为宜。

对比例3接种时间的确定

在试验温室中，选用龙杂茄10号，在茄苗生长至3-4片真叶，接种浓度1×10⁷个孢子/mL，分别采用无底钵浸泡10min、20min和30min不同接种时间，每个处理32株苗，三次重复。

试验结果表明，三种时间处理病情指数差异不显著，浸泡10min的病情指数为31.0，发病率为90.6％，浸泡30min的病情指数为33.7，发病率为94.8％，浸泡时间越长没有引起更为严重的发病，因此采用这个范围内的浸泡时间均可，其中浸泡10min更能节省时间，提高试验效率。

表4无底钵伤根接种法最佳接种时间筛选

实施例2茄子黄萎病致病力分化的研究

用上述建立的无底钵伤根接种法，对东北地区鉴定、保存的107个黄萎病菌菌株进行致病力分化测定。茄子鉴别寄主为好砧合(高抗)、糯米长茄(中抗)和甘-1(高感)。将茄子黄萎病菌株在PDA培养基平板上进行活化，于26℃培养7d，挑取2-3mm菌块3块转入150mL PD液体培养基中，于26℃，130rpm/min摇床培养7d后，四层灭菌纱布过滤，通过灭菌水稀释，配制成浓度为1×10⁷个/mL孢子悬浮液。于茄苗3-4片真叶期，用灭菌剪刀将接种钵底部长出的须根剪断后，整体置于装有1L孢子悬浮液的接种盒中浸泡10min；清水浸泡10min作为对照。每个菌株接种各茄苗品种32株，设3次重复。

结果表明，107株菌株均能引起3个茄子品种不同程度发病。发病菌株表现出典型的症状，叶片黄化，维管束变褐等。在‘EP9532’上，吉林沙河子81号菌株的致病力最强，榆树市弓棚子97号菌株最弱；在糯米长茄上，牡丹江市铁岭河镇32号菌株的致病力最强，榆树市弓棚子96号菌株最弱；在品种‘甘-1’上，大庆市27号菌株的致病力最强，肇东市黎明镇太合村67号菌株最弱；综合分析结果表明，黑龙江省密山市连珠山镇新治村24号菌株致病力最强，48、69、27、47、36号菌株次之，吉林省榆树市弓棚子96号菌株致病力最弱。

黄萎病菌株致病力划分标准：

DI≥45为强致病菌株；45＞DI≥30为中等致病菌株；DI＜30为弱致病力菌株。

参试菌株的致病力分化明显，结果表明：107个菌株可归为强(Ⅰ)、中(Ⅱ)、弱(Ⅲ)3个类群。其中，Ⅰ类群菌株25株，平均病指42.6～63.6，占测试菌株的23.4％；Ⅱ类群菌株34株，平均病指30.7～39.7，占测试菌株的31.8％；Ⅲ类群菌株48株，平均病指16.5～29.8，占测试菌株的44.9％。

上述结果表明，在我国东北茄主产区，弱致病类型菌株分布广泛，占侵染危害的主导地位，而中、强致病类型的菌株侵染破坏性强，两者总量已经超过了弱致病力菌株，占测试菌株的55.1％，常引起落叶型黄萎病，主要集中在黑龙江省佳木斯、牡丹江、密山、大庆等地及吉林省梅河口、吉林、延吉等地；内蒙、辽宁等地茄子黄萎病发生危害少，采集病样少，从现有菌株来看多为弱致病类型菌株。

表5 107株茄子黄萎病菌及来源

实施例3用于茄子黄萎病的无底钵伤根接种装置

本发明的用于茄子黄萎病的无底钵伤根接种装置，包括多排营养钵1和营养钵支架2。同时还可以包括盛放装置3。详细来说：

多个多排营养钵1设置于营养钵支架2内，营养钵支架2接种时置于盛放装置3内。

具体的：多排营养钵1包括底板15、第一侧板11和第二侧板12，底板15上开设有多个开孔16；第一侧板11和第二侧板12分别可折叠地设置于底板15的左右两侧，第一侧板11和第二侧板12的相对侧分别设置多个第一连接翼13和多个第二连接翼14，第一连接翼13和第二连接翼14一一对应插合连接，第一侧板11、第二侧板12、第一连接翼13以及第二连接翼14合围将多排营养钵1分隔成多个单独的营养钵。也就是说，第一连接翼13的前端向内形成凹陷，多个第二连接翼14的前端向外形成凸起，凹陷和凸起通过卡接连接。

营养钵支架2包括底板21和四块围板22，围板22与底板21可旋转的连接，相邻的围板通过卡扣固定连接。

盛放装置3用于盛放菌悬液的，多个多排营养钵1放入通过营养钵支架2后再置于盛放装置3内进行接种。当然，该装置也可选用常规的容器进行替换使用。

优选地，第一侧板11、第二侧板12、底板15、多个第一连接翼13和多个第二连接翼14一体成型，第一侧板11和第二侧板12上还设置有多个凹槽17。更优选地，多排营养钵1为八排，每一排营养钵的第一侧板11、第二侧板12、第一连接翼13以及第二连接翼14合围将每一排的营养钵1分隔成四个单独的种植穴。种植穴内种植茄苗。当然，本发明并不以此为限，本领域技术人员可根据需要选择和设计合适的排数和每一排的种植穴的数量。

本发明具有以下优点：

(1)茄子黄萎病菌四种主要菌株类型筛选最佳接种浓度，更具有说服力。茄子黄萎病菌受环境影响及菌体自身很容易发生分化变异，本研究室从2014-2016年连续三年全国性茄子黄萎病危害调查，收集、鉴定并保存单孢分离菌株271株，依据微菌核形态特征，我们收集的茄子黄萎病菌有四种主要类型，A型：菌核型，分离率50.3％，菌核多、菌落呈灰黑色；B型：菌核型，分离率20.5％，菌核多，菌落灰白色，呈放射性生长；C型：丝核型，分离率18.1％，菌核较多，菌落边缘菌核减少；D型：丝核型，分离率10.5％，菌核较多，呈轮圈状排布，菌落灰白色。依据2015年采集菌株致病力鉴定结果，从中挑选出强致病力菌株25株，其中涵盖了这四种主要菌株类型，预从多种菌株类型的角度明确茄子黄萎病菌的产孢效率及最佳接种浓度，对于易分化、变异的茄子黄萎病菌，比传统的单纯用一种致病菌考察最佳接种浓度更具有说服力。

(2)茄子黄萎病菌株“2015-61”产孢效率高，致病力强，减少试验工作量。试验中我们筛选到一株产孢效率高的茄子黄萎病菌株“2015-61”，其接种浓度1×10⁵个孢子/mL与其他强致病菌最佳接种浓度1×10⁷个孢子/mL相比，可达到同样的致病效果。因此，应用菌株“2015-61”接种，为我们接下来的苗期接种方法筛选、种质资源抗病性鉴定及未来与黄萎病菌接种等相关性的试验均减少了大量的菌种扩繁，提高了工作效率。

(3)病情指数分级标准科学，易掌握。病害调查分级标准是抗病鉴定的的重要环节，多数的分级标准是依据发病面积占植株面积的百分比来划分。我们的分级标准更适用于苗期茄子黄萎病的病情指数调查，苗期接种通常是茄苗二叶一心或者三叶一心期，茄苗接种后发病较快，在适宜条件下8-10左右开始出现黄萎病症状，15左右表现为黄萎病典型症状，此时进行调查的茄子植株多为六叶一心或者七叶一心，叶片数量有限，因此用感病叶片数量来进行黄萎病苗期分级得到的结果更可靠。由于将大部分叶片发病，未枯死定位未3级；全株枯死或只剩光杆定位未4级，实际应用中非常易于操作和掌握。

(4)苗期无底钵伤根接种法发病适中且均匀一致，更符合茄子黄萎病真实抗性。试验中采用了土传病害常用到的四种接种方法与无底钵伤根接种法进行对比，较为全面的考察了各个方法的利和弊。无底钵伤根接种法是在钵体下方开口处，将露出的须根减掉后，整体置于孢子悬浮液中浸泡，整个过程更真实的模拟了病原菌从根部伤口处侵染，保证每株茄苗均匀带菌，实际发病均匀一致，很少出现同一处理，有的植株发病严重，有的发病轻甚至未发病，或者重复之间发病不一致的情况；并且与我们多年来，对这些茄子种质资源大田自然病圃中抗黄萎病的数据结果较一致。因此，苗期抗病性鉴定中，无底钵伤根接种法更能体现出茄子抗黄萎病真实抗性，且发病稳定、均匀，发病速度较快，效率高。

本发明的营养钵的个数根据需要设计多组，每一组优选为4个，方便实验中每组重复的数量。多排营养钵直接并排放置，可根据需要取出或挪动其中的一排或多排。

该装置采用的用于盛放菌悬液的盛放装置，该装置内可放入少量接种菌悬液即可完成接种(深度1-2厘米即可)。多排的营养钵可以作为一个整体一次性的浸入盛放装置，一次完成接种，操作简单且接种方便，发病均匀；同时对于产孢率较低的黄萎病菌株，其节省了大量菌悬液。

盛放装置不仅仅用于菌悬液浸泡，在苗期非接种阶段，可将多排营养钵和营养钵支架放在该装置内，在日常浇水管理时，能起到防止由于浇水飞溅、流淌而导致病原菌传播、感染清水对照不接种的茄苗及棚室用于其他的健康茄苗。当需要接种时，该装置又作为盛放装置使用，菌悬液浸泡后可以重复利用，如果接种盘数量较多，可以重复用到下批苗继续浸泡，浸泡后倒掉菌悬液，多排营养钵和营养钵支架还继续放在盛放装置内，便于管理。

虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种利用无底钵伤根接种法进行茄子黄萎病苗期抗性鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)茄苗培育：选取饱满的种子，在55℃水温下浸泡15min，边浸泡边搅拌，然后清水浸泡48h后，将种子从清水中捞出，沥干水分，用纱布包好后进行变温处理催芽，待种子露白后，均匀播在下方具有开孔的营养钵内；

(2)孢子悬浮液的制备：将茄子黄萎病菌株在PDA培养基平板上进行活化，于26℃培养7d，挑取2-3mm菌块3块转入150mL PD液体培养基中，于26℃，130rpm/min摇床培养4-7d后，四层灭菌纱布过滤，通过灭菌水稀释，配制成一定浓度的孢子悬浮液；

(3)接种：待茄苗长至3-4片真叶，用消毒过的剪刀将营养钵下方开孔处长出的茄苗须根剪掉后，将营养钵浸泡在装有孢子悬浮液的盛放装置内浸泡接种，浸泡时间10-30min；

(4)调查评价：接种后，待出现黄萎病典型发病症状后，进行第一次发病调查，以后每10天调查一次，并计算出病情指数；

苗期茄子黄萎病分级标准为：0级，植株健康，无病状，生长正常；1级，植株1-2真叶表现发黄或者叶片脱落；2级，植株3片以上真叶表现病状；3级，大部分叶片出现萎蔫、卷曲或脱落，顶端新叶感病但没有脱落，全株未枯死；4级，植株全株枯死或只剩光杆；

病情指数＝∑(相应病级×相应病级病株数)/(总株数×最高级值)×100；

茄子黄萎病抗病性分级标准：

免疫(I)：DI＝0；抗病(R)：DI≦15；中抗(MR)：15﹤DI≦30，耐病(T)：30﹤DI≦50；中感(MS)：50﹤DI≦70；感病(S)：DI﹥70。

2.根据权利要求1所述的利用无底钵伤根接种法进行茄子黄萎病苗期抗性鉴定的方法，其特征在于，所述步骤(1)变温催芽为：温度为30℃8h，20℃16h，3-4d出芽。

3.根据权利要求1所述的利用无底钵伤根接种法进行茄子黄萎病苗期抗性鉴定的方法，其特征在于，所述步骤(2)的孢子悬浮液的浓度为1×10⁵-1×10⁷个/mL。

4.根据权利要求1所述的利用无底钵伤根接种法进行茄子黄萎病苗期抗性鉴定的方法，其特征在于，所述步骤(3)的浸泡时间为10min，营养钵浸泡在菌悬液内的深度为1-2cm。

5.一种用于茄子黄萎病的无底钵伤根接种装置，其特征在于，包括：多排营养钵(1)和营养钵支架(2)，所述多排营养钵(1)并排设置于营养钵支架(2)内，每一排营养钵均包括底板(15)、第一侧板(11)和第二侧板(12)，所述底板(15)上开设有多个开孔(16)；所述第一侧板(11)和所述第二侧板(12)分别可折叠地设置于所述底板(15)的左右两侧，所述第一侧板(11)和所述第二侧板(12)的相对侧分别设置多个第一连接翼(13)和多个第二连接翼(14)，所述第一连接翼(13)和所述第二连接翼(14)一一对应插合连接，所述第一侧板(11)、所述第二侧板(12)、所述第一连接翼(13)以及所述第二连接翼(14)合围将所述多排营养钵(1)分隔成多个单独的营养钵。

6.根据权利要求5所述的一种用于茄子黄萎病的无底钵伤根接种装置，其特征在于，所述无底钵伤根接种装置还包括用于盛放菌悬液的盛放装置(3)，所述多排营养钵(1)通过所述营养钵支架(2)设置于所述盛放装置(3)内。

7.根据权利要求5所述的一种用于黄萎病的无底钵伤根接种装置，其特征在于，所述第一连接翼(13)的前端向内形成凹陷，所述多个第二连接翼(14)的前端向外形成凸起，所述凹陷和所述凸起通过卡接连接。

8.根据权利要求5所述的一种用于茄子黄萎病的无底钵伤根接种装置，其特征在于，所述第一侧板(11)、所述第二侧板(12)、所述底板(15)、所述多个第一连接翼(13)和所述多个第二连接翼(14)一体成型，所述第一侧板(11)和所述第二侧板(12)上还设置有多个凹槽(17)。

9.根据权利要求5所述的一种用于茄子黄萎病的无底钵伤根接种装置，其特征在于，所述营养钵支架(2)包括底板(21)和四块围板(22)，所述围板(22)与所述底板(21)可旋转的连接，相邻的围板通过卡扣固定连接。

10.根据权利要求1-4任一所述的利用无底钵伤根接种法进行茄子黄萎病苗期抗性鉴定的方法在茄子黄萎病致病力分化研究中的应用。