CN108715860A - 一种食管上皮组织p53特异性敲除小鼠食管癌前病变模型的构建方法 - Google Patents
一种食管上皮组织p53特异性敲除小鼠食管癌前病变模型的构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明具体涉及食管上皮组织p53特异性敲除小鼠癌前病变模型的构建方法，1）将B6.p53flox/flox的小鼠与ED‑L2－Cre+/‑的小鼠多代杂交、经过小鼠基因型的鉴定、筛选得到p53敲除小鼠，所述p53敲除小鼠基因型为B6.p53flox/flox.ED‑L2－Cre+/‑；2）使用化学诱癌剂诱导p53敲除小鼠，形成p53敲除小鼠食管上皮组织特异性癌变模型。利用此方法成功构建出小鼠食管癌前病变模型。
Description
技术领域
本发明属于动物模型构建方法技术领域，具体涉及一种食管上皮组织p53特异性敲除小鼠食管癌前病变模型的构建方法。
背景技术
甲基苄基亚硝胺是一种不对称性亚硝胺，是DNA的烷化剂，可在类似细胞色素P450氧化酶作用下分解代谢为苯甲醛和甲烷重氮氢氧化物，进而造成DNA加成物06-甲基鸟嘌呤形成，从而在DNA复制过程中与胸腺嘧啶发生错配，导致DNA由G：C配对变换成A:T配对，造成遗传物质损伤；此外06-甲基鸟嘌呤可与DNA序列中相对胞嘧啶残基发生交联，进而阻止DNA进行复制。有研究表明，NMBzA代谢所需酶类特异性地存在于食管上皮细胞中，因此，NMBzA诱导肿瘤发生多具有食管组织亲和性和特异性，且一般在其他器官组织中不会形成肿瘤。目前，国内外不少学者利用NMBzA成功诱导出大鼠的食管鳞状细胞癌模型，但是目前用NMBzA诱发小鼠食管鳞癌模型的研究鲜有报道。虽然单用NMBzA可诱导大鼠发生食管癌，但模型与人食管癌发生过程贴合性差点，无法建成p53敲除的大鼠，构建转基因模型较难；此外，大鼠成本高，不易饲养，因此我们需要针对于遗传背景为食管上皮组织中p53基因敲除小鼠构建食管癌变模型，其造模方式更贴近人食管癌的自然发生过程。
p53基因，即人体重要的抑癌基因，因在体内主要监测DNA损伤，素有“基因卫士”之称。该基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质，故命名为P53。在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变失活。当DNA因体内外不良刺激作用发生损伤后，p53可以通过阻滞细胞周期，为DNA争取修复时间，同时转录调节DNA修复相关的酶并参与修复过程，进而对DNA进行修复，从而维持基因组稳定性和完整性。若DNA损伤严重，无法进行修复，p53则会启动凋亡机制，把机体DNA损伤的细胞从组织内永久地清除，以防损伤的遗传物质遗传给下一代，造成损伤累积进而使这类细胞增殖恶化，导致肿瘤的发生。通过p53的敲除能够建立一种组织癌变的模型，但是这种癌变模型为通用癌变模型，并不能有针对性的对特定组织进行癌变过程以及癌变后治疗的研究。目前，针对于食管上皮组织的特异性癌变在现有报道中没有涉及。
肿瘤的发生是一个涉及到多基因变异、多通道调节、多因素相互作用的复杂生物学过程，食管癌的发生也是如此。将遗传变异与环境因素结合起来的复合造模成为当今应用广泛、效果最好的建立小鼠食管癌模型的方法。此方法更贴近食管鳞癌的自然发生过程，能更好的探索多种诱癌因素的交互作用。因此，构建一种食管上皮组织的特异性癌变模型是十分重要的。
发明内容
本发明提供了一种食管上皮组织p53特异性敲除小鼠癌前病变模型的构建方法，此模型的建立可为食管癌发生机制的研究及筛选肿瘤化学预防药物提供一个有力的工具。
本发明采取的详细技术方案如下：
一种食管上皮组织p53特异性敲除小鼠癌前病变模型的构建方法，方法如下：
1）将B6.p53flox/flox的小鼠与ED-L2-Cre+/-的小鼠杂交，经基因型的鉴定，筛选得到p53敲除小鼠，所述p53敲除小鼠基因型为B6.p53flox/flox.ED-L2-Cre+/-；
2）使用化学诱癌剂诱导p53敲除小鼠，形成p53敲除小鼠食管上皮组织特异性癌变模型。
进一步地，所述杂交的方式为两代杂交的方式，具体如下：
p53floxed小鼠中基因型为B6.p53flox/flox的小鼠与ED-L2-Cre小鼠中基因型为ED-L2-Cre+/-的小鼠作为F0代；将基因型为B6.p53flox/flox与ED-L2-Cre+/-的小鼠相互杂交，产生后代F1，F1代的基因型为B6.p53flox/wild.ED-L2-Cre+/-以及B6.p53flox/wild.ED-L2-Cre-/-；筛选F1代中基因型为B6.p53flox/wild.ED-L2-Cre+/-的雄性小鼠和雌性小鼠进行杂交配对得到后代F2，从F2代小鼠中筛选B6.p53flox/flox.ED-L2-Cre+/-的小鼠为食管上皮组织p53特异性敲除小鼠。
进一步地，其特征在于，所述F2代小鼠长至6-7周时按照基因型分组，不同组别小鼠进行相互杂交。
进一步地，所述筛选的方式如下：
剪取小鼠尾巴0.5-1cm，裂组织并提取DNA，经PCR鉴定DNA的基因型。
进一步地，所述化学诱癌剂诱导食管上皮组织p53特异性敲除小鼠的方式为：
对食管上皮组织p53特异性敲除小鼠皮下注射化学诱癌剂，连续给药五周，每周三次。
进一步地，所述化学诱癌剂为甲基苄基亚硝胺；所述甲基苄基亚硝胺浓度为0.1mg/ml，注射量为0.1mL/10g小鼠体重。
本发明有益效果：
本发明构建方法构建了食管上皮组织p53特异性敲除小鼠癌前病变模型，所述模型能够使化学诱癌剂诱导癌症时特异性发生于小鼠食管部位，一方面保证了小鼠诱发癌变时其他器官的健康状况，另一方面能够保证使用本发明所述方法构建模型在后期研究过程中的专用性。
本发明构建方法构建的小鼠可以从注射药物后16周是开始轻度病变，48周时出现重度病变并开始作为模型使用一直至2年，所述模型构建的小鼠存活周期长，方便研究人员使用。
本发明所述方法构建的模型能够应用于体内研究p53在食管癌的发生发展过程的作用及食管癌前病变的分子生物学机制，此模型也为寻找预防、治疗食管癌的药物、方法提供了有力的筛选工具。
附图说明
图1为NMBzA p53未敲除组和NMBzA p53敲除组小鼠整个实验过程中体重监测的统计结果；
图2为48周时小鼠食管黏膜病变分级图（比例尺=100μm），其中A为正常食管，B为单纯性增生食管，C为轻度不典型增生食管，D为中度不典型增生食管，E为重度不典型增生食管；
图3为48周NMBzA p53未敲除组和NMBzA p53敲除组小鼠食管黏膜各级病变的统计结果；
图4为48周NMBzA p53未敲除组和NMBzA p53敲除组小鼠食管黏膜病变的统计结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是下列实施例仅用于说明本发明，而不应该为限制本发明的范围。
主要试剂：
甲基苄基亚硝胺NMBzA，购自中国科技大学；
鼠尾组织裂解液TNES lysis buffer（1M Tris-HCL PH8.5、0.5M EDTA PH8.0、10%SDS、5M NaCl ddWater），各成分均购买自北京索莱宝（Solarbio)科技有限公司；蛋白酶K购自德国MERCK公司。
PCR所用试剂名称以及购买厂家：
2×Taq mix、ddH2O及均购自100bp DNA ladder北京博迈德生物技术有限公司；
主要仪器：
普通PCR仪：购自德国SensoQuest 公司，型号：LabCycler；
光学显微镜：购自日本Olympus公司，型号：BX51；
生物材料：
p53flox/flox小鼠引种于美国Jackson实验室，小鼠遗传背景为C57BL/6J；ED-L2-Cre转基因小鼠引种于美国NCI（National Cancer Institude）小鼠库，均为近交系。
p53flox/flox引物、L2-Cre酶引物、内参基因引物：由北京金唯智生物科技有限公司合成。
实施例1
构建p53敲除小鼠食管上皮组织特异性癌变模型的步骤说明如下：
一、杂交配对
1、筛选F0代小鼠p53纯合子小鼠、Cre阳性小鼠；
ED-L2-Cre小鼠是杂合阳性的，在繁育过程中会出现阴性小鼠，所以需筛选阳性小鼠，即ED-L2-Cre+/-的小鼠用于实验；而引种的p53floxed小鼠也是杂合阳性（p53flox/flox和p53flox/wild)的，需要前期的鉴定筛选，选出基因型为B6.p53flox/flox的小鼠用于实验，因此ED-L2-Cre+/-的小鼠和B6.p53flox/flox的小鼠为F0代小鼠。
2、F0代小鼠杂交得到F1代小鼠
将B6.p53flox/flox的雌性/雄性小鼠与ED-L2-Cre+/-的雄性/雌性小鼠合笼配对相互杂交；待F1代小鼠断乳后（出生21天左右），鼠崽雄雌分笼，打耳标并剪下小鼠尾巴0.5-1cm、裂解组织并提取DNA、经PCR鉴定F1代小鼠DNA的基因型。
其中，裂解组织并提取DNA的方法（即蛋白酶K裂解方法）如下：
1）在超净工作台内，将F1代小鼠尾巴装入的1.5EP管中并加入180μl TNES lysisbuffer（1M Tris-HCL PH8.5、0.5M EDTA PH8.0、10% SDS、5M NaCl ddWater）和20μlProteinase K(20mg/ml)，涡旋混匀，瞬时离心，55℃水浴过夜（至少16h）得到分散液。
2）将步骤1）中所得分散液在80℃下水浴20min用以灭活Proteinase K。将EP管取出，放置实验台面上，冷却至室温。在4℃，15000g离心5min，吸取上清液，与TE缓冲液按1:9比例进行稀释，即得到基因组DNA的稀释液，4℃保存备用。
其中，PCR鉴定的方法如下：
1）PCR反应体系配置
①Loxp位点反应体系
p53flox/flox引物：
其正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，5′-CAC AAA AAC AGG TTA AACCCAG-3′；
其反向引物序列如SEQ ID NO.2所示，5′-AGC ACA TAG GAG GCA GAG AC-3′
将于p53flox/flox引物粉末12000-15000rpm离心5min后，小心加入管身对应体积数的TE缓冲液至浓度为100μM，室温静置2分钟并涡旋震荡混匀，瞬时离心。保存于-20℃。使用前将引物稀释成10μM。
将上述10μM的引物按照表1所列加入量混合形成Loxp位点的反应体系。
表1 Loxp位点反应体系组成
②Cre基因反应体系
L2-Cre酶引物：
其正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，5′-ACC AGC CAG CTA TCA ACT-3′
其反向引物序列如SEQ ID NO.4所示，5′-TTA CAT TGG TCC AGC CAC C-3′
内参基因引物（Mus musculus interleukin 2（IL-2））：
其正向引物序列如SEQ ID NO.5所示，5′-CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT-3′
其反向引物序列如SEQ ID NO.6所示，5′-GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C-3′
将L2-Cre酶引物粉末12000-15000rpm离心5min后，小心加入管身对应体积数的TE缓冲液至浓度为100μM，室温静置2分钟并涡旋震荡混匀，瞬时离心。保存于-20℃。使用前将引物稀释成10μM。
将上述10μM的引物按照表2所列加入量混合形成Cre基因的反应体系。
表2 Cre基因的反应体系组成
2）PCR反应
在200μl的EP管中，按照以上反应体系依次加入以上试剂，所用试剂以及引物在使用前应涡旋混匀，瞬时离心，使用过程中均在冰上进行操作，待所有试剂添加完毕后涡旋混匀，于掌上离心机瞬离，上机。若检测标本量较多，可将所需试剂量多加0.5倍，同一配制于一个EP管内，再进行分装，最后逐一加入cDNA。每次进行PCR鉴定均加上阳性对照和阴性对照及空白对照，用于检测每次实验结果的可靠性。
设置PCR反应条件如下：
3）1.5%琼脂糖凝胶电泳
①使用电子分析天平称取1.05g琼脂糖粉于锥形烧瓶中，量筒量取70 ml 1×TAE电泳缓冲液倒入烧瓶中，放于红外加热炉上加热，间隔煮沸3次，直至溶液变得澄清透亮为止，取下烧瓶，放置实验台上，自然冷却，当温度降至50℃（不烫手心）左右加入12μlGoldView核酸染料，轻晃摇匀并倒入已放置好梳子的制胶板中，等待冷却凝固，备用。
②自PCR仪中取出扩增完成的PCR产物于冰上，将制备好的胶放入电泳槽中，加入适量（没过胶1-2cm）的电泳缓冲液，按照顺序，使用上样枪依次在孔中加入5μl的Marker和10μl样品。
③设置电泳电压90V-110V，时间35-40 min，点击开始跑胶，期间可用手提紫外灯进行监测，以免跑过。待程序结束后使用凝胶成像仪分析系统对结果进行图像采集并分析，即可得鉴定结果。
F1代小鼠的基因型为B6.p53flox/wild.ED-L2-Cre+/-以及B6.p53flox/wild.ED-L2-Cre-/-，筛选出基因型为B6.p53flox/wild.ED-L2－Cre+/-的小鼠待用。
3、F1代小鼠杂交配对的到F2代小鼠
待F1代小鼠长至7周时，将B6.p53flox/wild.ED-L2－Cre+/-的雄性小鼠和雌性小鼠进行杂交配对，得到的后代为F2，并对F2代小鼠进行鼠尾的基因型进行PCR鉴定；从中筛选出基因型为B6.p53flox/flox.ED-L2-Cre+/-的小鼠为p53敲除小鼠（即p53-KO小鼠），同窝基因型为B6.p53flox/flox.ED-L2-Cre-/-的p53 loxp小鼠为p53未敲除小鼠（即p53-loxp小鼠）。
其中，鉴定、筛选F2代小鼠基因型的方法步骤同步骤2中F1代小鼠鉴定筛选的方法。
二、化学诱导
待p53-KO小鼠长至6-7周，按照窝别、基因型进行分组，并对p53-KO小鼠皮下注射甲基苄基亚硝胺(NMBzA，1mg/kg，配制溶液为0.1mg/ml)，注射量根据小鼠重量而定，每10g注射0.1ml，每周3次（每周二、周四、周六各注射一次），连续给药5周，随后常规观察喂养。从给小鼠注射甲基苄基亚硝胺开始记为第一周。样品组别记为NMBzA p53未敲除组。
实施例2
构建p53敲除小鼠食管上皮组织特异性癌变模型的步骤说明如下：
一、杂交配对
1、筛选F0代小鼠p53纯合子小鼠、Cre阳性小鼠；
从ED-L2-Cre小鼠和p53floxed小鼠鉴定筛选，选出基因型为ED-L2-Cre+/-的小鼠和B6.p53flox/flox的小鼠为F0代小鼠。
2、F0代小鼠杂交得到F1代小鼠
将B6.p53flox/flox的雌性/雄性小鼠与ED-L2-Cre+/-的雄性/雌性小鼠合笼配对杂交；待F1代小鼠断乳后（出生21天左右），鼠崽雄雌分笼，打耳标并剪下小鼠尾巴0.5-1cm、裂解组织并提取DNA、经PCR鉴定F1代小鼠DNA的基因型，裂解组织并提取DNA、PCR鉴定方法同实施例1。
3、F1代小鼠杂交配对获得F2代小鼠
待F1代小鼠长至7周时，将B6.p53flox/wild.ED-L2-Cre+/-的雄性小鼠和雌性小鼠进行杂交配对，得到的后代为F2，并对F2代小鼠进行鼠尾的基因型进行PCR鉴定；从中筛选出基因型为B6.p53flox/flox.ED-L2-Cre+/-的小鼠为p53敲除小鼠（即p53-KO小鼠），同窝基因型为B6.p53flox/flox.ED-L2-Cre-/-的p53 loxp小鼠为p53未敲除小鼠（即p53-loxp小鼠）。
其中，鉴定、筛选F2代小鼠基因型的方法步骤同步骤2中F1代小鼠鉴定筛选的方法。F1代小鼠的基因型为B6.p53flox/wild.ED-L2-Cre+/-以及B6.p53flox/wild.ED-L2-Cre-/-，筛选出基因型为B6.p53flox/wild.ED-L2－Cre+/-的小鼠待用。
4、F2代小鼠扩增
待F2代小鼠喂养至6-7周龄时按基因型、窝别进行分组。将基因型为B6.p53flox/flox.ED-L2-Cre+/-小鼠进行自交扩大繁殖，从而得到遗传稳定的p53敲除小鼠。
在扩大繁殖的同时，为了有效地预防小鼠生长、成活、生育、抗病等机能的减退，将第三代基因型为B6.p53flox/flox.ED-L2-Cre+/-的小鼠与第二代基因型为B6.p53flox/flox.ED-L2-Cre+/-的不同组别的小鼠进行回交。
二、化学诱导
待p53-KO小鼠长至6-7周，并对p53-KO小鼠皮下注射甲基苄基亚硝胺(NMBzA，1mg/kg，配制溶液为0.1mg/ml)，注射量根据小鼠重量而定，每10g注射0.1ml/10g，每周3次（每周二、周四、周六各注射一次），连续给药5周，随后常规观察喂养。从给小鼠注射甲基苄基亚硝胺开始记为第一周。
对照组
待实施例1中所述p53-loxp小鼠长至6周，按照性别、窝别、基因型进行分组，并对p53-KO小鼠皮下注射甲基苄基亚硝胺(NMBzA，1mg/kg，配制溶液为0.1mg/ml)，注射量根据小鼠重量而定，每10g注射0.1ml/10g，每周3次，连续给药5周，随后常规观察喂养。从给小鼠注射甲基苄基亚硝胺开始记为第一周。样品组别计为NMBzA p53未敲除组。
检测实施例1和对照组小鼠的癌变情况：
一、观察实施例1的 p53-KO小鼠和对照组p53-loxp小鼠注射甲基苄基亚硝胺后1-48周的全身情况如活动度、进食、饮水量及粪便情况，小鼠的体重每两天进行一次称重。小鼠的体重如图1所示，两组小鼠体重均呈平稳增长，且两组无差异变化。
二、取材并进行病理学检查
饲养实施例1 NMBzA p53敲除组和对照组NMBzA p53未敲除组至48周时，颈椎脱臼法处死小鼠，立即解剖，于左侧腹腔找到胃，从小鼠胃与食管相连处沿着食管向上直至咽喉部，用无菌的镊子及眼科剪小心剥离食管周围相连的结缔组织。取小鼠胃至咽的全长食管放置于消毒后的滤纸上，沿其纵轴剪开后平铺，观察小鼠食管粘膜的病变情况，另取小鼠的舌、胃等其他内脏组织并进行详细的检查，然后将食管、舌和胃组织放入装有40%的中性甲醛（福尔马林）的2ml离心管中固定24h后，常规石蜡包埋，4μm切片，HE染色。HE染色步骤为常规操作，在此不做赘述。
经检查，NMBzA p53敲除组小鼠的其他内脏组织未发现肉眼可见的病变，舌、胃组织的HE染色也未观察到病变，病变只发生于小鼠食管。
在光学显微镜下观察实施例1和对照组小鼠食管的病理改变情况，并记录其异常和病变程度以及病变数目。结果如图1-4以及表3所示，
48周时NMBzA p53敲除组食管正常部位、单纯性增生以及食管轻度不典型增生、食管中度不典型增生、以及食管重度不典型增生部位的HE染色图如图2所示：正常食管食管鳞状上皮细胞有序排列，上皮层薄厚均匀，核呈圆形或椭圆形，基底细胞层规整；单纯食管增生的食管上皮轻度增厚，基底细胞略有增多稍紊乱，且仅局限于上皮下1/3；轻度不典型增生的食管上皮细胞排列轻度紊乱，基底细胞增多，发生极性改变的细胞累及上皮层的1/3；中度不典型增生的食管上皮增厚明显，基底细胞明显增多，角化层增厚，异型细胞累及上皮全层的2/3；重度不典型增生的上皮细胞极性发生明显的变化，基底细胞排列排列较紊乱，细胞大小不一，形态各异，且向基底部突出，角化层明显增多增厚，异型细胞累及上皮全层，即2/3以上。
48周时NMBzA p53敲除组和NMBzA p53未敲除组食管病变个数统计如图3和表3所示，相比于NMBzA p53未敲除组，NMBzA p53敲除组小鼠食管粘膜层病变个数明显增加，且程度明显较严重（出现对照组未有的中度和重度的不典型增生），NMBzA p53未敲除组（n=13）和NMBzA p53敲除组（n=14）食管上皮组织病变个数分别为：单纯性增生：8.62±6.17、13.43±7.90；轻度不典型增生：1.07±1.93、6.64±5.87；中度不典型增生：0、1.57±4.57；重度不典型增生：0、0.71±1.86；将48w时的两组小鼠食管上皮总病变进行比较分析，结果提示两组之间病变有明显差异，且具有统计学意义（p<0.05)(如图4所示)。这些结果提示已成功建立NMBzA诱导p53-KO小鼠癌变模型。
尽管以用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其他的更改和修改，因此，这意味着在所述权利要求中包括本发明范围的所有变化和修改均属于本发明保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学
<120> 一种食管上皮组织p53特异性敲除小鼠食管癌前病变模型的构建方法
<130> none
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列正
<400> 1
cacaaaaaca ggttaaaccc ag 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agcacatagg aggcagagac 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
accagccagc tatcaact 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttacattggt ccagccacc 19
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctaggccaca gaattgaaag atct 24
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtaggtggaa attctagcat catcc 25
Claims (7)
1.一种食管上皮组织p53特异性敲除小鼠食管癌前病变模型的构建方法，其特征在于，所述步骤如下：
1）将B6.p53floxed的小鼠与ED-L2－Cre的小鼠杂交，经基因型的鉴定，筛选得到p53敲除小鼠，所述p53敲除小鼠基因型为B6.p53flox/flox.ED-L2-Cre+/-；
2）使用化学诱癌剂诱导p53敲除小鼠，形成p53敲除小鼠食管上皮组织特异性癌变模型。
2.如权利要求1所述食管上皮组织p53特异性敲除小鼠癌前病变模型的构建方法，其特征在于，所述杂交采用两代杂交的方式，具体如下：
p53floxed小鼠中基因型为B6.p53flox/flox的小鼠与ED-L2-Cre小鼠中基因型为ED-L2－Cre+/-的小鼠作为F0代；将基因型为B6.p53flox/flox与ED-L2－Cre+/-的小鼠相互杂交，产生后代F1；筛选F1代中基因型为B6.p53flox/wild.ED-L2-Cre+/-的雄性小鼠和雌性小鼠进行杂交配对得到后代F2，从F2代小鼠中筛选B6.p53flox/flox.ED-L2-Cre+/-的小鼠为食管上皮组织p53特异性敲除小鼠。
3.如权利要求2所述食管上皮组织p53特异性敲除小鼠食管癌前病变模型的构建方法，其特征在于，所述F2代小鼠长至6-7周时按照基因型分组，不同组别小鼠进行相互杂交。
4.如权利要求1所述食管上皮组织p53特异性敲除小鼠食管癌前病变模型的构建方法，其特征在于，所述鉴定、筛选小鼠的基因型的方式如下：
剪取小鼠尾尖0.5-1cm，裂组织并提取DNA，经PCR鉴定小鼠的基因型，并对鉴定的基因型进行筛选。
5.如权利要求1所述食管上皮组织p53特异性敲除小鼠食管癌前病变模型的构建方法，其特征在于，所述化学诱癌剂诱导p53敲除小鼠的方式为：
对食管上皮组织p53特异性敲除小鼠皮下注射化学诱癌剂连续给药4-5周，每周3-4次。
6.如权利要求5所述食管上皮组织p53特异性敲除小鼠食管癌前病变模型的构建方法，其特征在于，所述化学诱癌剂为甲基苄基亚硝胺；所述甲基苄基亚硝胺浓度为0.1mg/ml，注射量为0.1mL/10g小鼠体重。
7.如权利要求1-6任一所述食管上皮组织p53特异性敲除小鼠食管癌前病变模型在研究食管癌发病机制、筛选化学预防药物方面的应用。
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